植物乳桿菌AR307 發酵培養基優化研究

衡利冰，夏永軍，艾連中，劉欣欣

上海理工大學健康科學與工程學院/上海食品微生物工程技術研究中心，上海 200093

乳酸菌能夠用于生產酸乳、乳酪、風味泡菜、發酵飲料等具有保健功能的食品。植物乳桿菌作為一種常見乳酸菌，因其抗衰老、減輕腸道生態平衡[1]等功能而愈發受消費者重視與喜愛了[2]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為乳桿菌科乳桿菌屬，不產芽孢、兼性厭氧或厭氧、可用于食品加工產業的革蘭氏陽性菌，形狀為直桿狀或彎桿狀[3]，是一種重要的益生菌，具有調節動物胃腸道菌群平衡、改善腸道內環境、增強免疫力和抵抗力等多種功能[4-6]。近年來，植物乳桿菌開始被應用于泡菜、豆腐等產品的發酵中，有益于人體健康，已成為國內外的研究熱點之一。

目前，有關益生菌的研究日漸增多，但將其應用于大規模工業化生產中仍具有一定的局限性。植物乳桿菌培養基優化研究快速發展，但其工業化應用仍處于起步階段。工業上常以MRS 培養基為發酵培養基，一些學者研究了添加緩沖鹽和化學中和劑以促進乳酸菌生長的方法[7]。Choi GH 等[8]用OFAT 法篩選碳源、氮源等，通過響應面實驗得到菌株生物量為3.845 g/L，為優化培養基的2.429 倍。Chen H 等[9]通過優化碳源、氮源、有效因子等，得知磷酸氫二鉀為促生長因子，各物質的添加量為葡萄糖21 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉8 g/L，酵母浸出粉8 g/L，磷酸氫二鉀3.5 g/L，CH3COONa 6.5 g/L，C6H14O7N22 g/L，MgSO40.2 g/L，吐溫80 1 mL/L 時，最大活菌數可以達到2.72×109CFU/mL。孫雨佳等通過單因素、爬坡實驗與中心組合實驗確定了植物乳桿菌NCU137 最佳培養基的成分為麥芽糖26.73 g/L，酵母浸粉21.8 g/L，大豆蛋白胨16.59 g/L，MgSO4·7H2O 0.15 g/L，MnSO4·H2O 0.06 g/L，腺嘌呤0.13 g/L，苯丙氨酸0.051 g/L，吐溫80 為1 mL/L，最終活菌數高達9.2×109CFU/mL。植物乳桿菌AR307 是上海理工大學食品微生物工程技術研究中心實驗室從四川泡菜中篩獲的一種乳酸菌，具有降血糖、抑制腫瘤、抑制α-淀粉酶等作用。根據植物乳桿菌AR307 的生長需求，調整MRS 培養基碳源、氮源、無機鹽的含量進行單因素實驗、Box-Behnken 試驗，旨在提高植物乳桿菌AR307 的菌體密度，為AR307 產業化、工業化大劑量發酵提供理論依據[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌AR307，由上海理工大學食品微生物工程技術研究中心保藏；

MRS 培養基：酪蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，乙酸鈉8.3 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1 mL/L;

MRS 固體培養基：在液體培養基的基礎上加入20.0 g/L 的瓊脂；

果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、低聚木糖、木糖、海藻糖、殼寡糖、淀粉、抗性糊精、菊粉、胰蛋白胨。

PL2002 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-1D 型單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；酶標儀，奧地利美谷分子；DU-800 分光光度計，Beckman 公司；Ruskinn 低氧厭氧培養工作站，英國Ruskinn；BPH-G082 型精密恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；Bioscreen C 全自動生長曲線分析儀，芬蘭Oy Growth Curves Ab 公司；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠。

1.2 菌株培養

將于-80 ℃保藏的植物乳桿菌AR307 在固體MRS 培養基上劃線培養，在37 ℃恒溫培養箱中培養24～48 h 后，挑取單菌落于液體MRS 培養基中，于37 ℃恒溫培養箱中培養16～18 h 后，以1%的比例接種于優化培養基中培養。

1.3 發酵培養基優化

分別選擇不同的碳源、氮源、無機鹽作為影響菌株活性的主要因素，通過單因素試驗選擇影響因素與水平。

1.3.1 最佳碳源的確定

在MRS 培養基中分別加入2%的果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、低聚木糖、木糖、海藻糖、殼聚、淀粉、抗性糊精、菊粉、葡萄糖，研究不同種類的碳源對植物乳桿菌AR307 生長的影響，篩選出最佳碳源后選擇不同濃度的碳源加入MRS，研究碳源濃度對菌株的影響，菌株接種量均為1%，37 ℃培養24 h，生長曲線儀測定菌體的OD600。

1.3.2 最佳氮源的確定

在MRS 培養基中分別添加酵母浸粉、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨，研究不同氮源對植物乳桿菌AR307 生長的影響，又研究了復配氮源及不同濃度的氮源對菌株生長的影響，菌株接種量均為1%，37 ℃培養24 h，生長曲線儀測定菌體的OD600。

1.3.3 無機鹽的確定

在MRS 培養基中分別加入磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、三水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨，研究不同無機鹽對植物乳桿菌AR307 生長的影響，又研究了復配無機鹽及不同濃度的無機鹽對菌株生長的影響，菌株接種量均為1%，37 ℃培養24 h，生長曲線儀測定菌體的OD600。

1.4 BOX-Behnken 響應面實驗

響應面設計（Box-Behnken）原理，選取對植物乳桿菌AR307 生長影響較大的單因素碳源、氮源、無機鹽為自變量，以OD600（分光光度計）為響應值，得到其在各個影響因素下的最大值，設計響應面實驗，以確定植物乳桿菌AR307 生長的培養基成分，實驗因素與水平設計見表1。

表1 實驗因素和水平設計表

2 結果與分析

2.1 碳源對菌株生長的影響

碳源作為微生物生長過程中重要的營養物質，可以為乳酸菌生長提供能量，加快物質向細胞的傳輸速度，加快細胞的合成和新陳代謝，促進乳酸菌的快速增殖[11]。不同碳源對植物乳桿菌AR307 生長與產生的影響如圖1（a）所示，在以麥芽糖為碳源時，AR307 生長最快，OD600在培養至12 h 時達到1.6，這與董子興等[12]的研究結果一致，菌株對殼聚糖、木糖、淀粉、抗性糊精等的利用率較低，幾乎不生長，因此確定麥芽糖為最佳碳源。接下來，對麥芽糖的添加量進行探究，如圖1（b）所示，結果發現隨著添加量的增加，菌體密度逐漸增加，在麥芽糖濃度為3%后呈下降趨勢，這可能由于碳源濃度過高，抑制了植物乳桿菌AR307 的生長，最終選取2.5%、3%、3.5%作為響應面的三個濃度。

圖1 不同碳源優化的生長曲線圖

2.2 氮源對菌株生長的影響

氮源作為微生物生長的重要營養素，主要用于蛋白質、氨基酸、核酸和輔酶等物質的合成[13]。蛋白胨含有豐富的氨基酸，特別是含硫氨基酸較多，還含有細菌生長所需的維生素和其他生長因子，是各種培養基制備的基礎原材料，主要作用是提供氮源。本研究將MRS 培養基中的氮源替換為酵母浸粉、牛肉浸出粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨及復合氮源，發酵24 h，測定其生長曲線，探究不同氮源對植物乳桿菌生長的影響。如圖2（a）所示，添加單一氮源酵母浸粉、牛肉浸出粉、酪蛋白胨的效果與添加復合氮源的效果存在一定的差異，例如單純添加胰蛋白胨可以抑制菌株生長，但復合氮源可以促進菌體生長，因此考慮對幾種氮源進行復配使用，既可以滿足菌體生長的需求，又可以降低成本，取得更好的效果[14]。當酵母浸粉、牛肉浸出粉、酪蛋白胨的添加比例為1∶1∶1 時最有利于植物乳桿菌生長。接下來，對復合氮源的添加量進行探究，結果如圖2（b）所示，隨著氮源添加量的增加，菌體密度逐漸增加，當氮源添加量為1.5%時，菌體密度達到1.63；但當添加量超過1.5%時，菌體密度降低。這可能是由于植物乳桿菌在生長過程中需要足夠的氮源，濃度較低營養不充分會影響其生長，但濃度過高又會使有機酸不斷積累從而抑制菌株生長，最終選取1.5%、2%、2.5%作為響應面的三個濃度。

圖2 不同氮源優化的生長曲線圖

2.3 無機鹽對菌株生長的影響

乳酸菌高密度培養過程補充的無機鹽主要是作為緩沖物質，來調節菌體生長過程中pH 的變化的，維持適宜乳酸菌生長的pH 環境，延長發酵劑的活性[11]。磷酸鹽在培養基中具有調節pH 和緩沖等作用，在MRS 培養基中添加相同比例的單一無機鹽或復合無機鹽，考察不同緩沖鹽對菌株生長的影響，以菌株生長OD600值的大小為標準，如圖3（a）所示，選用磷酸氫二鉀時菌體密度最大，最終確定無機離子為磷酸氫二鉀。進一步對磷酸氫二鉀的添加量進行了濃度試驗，結果顯示隨著添加量的增加，菌體密度呈現先上升后下降的趨勢如下圖3（b），最終選取0.7%、0.8%、0.9%三個濃度開展響應面實驗。

圖3 不同無機鹽優化的生長曲線圖

2.4 響應面優化試驗

根據單因素試驗的結果，以碳源添加量、氮源添加量、無機鹽添加量為影響因素，以OD600為響應值，進行三因素三水平的響應面分析，進一步優化培養基的添加比例。選取三因素的Box-Behnken 擬合二階響應面三水平設計，共17 個試驗點，其中12 個為分析因子，5 個為零點，響應值Y 為OD600，試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

對響應面設計表進行多元二次回歸擬合，建立OD600的回歸模型如圖表3 所示。回歸方程Y=6.2+0.39X1+0.088X2+0.1X3-0.23X1X2+0.1X1X3+0.1X2X3-0.54X12-0.29X22-0.71X32，其中A、A2與C2為極顯著差異（P＜0.01）。模型擬合的決定系數（R2）和校正決定系數（RAdj值）分別為0.907 2 和0.787 9，C.V.%為5.29＜10，說明該實驗的可信度和精確度較高，模型的P＜0.01，具有顯著性，失擬項P 值為0.051 1，不顯著（P＞0.05），表明模型的顯著性較好，各因素對植物乳桿菌AR307 的影響次序為碳源＞無機鹽＞氮源，其中碳源的影響最大[15]。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗

圖4 是回歸方程得到的曲面與等高線圖，主要反映了碳源、氮源與無機鹽之間的相互作用，碳源與無機鹽對菌株OD600的交互效應較強，表現為響應曲面較為陡峭；碳源與氮源對菌株OD600的交互作用次之；氮源與無機鹽對菌株OD600的交互效應較差，表現為響應曲面較為平緩。由方程可知，二項式系數為負值，表明方程擁有最大值。利用Design-Expert10.0 分析計算，最適發酵培養基為碳源添加3.5%、氮源添加2.21%、無機鹽添加0.75%，此時的OD600值最大為6.4。

圖4 各因素交互作用對AR307 菌株OD600 的影響曲面和等高線

3 結論

本研究對植物乳桿菌AR307 發酵培養基的組成成分及添加量進行了優化，以單因素實驗與響應面Box-Behnken 實驗建立了二次多項式回歸模型。單因素試驗確定促進菌株生長的最優碳源為麥芽糖、氮源為復合氮源、無機鹽為磷酸氫二鉀，由回歸方程的擬合結果得知菌株生長的最佳碳源添加量為3.5%、氮源添加量為2.21%、無機鹽添加量為0.75%，確定了植物乳桿菌AR307 的最適培養基。在此優化條件下，植物乳桿菌AR307 的OD600值為6.4，菌體密度得到了提升，植物乳桿菌發酵培養基優化的研究為今后工業化生產植物乳桿菌奠定了基礎，具有較好的經濟效益、社會效益和發展前景。