一例耳聾患者及其家庭成員的基因突變分析

閆蘭竹,林 靜,孫曉彤,李東坤,侯兵兵,喬順義

耳聾是人類最常見的先天缺陷之一,在新生兒中發(fā)生率約為1‰,其中50%～70%是由遺傳因素引起的[1,2],可導(dǎo)致非綜合征型耳聾(約70%,僅聽力損失)與綜合征型耳聾(約30%,聽力損失伴其他組織器官病變)[3]。在我國(guó)最常見的非綜合征型耳聾遺傳基因主要有GJB2、SLC26A4(PDS)、GJB3與mtDNA[4]。GJB2基因主要引起先天性重度、極重度感音神經(jīng)性耳聾;SLC26A4基因主要引起大前庭導(dǎo)水管綜合征(EVAS);GJB3是中國(guó)首個(gè)克隆的遺傳疾病基因,主要引起后天高頻感音神經(jīng)性耳聾[2,5];mtDNA為母系遺傳基因[6],其中線粒體12SrRNA與tRNA基因已被證明是與聽力損失相關(guān)的突變熱點(diǎn)[7,8],12SrRNA表現(xiàn)為使用氨基糖苷類藥物不當(dāng)時(shí)發(fā)生聽力損失,稱為“藥物致聾”,tRNA表現(xiàn)為遲發(fā)性耳聾[5]。我院通過耳聾易感基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一例mtDNA 7445A>G基因位點(diǎn)突變引起的聽力障礙病例,并對(duì)其家庭成員進(jìn)行檢測(cè),均證實(shí)為母系遺傳。

1 病例報(bào)告

1.1 研究對(duì)象 先證者(成員1),男,32歲,因聽力障礙于2023年5月來我院進(jìn)行耳聾易感基因檢測(cè),其家庭成員包括先證者父親(成員2)、母親(成員3)、弟弟(成員4)。所有受檢人員均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA(gDNA)的提取 采集待檢測(cè)人員外周靜脈全血2 ml,放置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi),按照離心柱型血液gDNA提取試劑盒(潮州凱普生物化學(xué)有限公司)說明書操作流程提取全血gDNA。

1.2.2 耳聾基因檢測(cè) 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)目的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,完成后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行加熱解鏈?zhǔn)蛊涑蔀閱捂淒NA,然后嚴(yán)格按照DNA雜交試劑盒(潮州凱普生物化學(xué)有限公司)說明書,利用低密度基因芯片+導(dǎo)流雜交技術(shù)在醫(yī)用核酸分子雜交儀上,對(duì)4個(gè)遺傳性耳聾相關(guān)基因的13個(gè)突變位點(diǎn)(GJB2基因235delC、299-300delAT、176-191del16、35delG、155delTCTG,mtDNA基因1494C>T、1555A>G、7445A>G、12201T>C,GJB3基因538C>T和SLC26A4基因IVS7-2A>G、2168A>G、1229C>T)進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過孵育、雜交、化學(xué)顯色反應(yīng)后,通過斑點(diǎn)顏色改變可以得到清晰可見的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 將所有待檢測(cè)樣本寄送至廣州凱普醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所對(duì)可疑突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 結(jié)果

1.3.1 基因檢測(cè)結(jié)果 該家庭成員中,先證者父親未檢測(cè)到檢驗(yàn)范圍內(nèi)的耳聾基因突變,先證者為mtDNA 7445A>G均質(zhì)突變,先證者母親及弟弟均為mtDNA 7445A>G異質(zhì)突變(圖1)。

圖1 mtDNA 7445A>G基因位點(diǎn)突變患者及其家人基因檢測(cè)結(jié)果A.先證者父親mtDNA 7445A>G未見突變;B.先證者mtDNA 7445A>G均質(zhì)突變;C.先證者母親mtDNA 7445A>G異質(zhì)突變;D.先證者弟弟mtDNA 7445A>G異質(zhì)突變。

1.3.2 基因測(cè)序結(jié)果 對(duì)候選基因突變位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,顯示與基因檢測(cè)結(jié)果一致(圖2)。

圖2 mtDNA 7445A>G基因位點(diǎn)突變患者及其家人測(cè)序結(jié)果(突變位置使用紅框標(biāo)注)A.先證者父親mtDNA 7445A>G未見突變;B.先證者mtDNA 7445A>G均質(zhì)突變;C.先證者母親mtDNA 7445A>G異質(zhì)突變;D.先證者弟弟mtDNA 7445A>G異質(zhì)突變。

2 討 論

聽力喪失是一種常見的交流障礙,全球每1000個(gè)活產(chǎn)新生兒中就有1～3個(gè)受到影響[7]。世界衛(wèi)生組織調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,在3.6億聽力喪失的患者中,有3200萬是兒童[7]。目前,新生兒聽力篩查技術(shù)在我國(guó)已廣泛開展,由于可能會(huì)對(duì)遲發(fā)性聽力損失患兒漏診,且不能對(duì)耳聾進(jìn)行病因?qū)W診斷,因而具有一定的局限性[9]。本文中采用的耳聾易感基因變異篩查技術(shù),不但能夠發(fā)現(xiàn)先天性遺傳性耳聾患者,更重要的是能及早發(fā)現(xiàn)常規(guī)物理聽力篩查漏檢的藥物敏感性和遲發(fā)性耳聾基因攜帶者,同時(shí)對(duì)耳聾進(jìn)行遺傳學(xué)診斷,為患者家庭提供遺傳咨詢、治療決策和預(yù)后判斷。

耳聾易感基因檢測(cè)結(jié)果顯示該患者為線粒體DNA 7445A>G位點(diǎn)突變。線粒體DNA為母系遺傳基因,我們對(duì)該患者家庭成員進(jìn)行檢測(cè)證實(shí)并進(jìn)一步研究。據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道,線粒體DNA容易受到氧自由基的攻擊,并且由于缺少組蛋白保護(hù)與有效的自我修復(fù)機(jī)制,因而突變率高。完整的線粒體DNA測(cè)序可以檢測(cè)致病性突變,目前報(bào)道的線粒體DNA常見突變基因有12SrRNA與tRNA[7,8]。本研究家庭的突變位點(diǎn)7445A>G為線粒體tRNA突變,位于tRNASer(UCN)轉(zhuǎn)錄前體3’末端[11,12],目前發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突變方式除7445A>G外,還有7445A>C和7445A>T 兩種[11]。7445A>G突變可降低tRNASer(UCN)穩(wěn)定性,導(dǎo)致線粒體tRNA代謝功能衰竭,影響線粒體內(nèi)多肽合成以及ATP產(chǎn)生,改變線粒體呼吸作用和功能[7,8],逐漸引起毛細(xì)胞萎縮甚至凋亡,從而造成非綜合征型耳聾[13];同時(shí)7445A>G突變可導(dǎo)致讀取相鄰細(xì)胞色素氧化酶基因CO1的終止密碼子AGA,從而向多肽的C-末端添加3個(gè)氨基酸(Lys-Gln-Lys)[7,8,14],輕鏈RNA前體在加工過程中產(chǎn)生缺陷[8],使細(xì)胞色素C氧化酶肽鏈延長(zhǎng),改變細(xì)胞色素C氧化酶空間結(jié)構(gòu)與生理功能,最終導(dǎo)致耳聾[12]。7445A>C、7445A>T 突變的致病機(jī)制可能與7445A>G相似[11,14]。

線粒體DNA突變型與野生型共存的現(xiàn)象稱為線粒體DNA異質(zhì)性[10,15]。研究發(fā)現(xiàn),異質(zhì)性可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng),并與衰老密切相關(guān)[16]。本病例僅存在線粒體DNA突變型,且為均質(zhì)突變;患者母親及弟弟線粒體DNA突變型與野生型共存,為異質(zhì)突變。在異質(zhì)性細(xì)胞中,致病性線粒體DNA突變的表型由突變型和野生型基因組的比例決定,如果比例達(dá)到閾值,則導(dǎo)致疾病的發(fā)生[10,17],這可能為該患者出現(xiàn)臨床癥狀的原因之一。而該患者與其母親、弟弟的基因型不同,可能有多方面原因。據(jù)研究,線粒體DNA與核DNA不同,是伴隨細(xì)胞質(zhì)分裂偶然地隨機(jī)不等地分配到子細(xì)胞中的[18],如果母細(xì)胞中存在異質(zhì)性變異,即使是突變水平低至0.15%的異質(zhì)性變異,在人類中也是具有遺傳性的。通過隨機(jī)遺傳漂變,子細(xì)胞獲得的突變基因比例是不同的,因而可呈現(xiàn)出不同的異質(zhì)性水平,這種隨機(jī)分配導(dǎo)致的線粒體DNA異質(zhì)性變化的過程稱為復(fù)制分離[19]。隨后,子細(xì)胞作為新的母細(xì)胞進(jìn)行分裂,從而擴(kuò)大這種異質(zhì)性水平范圍[20]。異質(zhì)性水平可以在同一家族不同個(gè)體、同一個(gè)體不同器官甚至同一器官或組織不同細(xì)胞之間有所不同,也就是說具有相同核DNA的細(xì)胞或者個(gè)體,如一卵雙生,其細(xì)胞質(zhì)基因型可以不同,從而表型也有所差異[21]。在人類中,線粒體DNA通常僅通過母系傳遞給后代,具有低水平有害異質(zhì)性線粒體DNA突變的臨床無癥狀女性可能將其致病突變傳遞給所有后代,導(dǎo)致線粒體DNA功能障礙和疾病[15,22]。受影響后代臨床癥狀的嚴(yán)重程度通常與線粒體DNA異質(zhì)性水平(即有害突變的百分比)有關(guān)[15]。

目前認(rèn)為,來自同一個(gè)母本的不同后代之間基因異質(zhì)性水平的差異發(fā)生在初級(jí)卵母細(xì)胞形成之前,在卵母細(xì)胞發(fā)育早期,每個(gè)細(xì)胞的線粒體DNA拷貝數(shù)下降到相對(duì)較低的值,成為線粒體DNA遺傳的瓶頸,這種對(duì)線粒體基因拷貝數(shù)量的限制導(dǎo)致了快速遺傳漂變,使得等位基因的頻率發(fā)生劇烈變化,從而造成母體與子代之間異質(zhì)性水平不同[23]。對(duì)已知致病性線粒體DNA突變家族的研究表明,突變水平在母親和后代之間可能有很大的變化[16,21]。遺傳漂變理論預(yù)測(cè),隨著母體突變水平的降低,后代突變水平可能會(huì)下降,這種非常低水平異質(zhì)突變變異的減少可能使它們?cè)趲状g更穩(wěn)定[16]。遺傳瓶頸應(yīng)該作為限制具有非常低突變水平的線粒體DNA突變遺傳的障礙,因?yàn)檫@些低水平突變通過瓶頸到達(dá)后代的概率應(yīng)該很低。線粒體DNA突變是否在母親和孩子之間的線粒體瓶頸中存活下來,這是理解線粒體DNA變異,包括致病變異,如何在家族中建立的重要關(guān)鍵。原則上,線粒體DNA從母體遺傳到后代的瓶頸可以有效地過濾掉低水平突變[16],也就是說對(duì)于一個(gè)有害的異質(zhì)體,嚴(yán)重的遺傳瓶頸可能會(huì)在子代突然轉(zhuǎn)化為良性(低頻率)的致病水平[18]。但是除遺傳漂變外,有些低水平的線粒體DNA突變能夠通過“主動(dòng)選擇”傳遞給子代,這種機(jī)制不僅能使突變的線粒體DNA有效通過遺傳瓶頸,還能使致病的線粒體DNA突變逃避自身修復(fù)機(jī)制[20]。即使是低水平線粒體DNA的異質(zhì)性也是至關(guān)重要的,因?yàn)槊恳粋€(gè)從頭開始的線粒體DNA突變都必須從非常低的水平開始。由于從母親傳遞到后代的線粒體DNA分子數(shù)量較少,遺傳非常低水平的線粒體DNA突變的能力似乎確實(shí)相當(dāng)有限。有證據(jù)表明,非常低水平的線粒體DNA突變的母體遺傳,下降到0.15%的突變水平,確實(shí)發(fā)生在普通人群中。有可能有很多低水平的線粒體DNA突變,以至于即使有很深的瓶頸,一些變異仍然由后代遺傳[16]。另外,有研究表明,母親受孕年齡和自身異質(zhì)性水平會(huì)對(duì)子代線粒體DNA異質(zhì)性水平有一定影響,導(dǎo)致突變頻率在母親和孩子之間發(fā)生顯著變化并致病[18]。

突變本身不足以產(chǎn)生臨床表型,包括核背景、環(huán)境因素和線粒體單倍型在內(nèi)的其他修飾因素對(duì)突變的表型表現(xiàn)也是必要的[1,7],因而線粒體DNA突變導(dǎo)致的疾病在個(gè)體家系和不同家系中會(huì)有所不同[1]。本研究家系家庭成員少導(dǎo)致樣本量小,故存在一定的局限性,我們將擴(kuò)大樣本量,對(duì)耳聾基因線粒體DNA的遺傳與致病機(jī)制進(jìn)一步研究。