cfDNA 研究現(xiàn)狀及分析前變量淺析

彭宏威，劉南，張姍姍，鄒聰，錢(qián)開(kāi)宇

循環(huán)游離 DNA（circulating free DNA，cfDNA）是在外周血中發(fā)現(xiàn)的游離于細(xì)胞外的 DNA[1]。1977 年，Leon 等[2]用放射免疫測(cè)定法發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中 cfDNA 含量水平明顯高于健康人群，現(xiàn)已證實(shí)它廣泛存在于人體血液、尿液、腦脊液、胸腹水、卵泡液、唾液等各類(lèi)體液中[3-4]。cfDNA 是核小體凋亡 DNA 在細(xì)胞內(nèi)循環(huán)核酸酶的作用下天然斷裂形成的平均長(zhǎng)度為 180 ～ 200 bp 的小片段[5]，作為分子標(biāo)志物具有獲取簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、信息量大等得天獨(dú)厚的優(yōu)點(diǎn)，在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（non-invasive prenatal testing，NIPT）、腫瘤診斷及監(jiān)測(cè)、器官移植監(jiān)測(cè)、糖尿病、自身免疫性疾病等領(lǐng)域均具有大量的研究[6-7]。目前 cfDNA 的檢測(cè)方法主要有PCR 和二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS），其原理和優(yōu)缺點(diǎn)各不相同，需結(jié)合研究目的及分析前變量來(lái)選擇合適的方法。

cfDNA 分析前各種因素均會(huì)影響其質(zhì)量，這嚴(yán)重阻礙了 cfDNA 在眾多領(lǐng)域內(nèi)的臨床推廣應(yīng)用。建立一套 cfDNA標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)前處理流程（pre-analytical procedures，PAP）是cfDNA 檢測(cè)實(shí)現(xiàn)臨床廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。本文集中討論cfDNA 研究現(xiàn)狀及影響其質(zhì)量的各種檢測(cè)前變量，以期為cfDNA 建立標(biāo)準(zhǔn) PAP 以及為臨床檢測(cè)的應(yīng)用提供參考。

1 cfDNA 研究現(xiàn)狀

cfDNA 主要類(lèi)型有細(xì)胞核源性 DNA（nuclear cfDNA，ncfDNA）與線粒體源性 DNA（mitochondrial cfDNA，mtcfDNA）[8]。cfDNA 的產(chǎn)生機(jī)制目前不是完全清楚，現(xiàn)普遍認(rèn)為是活細(xì)胞的主動(dòng)釋放或凋亡與壞死細(xì)胞的被動(dòng)釋放產(chǎn)生的[9]。人體 cfDNA 含量受肥胖、運(yùn)動(dòng)及腫瘤等多種因素影響[10-11]。在健康人外周血中 cfDNA 含量均值約為30 ng/ml[12]，幾乎都來(lái)自凋亡或壞死細(xì)胞，腫瘤患者體內(nèi)的cfDNA 則更多來(lái)源于腫瘤細(xì)胞及鄰近非腫瘤細(xì)胞的凋亡[13]。

目前 cfDNA 的檢測(cè)主要有 PCR 和 NGS 兩種方法，近年來(lái)基于這兩種方法衍生出許多更加高效靈敏的檢測(cè)方法。隨著檢測(cè)靈敏度和精確度的不斷提高，PCR 技術(shù)現(xiàn)已發(fā)展為實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、數(shù)字 PCR（digital PCR，dPCR）和微滴式數(shù)字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）等多種檢測(cè)技術(shù)。NGS 是目前公認(rèn)檢測(cè) cfDNA 最有效的分析方法，具有靈敏度高、通量大的優(yōu)點(diǎn)。cfDNA 的評(píng)估指標(biāo)因檢測(cè)目的或樣本類(lèi)型的不同而有所差異，主要有 cfDNA 濃度、純度、片段長(zhǎng)度、片段完整性等基本指標(biāo)[14-15]。Shen 等[16]以血漿 cfDNA 為模板，qPCR 定量檢測(cè) ALU247 和 ALU115 片段的濃度，ALU247/ALU115 比率來(lái)評(píng)估 cfDNA 的完整性，發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者血漿 cfDNA 水平顯著升高，ALU247 片段濃度與多種臨床特征顯著相關(guān)。此外，腫瘤的研究中還會(huì)借助腫瘤細(xì)胞釋放 cfDNA 進(jìn)入體液的特點(diǎn)來(lái)測(cè)定 cfDNA 基因位點(diǎn)突變[17]、拷貝數(shù)變化[18]等指標(biāo)或甲基化情況[19]。

無(wú)創(chuàng)、成本低、靈敏度高、取樣簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)一直是臨床診斷標(biāo)志物的選擇標(biāo)準(zhǔn)。目前，從 cfDNA 中獲取的生物信息在 NIPT 和癌癥等方面已有廣泛的應(yīng)用。在 NIPT領(lǐng)域，cfDNA 檢測(cè)主要用于識(shí)別胎兒染色體異常的遺傳疾病和性別鑒定等。Zhu 等[20]通過(guò)高通量測(cè)序分析了一個(gè)NIPT 病例，有效評(píng)估了分別來(lái)源于骨髓移植和供體卵子體外受精的 cfDNA 的遺傳相關(guān)性，為非侵入性產(chǎn)前親子鑒定提供了一種新的方法。腫瘤發(fā)病隱匿，發(fā)展周期長(zhǎng)，如何在影像學(xué)未檢查出腫瘤灶前就提示腫瘤存在是醫(yī)學(xué)界有待攻破的難題。cfDNA 檢測(cè)較影像學(xué)靈敏度更高且無(wú)創(chuàng)、無(wú)輻射，使其在腫瘤領(lǐng)域備受關(guān)注。cfDNA 既可以作為生物標(biāo)志物檢測(cè)腫瘤基因異質(zhì)性[21]，還能作為輔助組織活檢的新方法用于腫瘤診斷、治療后監(jiān)測(cè)及耐藥性檢測(cè)[22-23]。飲食暴露誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞凋亡也會(huì)導(dǎo)致 cfDNA 釋放，來(lái)自 cfDNA的信息可提前預(yù)測(cè) 2 型糖尿病的發(fā)展[6]。在器官移植中供體來(lái)源的 cfDNA 可作為分子標(biāo)記來(lái)評(píng)估排斥反應(yīng)后的同種異體移植物損傷[24]。cfDNA 在自身免疫性疾病中作為疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物也發(fā)揮著重要作用[25]。

目前，雖然 cfDNA 已被報(bào)道在眾多領(lǐng)域內(nèi)廣泛應(yīng)用，但普遍存在的問(wèn)題是分析前的各種變量描述不全或不明確，且在大多領(lǐng)域內(nèi)依然停留在初期研究階段，尚未實(shí)現(xiàn)臨床推廣應(yīng)用。Shen 等[16]在分析 cfDNA 水平和完整性與多發(fā)性骨髓瘤患者臨床特征之間的相關(guān)性時(shí)，描述了采集的血液在4 ℃ 下保存及 8 h 內(nèi)進(jìn)行處理，未描述樣本在長(zhǎng)時(shí)間緩沖處理期間是否還經(jīng)歷過(guò)常溫轉(zhuǎn)運(yùn)等可能影響樣本質(zhì)量的因素。Wolf-Doty 等[24]通過(guò)檢測(cè)同種異體器官移植受體血液中供體來(lái)源的 cfDNA 來(lái)評(píng)估排斥反應(yīng)后的移植物損傷情況，沒(méi)有明確描述血液采集量、處理時(shí)限、cfDNA 提取相關(guān)信息等分析前變量，這使分析結(jié)果缺乏可靠性，也不利于方法的驗(yàn)證及研究成果的臨床應(yīng)用。

2 規(guī)范 cfDNA 檢測(cè)分析前變量的意義

cfDNA 在 NIPT 領(lǐng)域內(nèi)已得到權(quán)威驗(yàn)證且具有廣泛的臨床應(yīng)用，但目前可供參考的 NIPT 分析前數(shù)據(jù)非常有限[7]。cfDNA 在其他臨床領(lǐng)域內(nèi)研究非常廣泛，但尚未達(dá)到常規(guī)臨床診斷廣泛推廣應(yīng)用的水平，原因之一是 cfDNA分析前階段缺乏標(biāo)準(zhǔn) PAP。刁振麗等[26]專(zhuān)門(mén)探討了宏基因組下一代測(cè)序（mNGS）用于全國(guó) 80 個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血液樣本中微生物 cfDNA 的質(zhì)量保證問(wèn)題，調(diào)查了樣本分析前、分析中、分析后和進(jìn)行性能驗(yàn)證的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)室mNGS 工作流程差別很大，需要積極優(yōu)化工作流程來(lái)確保及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。Luo 等[27]為探究不同采血管對(duì)血漿cfDNA 和 NIPT 質(zhì)量控制的影響，比較了保存在 EDTA、ImproGene 和 Streck 試管中的血液樣本溶血、cfDNA 濃度和片段分布情況，最后發(fā)現(xiàn) ImproGene 管性能最為優(yōu)良。尿液 cfDNA 除血液 cfDNA 通過(guò)腎臟濾過(guò)外，還來(lái)源于腎、膀胱等泌尿器官細(xì)胞的釋放，故在泌尿系統(tǒng)腫瘤患者體內(nèi)含量明顯高于健康人群。尿液量大且易收集，是研究泌尿系統(tǒng)腫瘤的理想樣本[28]。然而，尿液 cfDNA 的成功應(yīng)用卻相對(duì)較少，很重要的原因是尿液樣本 cfDNA 濃度低且容易降解，同時(shí)缺乏標(biāo)準(zhǔn)的 PAP。

樣本質(zhì)量是確保轉(zhuǎn)化研究成果可重復(fù)性的決定性因素之一。樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、預(yù)處理、提取及保存等過(guò)程中許多因素（表 1）均會(huì)影響分析前 cfDNA 的樣本質(zhì)量。當(dāng)前面臨的最主要的問(wèn)題有：①cfDNA 容易受基因組 DNA 的污染[30]，且在體外不穩(wěn)定，易發(fā)生降解，即使在采集時(shí)使用 EDTA 保護(hù)液并及時(shí)處理樣本，也可能會(huì)因?yàn)榫栀?zèng)者身體狀況原因或樣本轉(zhuǎn)運(yùn)條件等多種不易控制的因素疊加而導(dǎo)致 cfDNA 受到污染或降解[29,38]；②cfDNA 濃度低且片段小，而 cfDNA 用于分析檢測(cè)前需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜繁多的步驟，該過(guò)程極易發(fā)生 cfDNA 的含量損失或關(guān)鍵片段丟失[33]；③cfDNA 的檢測(cè)與定量方法多樣，其準(zhǔn)確性相互之間難以確證比較。如 PCR 常通過(guò)看家基因或穩(wěn)定的非編碼重復(fù)序列來(lái)對(duì) cfDNA 進(jìn)行定量，qPCR 測(cè)量靶基因的 Ct 值后再用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 cfDNA 的量，使用不同的標(biāo)準(zhǔn)品或參考基因可能會(huì)得到差別極大的結(jié)果，另外提取過(guò)程中的樣本損失也會(huì)使測(cè)定結(jié)果偏低，這些因素使同一樣本 cfDNA 的不同定量結(jié)果無(wú)法比較[39]。只有對(duì) cfDNA 分析前的各個(gè)變量及細(xì)節(jié)進(jìn)行規(guī)范且統(tǒng)一，最終檢測(cè)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性才能得到保障，因此建立 cfDNA 的標(biāo)準(zhǔn)化 PAP 意義重大。

3 影響 cfDNA 樣本質(zhì)量的因素

3.1 樣本采集過(guò)程

cfDNA 樣本采集時(shí)捐贈(zèng)者身體狀況、樣本類(lèi)型、抗凝劑、采集容器和采集量等均會(huì)影響樣本保存質(zhì)量。人體主要依托血液循環(huán)進(jìn)行新陳代謝，采集血液用于 cfDNA 檢測(cè)研究適用面最廣，其他樣本來(lái)源的 cfDNA 檢測(cè)研究相對(duì)較少。捐贈(zèng)者身體狀況主要包括年齡、是否運(yùn)動(dòng)、是否妊娠、疾病狀況等情況，捐贈(zèng)者身體狀況不同，體液 cfDNA 含量不同[29]。Neuberger 等[40]研究表明運(yùn)動(dòng)通過(guò)影響人體免疫穩(wěn)態(tài)從而引起體液中 cfDNA 含量的顯著增加。Krasnyi 等[41]比較了早產(chǎn)女性與足月分娩女性血漿 cfDNA 和胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的含量，發(fā)現(xiàn)妊娠22 ～ 31 周和 32 ～ 36 周的早產(chǎn)女性比足月分娩女性 cfDNA含量高，妊娠 32 ～ 36 周的早產(chǎn)女性比足月分娩女性cffDNA 含量高。

首選血漿用于 cfDNA 的檢測(cè)，血漿可避免白細(xì)胞裂解釋放的基因組 DNA 影響 cfDNA 的濃度及純度[30]，常選擇含 EDTA、肝素和檸檬酸鹽等抗凝劑的采血管來(lái)采集樣本[42]。含不同抗凝劑的采血管樣本保存效果不同，肝素會(huì)與血液中 cfDNA 形成聚合物而影響 cfDNA 提取及qPCR 效率[43]。雖有研究稱(chēng)含有 3.2% 檸檬酸鈉采血管比K2EDTA 采血管性能更好[44]，但缺乏更多可靠的研究支撐。如果血液暫存時(shí)間不超過(guò) 4 h，則優(yōu)先推薦 EDTA 采血管。由于采集血液樣本后經(jīng)常要跨地區(qū)運(yùn)輸而不能立即處理，近年來(lái)許多保存效果很好的商業(yè)專(zhuān)用采血管被用于 cfDNA檢測(cè)目的的采集中，可使血漿 cfDNA 含量在 7 d 內(nèi)保持穩(wěn)定[31]。腫瘤患者血漿 cfDNA 濃度通常在 180 ng/ml 左右，循環(huán)腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）片段較短且含量更少，為了保證采集到足量 cfDNA 用于后續(xù)DNA 提取及人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變檢測(cè)，有專(zhuān)家共識(shí)推薦采集 10 ml 全血用于進(jìn)一步分離血漿[45]。

表1 cfDNA 的分析前變量及其影響方式

目前關(guān)于尿液、腦脊液和腹水等體液 cfDNA 樣本的采集研究相對(duì)較少，由于樣本量大，為方便采集，大多先采用無(wú)菌容器收集好樣本，得益于血液 cfDNA 樣本收集的成熟經(jīng)驗(yàn)，部分研究者會(huì)向樣本中加入 EDTA 等抗凝劑。Markus等[46]使用全基因組測(cè)序來(lái)表征尿液 cfDNA 的片段模式，收集尿液后加入 0.5 mol/L EDTA 0.8 ml 并在 1 h 內(nèi)進(jìn)行處理。Chauhan 等[47]用 NGS 方法分析 42 例膀胱癌患者的尿液 cfDNA，在根治手術(shù)前用含有 2 ml 的 0.5 mol/L EDTA 的無(wú)菌小瓶收集尿液樣本。他們都借鑒了已有的經(jīng)驗(yàn)，特別對(duì)添加 EDTA 保護(hù)劑、縮短處理時(shí)限等關(guān)鍵分析前變量進(jìn)行嚴(yán)格控制，因此能夠確保腫瘤來(lái)源的尿液cfDNA 在分析前質(zhì)量可控，進(jìn)而得到了可靠有用的信息。

3.2 樣本轉(zhuǎn)運(yùn)及暫存過(guò)程

樣本采集至預(yù)處理前涉及到樣本的轉(zhuǎn)運(yùn)和暫存，該過(guò)程中運(yùn)輸時(shí)間、溫度及暫存時(shí)間是影響樣本質(zhì)量的主要因素。EDTA 管內(nèi)的血液應(yīng)在采集后 4 h 內(nèi)處理，如不能及時(shí)處理，應(yīng)暫存于 4 ℃ 條件下以避免基因組 DNA 的污染，但延遲處理時(shí)間最好不要超過(guò) 24 h。涉及跨地區(qū)樣本采集，最好使用商業(yè)專(zhuān)用的 cfDNA 管來(lái)采集樣本并常溫運(yùn)輸，在7 d 內(nèi)可以確保樣本質(zhì)量的穩(wěn)定。樣本轉(zhuǎn)運(yùn)及暫存過(guò)程中應(yīng)避免發(fā)生溶血，細(xì)胞中釋放的血紅蛋白及其代謝產(chǎn)物對(duì) Taq酶活性有抑制作用，最終會(huì)導(dǎo)致 PCR 擴(kuò)增效率降低[38]。尿液樣本暫存條件跟血液樣本大致一樣，腦脊液、胸腹水等樣本基本是采集并處理后立即用于檢測(cè)，轉(zhuǎn)運(yùn)及暫存過(guò)程的參考實(shí)例較少。

3.3 樣本處理過(guò)程

樣本處理過(guò)程非常重要，既要確保 cfDNA 提取得率，也要避免可能來(lái)自基因組 DNA 對(duì)樣本的污染。離心力、離心時(shí)間等參數(shù)會(huì)影響 cfDNA 提取含量。對(duì)血液來(lái)說(shuō)，為了有效減少基因組 DNA 對(duì)樣本的污染，處理時(shí)推薦兩步離心法，第一步使用較低離心力去除大量細(xì)胞成分，第二步使用較高離心力去除細(xì)胞殘余物和細(xì)胞碎片。尿液、腹水、腦脊液和唾液等體液樣本中所含細(xì)胞成分相對(duì)較少，現(xiàn)有研究基于不同目的或樣本類(lèi)型的離心處理方式各不相同，大多借鑒了血液樣本處理方法，采用二次離心或一次離心方式來(lái)處理樣本。Ding 等[3]在探究 cfDNA 用于非小細(xì)胞肺癌診斷的應(yīng)用中，將 EDTA 管采集的外周血進(jìn)行二次離心，第一次是在 4 ℃ 以 1900 ×g離心 10 min，第二次是在4 ℃ 以 16 000 ×g離心 10 min；收集的唾液樣本也是采用二次離心方法進(jìn)行處理，先在 300 ×g下離心 20 min，再以 10 000 ×g離心 20 min，樣本在提取 DNA 前均凍存于-80 ℃。該研究血液和唾液的處理流程中，由于血液中細(xì)胞成分遠(yuǎn)比唾液復(fù)雜，處理血液的兩次離心力均大于處理唾液的離心力，唾液具有一定黏性且含有泡沫，因此處理唾液的時(shí)間比血液更長(zhǎng)。Miller 等[32]通過(guò)對(duì)腦脊液 cfDNA 測(cè)序分析驗(yàn)證了微創(chuàng)分子診斷的臨床經(jīng)驗(yàn)，用無(wú)菌 Streck 管收集腦脊液后對(duì)樣本進(jìn)行二次離心（1600 ×g離心10 min，3000 ×g離心 10 min）徹底去除細(xì)胞沉淀等雜物。Liu 等[48]用全基因組測(cè)序分析腫瘤來(lái)源的腦脊液 cfDNA，用無(wú)菌管收集腦脊液后對(duì)樣本進(jìn)行一次處理（1500 ×g離心 10 min），上清液等份分裝至新的 1.5 ml Eppendorf 管中。由于研究目的不同，這兩種腦脊液樣本前處理參數(shù)和流程差異很大，目前腦脊液 cfDNA 研究得較少，沒(méi)有可推薦的最佳樣本前處理方案。

3.4 樣本提取過(guò)程

cfDNA 提取效率是決定檢測(cè)結(jié)果的重要步驟，但cfDNA 含量低且片段小，如何高效快捷提取 cfDNA 一直是研究的重點(diǎn)。目前提取 cfDNA 主要方法有異戊醇抽提法、磁珠法和親和柱法等，大多實(shí)驗(yàn)室均采用商業(yè)試劑盒來(lái)提取cfDNA。商業(yè)試劑盒種類(lèi)較多，其中 Qiagen 公司生產(chǎn)的一系列 DNA 提取商業(yè)試劑盒應(yīng)用較為廣泛，但該試劑盒提取純化過(guò)程中會(huì)損失 150 bp 以下小片段而導(dǎo)致 cfDNA產(chǎn)率降低[33]。Diefenbach 等[34]比較了 6 種 cfDNA 提取試劑盒的性能，該研究首次使用添加 DNA 片段來(lái)評(píng)估商業(yè)cfDNA 試劑盒，發(fā)現(xiàn)基于旋轉(zhuǎn)柱的 Qiagen QIAamp 循環(huán)核酸試劑盒是性能表現(xiàn)最穩(wěn)定的試劑盒。方仲表等[35]比較了基于磁珠法的天根游離核酸提取試劑盒和基于硅膠膜吸附柱法的德國(guó) Qiagen 循環(huán)核酸試劑盒對(duì)血漿中 cfDNA 的提取效果，采用 EGFR 突變基因檢測(cè)試劑盒作為定量分析方法，發(fā)現(xiàn) Qiagen 試劑盒在 cfDNA 提取濃度及純度、EGFR 突變基因的陽(yáng)性檢出率和重復(fù)性方面的表現(xiàn)均要優(yōu)于天根試劑盒。不同試劑盒所獲得的 cfDNA 產(chǎn)率、純度及特定片段大小等一般是不同的，且各個(gè)試劑盒的定量分析方法也不同，目前主要定量方法有試劑盒法、qPCR 及某些特定基因的拷貝數(shù)等[49]，因此很難有可推薦的對(duì)比研究結(jié)果。

3.5 樣本保存過(guò)程

保存提取的 cfDNA 比保存用于提取的體液會(huì)更加穩(wěn)定，保存時(shí)間、保存溫度、cfDNA 提取物濃度等均會(huì)影響cfDNA 提取物樣本的保存質(zhì)量。Shao 等[36]系統(tǒng)地研究了反復(fù)凍融循環(huán)對(duì) DNA 樣品穩(wěn)定性的影響，研究發(fā)現(xiàn)凍融循環(huán)次數(shù)的增加會(huì)加速 DNA 的降解，且大片段的 DNA 最容易降解，但增加 DNA 濃度可以減少由反復(fù)凍融循環(huán)引起的 DNA 片段降解。許多研究因?qū)嶋H需要保存的是初步處理后用于提取 cfDNA 的體液樣本，如血漿、尿液、腦脊液等[38]。體液樣本冷凍保存后超過(guò) 3 次以上的凍融循環(huán)會(huì)引起 cfDNA 片段化[37]。Clausen 等[50]研究了血漿于 -25 ℃儲(chǔ)存 0 ～ 6 年 cffDNA 及 cfDNA 含量的變化情況，發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存 2 ～ 3 年的血漿中可擴(kuò)增的 cffDNA 和總 DNA 水平顯著增加，儲(chǔ)存 3 年后 cffDNA 部分略有下降，推測(cè)可能是隨著時(shí)間的推移，DNA 中蛋白質(zhì)的丟失引起了 cffDNA及 cfDNA 產(chǎn)量增加。Chen 等[51]研究了 cfDNA 在不同溶劑中的凍融穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)存在于血漿中或儲(chǔ)存在提取緩沖液中的 cfDNA 凍融后回收率穩(wěn)定，且 cfDNA 濃度在 4 ℃下 24 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，在室溫下 12 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。尿液、腦脊液等體液針對(duì) cfDNA 檢測(cè)研究的保存目前報(bào)道極少，還沒(méi)有形成可供參考的經(jīng)驗(yàn)。樣本處理后根據(jù)研究使用需求進(jìn)行小體積多份數(shù)分裝更有利于樣本的保存和提高使用效率[7]，也可以減少將來(lái)樣本可能存在的凍融循環(huán)。

4 總結(jié)與展望

cfDNA 是極具應(yīng)用潛力的分子標(biāo)志物，存在于各類(lèi)體液樣本中，在 NIPT 和癌癥等眾多領(lǐng)域內(nèi)均具有廣泛的研究或應(yīng)用。前處理流程中影響 cfDNA 樣本質(zhì)量的因素眾多且復(fù)雜，現(xiàn)有研究尚存在一些不足。目前絕大部分研究均是針對(duì)血液樣本 cfDNA 檢測(cè)前處理流程，尿液、胸腔積液、腦脊液等[48]體液樣本cfDNA 檢測(cè)前處理流程及方法基本是參考血液的經(jīng)驗(yàn)或者非常簡(jiǎn)易的操作過(guò)程，還缺乏更多相關(guān)研究來(lái)形成更加精準(zhǔn)規(guī)范的方法。有研究表明 cfDNA 甲基化受分析前因素的影響[52]進(jìn)而可能會(huì)最終影響 cfDNA的分析結(jié)果，相關(guān)機(jī)制還不明確。此外，不同樣本處理后常用試劑盒來(lái)提取 cfDNA，不同的試劑盒提取效率各不相同[34]，并且 cfDNA 的定量檢測(cè)也有爭(zhēng)議[39]，這些極不利于不同實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)對(duì)比及 cfDNA 檢測(cè)前處理流程的規(guī)范，試劑盒的提取效率還有待優(yōu)化，相應(yīng)配套的定量檢測(cè)方法也有待摸索。

cfDNA 檢測(cè)前處理流程的標(biāo)準(zhǔn)化是一項(xiàng)非常復(fù)雜的工作，仍需以下大量工作才能促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)化 PAP 的建立：①尿液、胸腔積液、腦脊液等體液 cfDNA 檢測(cè)的分析前質(zhì)量控制因素需要更多可靠的比對(duì)研究來(lái)確認(rèn)；②cfDNA 的提取方法需要進(jìn)一步優(yōu)化，開(kāi)發(fā)可以避免基因組 DNA 污染且實(shí)現(xiàn)小片段 cfDNA 高效提取的試劑盒，針對(duì)尿液、胸腔積液、腦脊液等不同體液開(kāi)發(fā)不同的專(zhuān)用試劑盒以獲得可靠的提取得率；③在 cfDNA 的定量檢測(cè)方法上，針對(duì) PCR 定量檢測(cè)方法，可以使用多內(nèi)參基因分析并開(kāi)發(fā)新的 cfDNA含量評(píng)估辦法，經(jīng)過(guò)更多研究確證后形成行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)并推廣使用，此外可以將拉曼光譜法、電化學(xué)傳感器法等靈敏度更高的檢測(cè)方法應(yīng)用到 cfDNA 的定量檢測(cè)中。

在 cfDNA 分析前處理中，研究表明部分操作可以作為建立標(biāo)準(zhǔn)化 PAP 的規(guī)范。如樣本收集時(shí)添加 EDTA 保護(hù)液[46-47]和血液樣本及時(shí)處理[31]對(duì)保證 cfDNA 質(zhì)量至關(guān)重要。隨著技術(shù)的快速發(fā)展以及越來(lái)越多研究人員參與到實(shí)際問(wèn)題的解決中，cfDNA 檢測(cè)前處理流程在不久的將來(lái)會(huì)更加規(guī)范，必定也會(huì)為臨床診療做出更突出的貢獻(xiàn)。