國標(biāo)法和新型試劑盒法測定維B12 含量的方法比較

蔡曉霞，吳家碧，陳葉蘭，李詩華，陳紫媚，盧靖怡，蘆 平，謝黔蘭

（湯臣倍健股份有限公司，廣東珠海 519040）

0 引言

維B12也叫鈷胺素，是指一類具有含三價金屬鈷鍵的多環(huán)系物質(zhì)，4 個被還原后的呋咯環(huán)連接在一起可轉(zhuǎn)變而成的1 個咕啉大環(huán)系（與卟啉相似）化合物，為自然界唯一的含有鈷金屬單質(zhì)子的維生素，也是人類目前所知的分子量最大、系統(tǒng)最復(fù)雜的維生素分子，按其溶解性分為水溶性和脂溶性維生素[1]。維B12對于人體來說非常的重要，這種元素可以幫助人體維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)，也會影響到細(xì)胞間質(zhì)的功能和神經(jīng)膠質(zhì)，以及細(xì)胞髓磷脂的人體含量。另外，維B12在部分臨床疾病的治療上發(fā)揮著重要作用，可參與制造骨髓紅細(xì)胞，防止惡性貧血，防止大腦神經(jīng)受到破壞等，而缺乏維B12則可能導(dǎo)致惡性貧血、精神抑郁、血管性癡呆及阿爾茨海默病等疾病[2]。因此，適量補(bǔ)充維B12，對于維持人體的健康來說非常重要，但是維B12的攝入量也不是越多越好。有研究表明，服用過量的維B12，可能導(dǎo)致面部浮腫、腹痛泄瀉、低血鉀癥等。因此，對于嬰幼兒配方乳品和營養(yǎng)補(bǔ)充食品中維B12的含量檢測準(zhǔn)確性要求越來越高。

目前，食品中維B12的檢測方法越來越豐富[3]，包括微生物法[4-6]、試劑盒法[7-9]、高效液相色譜法[10-12]、化學(xué)發(fā)光法[13]、酶聯(lián)免疫法[14]等。其中，微生物法具有檢測靈敏度較高、檢出限低等顯著優(yōu)點，是目前美國、中國等許多國家采用的一種官方微生物分析方法。我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.14—2010、美國政府機(jī)構(gòu)的實驗室、FDA 和AOAC 均采用該方法[2]。

維B12試劑盒檢測方法為《GB 5413.14—2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維B12的測定》的簡化方法，具有簡單、高效、準(zhǔn)確度高及穩(wěn)定性好的優(yōu)點，主要適用于檢測外添加的營養(yǎng)膳食補(bǔ)充劑的維B12含量。采用國標(biāo)法和新型試劑盒法測定嬰兒配方乳粉定量分析質(zhì)控樣品中維B12的含量，通過方法的專屬性、線性、精密度和回收率對比2 種檢測方法結(jié)果的差異，為實驗室在乳粉類樣品中維B12含量的檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和樣品

標(biāo)準(zhǔn)菌株：萊氏曼氏乳桿菌，ATCC 7830，來源于廣東微生物菌種保藏中心。

質(zhì)控樣品：嬰兒配方乳粉中維B12定量分析質(zhì)控樣品（維B12特性值5.09 μg/100 g，滿意范圍為4.16～6.02 μg/100 g），購自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心，貨號QC-IP-741。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和培養(yǎng)基

維B12標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥91.3%，中國食品藥品檢定研究院提供；培養(yǎng)基：乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司提供；維B12測定培養(yǎng)基，美國BD 公司提供。

1.1.3 試劑盒

維B12檢測試劑盒，批號RS12.170424，深圳市瑞賽生物技術(shù)有限公司提供；其組成為維B12凍干菌、維B12凍干標(biāo)品、維B12測定培養(yǎng)基、無菌水、96 孔微孔板，封板膜等。

1.1.4 儀器與設(shè)備

AL-204 型分析天平，梅特勒-托利多科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；BXM-30R 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；UV-2600型紫外-可見分光光度計，島津公司產(chǎn)品；BSC-1600-Ⅱ-A2 型生物安全柜，蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SPX-250BSH-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；1～5 mL 移液槍（編號：19E62016）、100～1 000 μL移液槍（編號：16G12712），上海安譜實驗科技股份有限公司產(chǎn)品；TGL-10C 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；HH-8 型水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司產(chǎn)品；MULTISKAN FC 型酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

（1）國標(biāo)法。參考GB 5413.14—2010，配制維B12標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，按照標(biāo)準(zhǔn)系列管制備方法，配制0～0.440 0 ng 范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)系列管，每個梯度做3 個平行。以標(biāo)準(zhǔn)系列管維B12含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制國標(biāo)法維B12標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）試劑盒法。取出1 包試劑盒提供的維B12凍干標(biāo)準(zhǔn)品（2 板共16 孔），加入適量無菌水后，按照說明書，配制0.00，0.025，0.050，0.100，0.160，0.360 μg/100 g 系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個質(zhì)量濃度做2 個平行，培養(yǎng)后進(jìn)行測定，以維B12標(biāo)準(zhǔn)管質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制維B12檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法定量限為0.025 0 μg/100 g。

1.2.2 樣品處理及測定

選取定量標(biāo)準(zhǔn)乳粉質(zhì)控樣品，按照GB 5413.14—2010 和試劑盒說明書對樣品進(jìn)行相應(yīng)處理，并進(jìn)一步稀釋，加樣并接種菌液后于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，國標(biāo)法采用紫外分光光度計測定吸光度，試劑盒法采用酶標(biāo)儀測定吸光度。

2 測試指標(biāo)

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

根據(jù)測定結(jié)果擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線考查曲線的線性。

2.2 方法專屬性

通過測定試驗中培養(yǎng)基的本底值，以此判斷培養(yǎng)基的本底對試驗帶來的影響，從而確定方法的專屬性是否良好。國標(biāo)方法中，以S0調(diào)零，S0+菌的OD值作為測定的培養(yǎng)基本底值；試劑盒方法中，以標(biāo)準(zhǔn)曲線中S1（即為空白點）的OD 值作為測定的培養(yǎng)基本底值。

2.3 精密度試驗

分別取6 份乳粉質(zhì)控樣品，按照國標(biāo)方法和試劑盒說明書進(jìn)行樣品處理，并進(jìn)行適當(dāng)稀釋，加樣并接種菌液后于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，國標(biāo)法采用紫外分光光度計測定結(jié)果，試劑盒法采用酶標(biāo)儀測定結(jié)果。

2.4 準(zhǔn)確性試驗

分別取9 份乳粉質(zhì)控樣品，分成低、中、高3 組（每組3 份），并且分別加入50%，100%，150%維B12含量的標(biāo)液，按照國標(biāo)方法和試劑盒說明書進(jìn)行樣品處理，并進(jìn)行適當(dāng)稀釋，加樣并接種菌液后于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，國標(biāo)法采用紫外分光光度計測定結(jié)果，試劑盒法采用酶標(biāo)儀測定結(jié)果，通過測定加標(biāo)試驗中維B12含量，計算回收率。

2.5 穩(wěn)定性試驗

選用乳粉質(zhì)控樣品進(jìn)行穩(wěn)定性試驗，測試同一批樣液在不同時間段的穩(wěn)定性，即將樣品提取液在4 ℃冰箱中貯存0，3，6，9，12，24，48 h 后，分別測試放置不同時間段的提取液中維B12的含量，比較測試結(jié)果之間的差異。

3 2 種方法的數(shù)據(jù)對比與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性

國標(biāo)法采用Labslution 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，維B12質(zhì)量濃度為0.044 0～0.440 0 ng/mL。

國標(biāo)法維B12標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

試劑盒法采用試劑盒提供的軟件Elisa 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，維B12含量為0.025～0.360 μg/100 g。

試劑盒法維B12標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 試劑盒法維B12 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，國標(biāo)法維B12標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=16.070 0X3-16.410 1X2+6.577 59X-0.047 675 3，R2=0.996 44，相關(guān)系數(shù)R=0.998 21＞0.99，即在含量為0.044 0～0.440 0 ng 范圍內(nèi)，曲線線性關(guān)系良好。

由圖2 可知，試劑盒法維B12標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=（0.973 28-0.054 24）/[1+（X/0.168 40）-1.714 77]+0.054 24，R2=0.999 05，相關(guān)系數(shù)R=0.999 52＞0.99，即在含量為0.025～0.360 ng 范圍內(nèi)，曲線線性關(guān)系良好，該方法定量限為0.025 0 μg/100 g。

3.2 方法專屬性

國標(biāo)方法中，以S0調(diào)零，測定S0+菌的OD 值3 次；試劑盒方法中，測定S1的OD 值10 次。

空白管試驗結(jié)果見表1。

表1 空白管試驗結(jié)果

由表1 可知，2 種方法的空白管OD 值都＜0.1，但該OD 值對標(biāo)液和樣液的測定結(jié)果有一定的影響，因此，每次測定國標(biāo)法時都以該標(biāo)液空白管調(diào)零，然后再進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣液的紫外吸光度測定；采用試劑盒方法進(jìn)行測定及結(jié)果計算時，每次都需將標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣液的OD 值扣除空白管的OD 值后進(jìn)行計算。

3.3 精密度試驗

分別取6 份樣品，按照國標(biāo)方法和試劑盒說明書進(jìn)行樣品處理，并進(jìn)行適當(dāng)稀釋，加樣并接種菌液后于37 ℃下培養(yǎng)24 h 后測定吸光度。

精密度試驗結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果

由表2 可知，傳統(tǒng)國標(biāo)法測定質(zhì)控樣品的精密度試驗結(jié)果為5.18 μg/100 g，試劑盒法測定質(zhì)控樣品的精密度試驗結(jié)果為5.06 μg/100 g，精密度均符合《GB/T 27404—2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求（精密度要求≤7.5%）；2 種方法測定結(jié)果的偏差為1.8%＜15%，對2 種方法的6 次測定結(jié)果的平均值采用F 檢驗（95%的置信度），F(xiàn)0.05（5，5）=1.02＜F 表（5.05），說明2 種方法的測定結(jié)果無明顯差異，表明2 種方法的精密度及重復(fù)性良好。

3.4 準(zhǔn)確性試驗

分別取9 份乳粉質(zhì)控樣品，分成低、中、高3 組（每組3 份），并且分別加入50%，100%，150%維B12含量的標(biāo)液，按照國標(biāo)方法和試劑盒說明書進(jìn)行樣品處理，并進(jìn)行適當(dāng)稀釋，加樣并接種菌液后于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，國標(biāo)法采用紫外分光光度計測定結(jié)果，試劑盒法采用酶標(biāo)儀測定結(jié)果，通過測定加標(biāo)試驗中維B12含量，計算回收率。

回收率試驗結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果

由表3 可知，國標(biāo)法和試劑盒法測定乳粉質(zhì)控樣品的回收率分別為97.3%和113.6%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》 的要求“GB/T 27404—2008 要求回收率為90%～120%”，2 種方法測得的回收率偏差為7.7%，偏差＜10%，表明2 種方法的準(zhǔn)確度較高。

3.5 穩(wěn)定性試驗

分別采用國標(biāo)方法和試劑盒法對質(zhì)控樣品和健樂多乳清蛋白粉進(jìn)行穩(wěn)定性試驗，測試同一批樣品提取液在4 ℃冰箱貯存0，3，6，9，12，24，48 h后樣品的維B12含量。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表4 可知，國標(biāo)法和試劑盒法測定乳粉質(zhì)控樣品提取液放置0～48 h 后的維B12含量平均值分別為5.25 μg/100 g 和5.15 μg/100 g，2 種方法的RSD值分別為2.0%和2.8%，均小于5%，說明樣品提取液于4 ℃冰箱中儲存48 h 后，樣液中維B12的含量穩(wěn)定，2 種方法的穩(wěn)定性良好。

4 討論

試驗采用GB 5413.14—2010[15]和維B12檢測試劑盒測定嬰兒配方乳粉中維B12定量分析質(zhì)控樣品中維B12的含量，2 種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，曲線擬合度較好，培養(yǎng)基本底值較低，方法專屬性良好；定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品檢測的結(jié)果均在滿意范圍內(nèi)且接近特性值，結(jié)果準(zhǔn)確；2 種方法的精密度均符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》[16]的要求，且精密度較高、重復(fù)性較好；2 種方法的回收率均符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》 的要求，且2 種方法的回收率偏差均小于10%；2 種方法的穩(wěn)定性試驗結(jié)果RSD 均小于5%，方法穩(wěn)定性良好。

國標(biāo)方法檢測維B12的過程較為復(fù)雜繁瑣，包括了菌株活化、傳代、保藏和接種液的制備等，要嚴(yán)格控制菌株的活化、培養(yǎng)過程，保證菌株對維B12的特異性，這對實驗室檢測人員的技術(shù)操作水平提出了較高的要求；其次，采用國標(biāo)法檢測維B12含量時，需要選擇合適的測定培養(yǎng)基，尤其需要關(guān)注培養(yǎng)基的本底值。本底值低，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度高，線性良好是獲得準(zhǔn)確檢測結(jié)果的前提；最后，采用國標(biāo)法檢測維B12含量時，還需要關(guān)注到所用玻璃器皿的潔凈度。少量的外源物質(zhì)可能導(dǎo)致試驗的失敗。因此，需要使用活性劑對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗，清洗之后要在180 ℃以上干熱滅菌2 h 以上，從而確保去除殘留的微量生長因子。

試劑盒方法是基于國標(biāo)方法研制的一種快速檢測方法。與國標(biāo)方法相比，試劑盒方法有較為明顯的優(yōu)勢，首先，采用試劑盒方法進(jìn)行樣品中維B12的含量測定時，前處理使用試劑盒提供的提取液進(jìn)行水浴提取，操作步驟簡便，無需調(diào)pH 值，操作誤差小，且樣品處理時間短；其次，試劑盒方法采用的是即用型凍干菌粉，節(jié)省了每次轉(zhuǎn)接菌株及制備菌懸液的步驟，保證每次試驗各微孔中菌液量及活性一致[17]；另外，試劑盒方法采用的是即用型凍干標(biāo)準(zhǔn)品，即將標(biāo)準(zhǔn)品按梯度固定的量以凍干粉的形態(tài)儲存于微孔板中，試驗時只需要將無菌水加入到每個微孔中進(jìn)行吹打溶解即可，節(jié)省了每次配制標(biāo)液的步驟，操作誤差小，操作過程方便快捷。

另外，試劑盒方法主要用酶標(biāo)儀進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣液的OD 值測定。1 次可測定96 個微孔的OD值，整個測定過程只需要3～5 min，非常簡便、快捷，省去了國標(biāo)方法中每支試管分別測定OD 值的繁雜過程。最后，對于檢測純外添加營養(yǎng)素的樣品，試劑盒方法可以一次提取出維B12、葉酸、泛酸和生物素含量，節(jié)省了國標(biāo)方法中多測提取不同營養(yǎng)素的過程，檢測效率更高。總體而言，與傳統(tǒng)的國標(biāo)方法相比較，新型的試劑盒方法具備操作簡便、檢測效率高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點，這與史贇學(xué)[7]、王贏[8]、黃曉林等人[9]的研究結(jié)果基本一致。

5 結(jié)論

試驗采用國標(biāo)法和試劑盒方法測定嬰兒配方乳粉定量分析質(zhì)控樣品中[9]的含量。結(jié)果表明，2 種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性均良好（R＞0.99），方法的專屬性良好，質(zhì)控樣品檢測的結(jié)果均在滿意范圍內(nèi)且接近特性值，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，2 種方法的檢測結(jié)果差異性不顯著[17-18]，可根據(jù)實驗室的經(jīng)濟(jì)能力及實驗室自身條件選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行測試。