細菌外膜囊泡在疫苗領域的應用研究進展

吳婭芳，胡展馳，王 毅，權春善

大連民族大學生命科學學院，遼寧 大連 116600

1963 年，研究人員通過電子顯微鏡首次在細菌的細胞壁處發現了外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）[1-2]，因對其組成、結構和功能均不清楚，固認為其是細胞凋亡所產生的細胞碎片[3]。1987年，Johnstone 等[4]發現羊網狀細胞能夠分泌納米級囊泡，并將其命名為外泌體（exosome）。此后，越來越多文獻開始報道革蘭氏陰性菌可分泌類似外泌體的囊泡[5]，功能與細胞外泌體相似，被稱為細菌外膜囊泡。1999 年，Beveridge 等[6]對銅綠假單胞菌OMVs 的系列研究最早揭示了OMVs 的天然殺菌活性及其成為抗菌藥物載體的潛力。至此，對OMVs 的研究開始引起了人們的廣泛重視。起初人們對OMVs 的研究主要集中于對其功能的探索，但隨著對OMVs 生物合成、組成分析的深入研究，OMVs 的結構、生物學作用和免疫作用逐漸清晰了起來。隨著研究的不斷深入，OMVs 已被認為是疫苗研發過程中潛在的疫苗抗原候選物之一。本文對OMVs 的結構研究及其在疫苗相關領域的應用進展進行綜述，以期為OMVs 在疫苗開發領域、藥物遞送系統，乃至抗菌劑、靶向治療腫瘤等醫學領域的應用研究提供參考和理論支撐。

1 細菌外膜囊泡

1.1 合成機制

OMVs 起初被認為是細菌裂解的副產物，但隨后OMVs 被證實是由原核微生物分泌產生的，有關其產生的具體機制開始變得說法不一[7]。目前被大部分學者普遍接受的觀點是，OMVs 的形成及其攜帶的物質并不是隨細菌死亡而隨機產生的，而是存在一種精細有序的調控過程[8]。當前研究認為OMVs的生物合成調控機制主要包括三種，即壓力聚集、膜交聯調節、脂類富集，如圖1 所示。

圖1 細菌外膜囊泡的合成機制示意圖

細胞周質中存在大量肽聚糖片段和錯誤折疊的蛋白質以及一些促進膜囊泡等物質生成的異常組分，這些異常組分的局部堆積和富集會給細胞膜造成壓力，降低包膜的完整性，使肽聚糖層由外膜層分離，向外突出形成OMVs[9-10]。如幽門螺桿菌[11]和波伊德志賀菌[12]就是通過這種調節機制產生OMVs 的。

革蘭陰性菌的膜結構分為內膜層、肽聚糖層（PG）和外膜層3 層[13]。周質腔中的脂蛋白（lipoprotein，LPP）可以通過Lpp-PG 的方式連接細菌的外膜層和肽聚糖層，使其被分解或破壞，導致外膜層和肽聚糖層兩層之間的連接變得不穩定，最終導致外膜凸起形成球狀囊泡，引發OMVs 的產生和釋放[1]。與之相反，如果缺少mDAP-mDAP 肽連接，就會引起Lpp-PG 連接的上升，導致OMVs 的產量下降[9]。如大腸桿菌和沙門氏菌在缺少ompA 的情況下，OMVs 的產量會顯著上升[14-16]。

外膜中富集有大量脂質，這些脂質會影響膜的曲率與流動性，因此脂質可能會在OMVs 的分泌形成過程發揮關鍵作用。有研究指出，當在外膜中加入修飾過的脂多糖（lipopolysac-charide，LPS）或磷脂等成分后，外膜的曲率會發生變化，從而誘導更多OMVs 的形成與釋放[1，17]。此外，溫度變化也會影響OMVs 的產量。溫度的調節會影響膜上脂質的流動性，但溫度對不同種屬菌類的影響也不同。在大腸桿菌中，隨著溫度升高，膜上脂類的流動性會不斷增強，OMVs 的產量會增加；而在銅綠假單胞桿菌中，溫度升高12 ℃或14 ℃都不會改變OMVs 的產量[18]。

1.2 結構和組成

OMVs 是一種由雙層膜包裹的球狀納米顆粒，直徑范圍為20～250 nm。但這種結構并不是絕對的。有研究發現，除了OMVs 雙層膜球形結構，研究人員在某些古細菌（Archaebacteria）上還發現了管型、細長型等其他結構類型[19]。OMVs 主要由細胞外膜的成分組成，包括豐富的外膜蛋白、脂多糖、肽聚糖以及一系列與宿主組織黏附和侵襲有關的毒力因子，同時也包含一些細胞內成分，例如DNA，RNA 和酶等，這些組成成分同樣決定了其對細菌多種生物過程的影響能力，包括生物膜的形成、DNA 轉移、細胞代謝物和毒力因子的運輸等。隨著蛋白質組學技術的進步，在OMVs 中已經鑒定出了很多不同功能類別的蛋白質[20]。如參與細菌對宿主黏附和侵染的OM蛋白（OmpA、OmpC 和OmpF）和周質蛋白（AcrA、堿性磷酸酶）。

脂質是OMVs 的重要結構成分。Horstman 等[21]報道大腸埃希桿菌OMVs 以甘油磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和心磷脂為主要脂質，這些脂質與OMVs 的曲度有關。有研究報道OMVs 中亦存在一些不屬于細菌外膜成分的脂質[22]，還有些學者猜測OMVs 所包含的核酸是細菌裂解殘留物偶然滲入的，也有學者認為其生物發生過程并非偶然現象[23]。

1.3 生物學作用

幾乎所有的革蘭氏陰性菌都會產生OMVs，可見OMVs 的存在對細菌的意義之大。目前普遍認為OMVs 對革蘭氏陰性菌的生物學作用主要包括信息交流、營養攝取、防御作用和環境壓力耐受這四個方面。OMVs 裝載了多種來自親本細菌的生物分子和外源性生物分子，這些生物分子會隨OMVs 的傳遞進行細胞間的信息交流。如銅綠假單胞菌外膜囊泡包裹喹諾酮信號（PQS）分子，喹諾酮信號分子以OMVs 為載體，在細菌群體內進行信息傳遞。

OMVs 所含的組分十分復雜，包含許多可以降解生物大分子的酶類物質。因此，當細菌所生活的環境中存在某些大分子類物質時，OMVs 便可以將其降解并使其被細菌吸收利用。此外，OMVs 還可以與細菌細胞膜融合，有助于細菌獲取營養物質。如百日咳桿菌外膜囊泡可充當鐵輸送系統，在鐵限制的條件下可以補充百日咳桿菌的生長缺陷[24]。

病原體定植于宿主組織的惡劣環境中時可能會遇到多種壓力源，病原體為了對抗壓力和生存，就會建立多種防御機制，其中之一就是釋放OMVs。OMVs 在此過程中會充當誘餌，保護細菌細胞免受抗生素、抗菌肽和噬菌體等的傷害。如在對鮑氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii）的研究中發現，β-內酰胺酶基因blaOXA-24 為陽性的OMVs 可以將其傳遞給陰性菌株使其獲得耐藥基因[2，25]。

OMVs 的形成理論中有這樣一種觀點，即釋放出來的OMVs 可以攜帶菌體本身合成的一些錯誤折疊的蛋白或過量的肽聚糖片段，是細菌處理“垃圾”的一種方式。細菌也可以通過釋放OMVs 將這些垃圾釋放出去，從而減輕其環境壓力。如用環氧沙星處理銅綠假單胞菌，該細菌便會通過釋放OMVs 來抵抗不良生存環境[1]。

2 細菌外膜囊泡在疫苗研發中的應用

2.1 作為候選疫苗

OMVs 疫苗可以誘導機體產生高抗體，使其具有更高的有效性。研究表明，OMVs 中含有眾多抗原蛋白且不具有復制能力，接種OMVs 疫苗可以誘導機體產生多種具有殺菌活性的抗體，且其在動物模型中具有免疫保護功能[26]。這一特質使OMVs 成為了疫苗研發環節的優質候選抗原。

OMVs 疫苗作為一種極具潛力的疫苗種類，具有成本低、可以誘導有效的保護性免疫應答等優點。2013 年，商品名為Bexsero 的針對引發流行性腦脊髓膜炎而研發生產的B 型腦膜炎耐瑟菌OMVs 疫苗在歐洲成功獲批上市，并在古巴、智利、挪威和新西蘭等地投入使用[27]。除了針對腦膜炎球菌的OMVs疫苗，結核分枝桿菌[28]、金黃色葡萄球菌[29]等其他細菌的OMVs 疫苗也正處于研發階段。此外，用于治療萊姆病的腦膜炎奈瑟菌OMVs 疫苗[30]，治療產腸毒素大腸桿菌的霍亂弧菌OMVs 疫苗[31]，治療肺炎的鼠傷寒沙門菌OMVs 疫苗[32]以及治療肺結核的異源OMVs 疫苗[33]等也正處于研究過程中。這些疫苗的研發不僅說明OMVs 在B 群腦膜炎球菌疫苗領域的研究已經得到了廣泛認可，更證明了OMVs 作為候選抗原的優勢和發展前景[34]。

除此之外，有些菌的OMVs 疫苗還可以用來緩解患者的炎癥。如百日咳菌的OMVs 疫苗在降低患者炎性反應的同時，也具有與其他疫苗相同的保護作用[2]。

2.2 作為佐劑

疫苗佐劑（adjuvant）能夠非特異性地改變或增強機體對抗原的特異性免疫應答，誘發機體產生長期、高效的特異性免疫反應，增強機體的保護能力，與此同時還可減少免疫物質的用量，降低疫苗的生產成本。目前關于佐劑的研究主要集中于兩方面，一是受體激活劑，二是疫苗的遞送系統[35-36]。OMVs 表面的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）的典型激活劑。激活這些信號通路不僅可以誘導細胞釋放大量可以介導多項免疫反應的促炎性細胞因子，還可以促進抗原遞呈細胞成熟并用于激活適應性免疫[1]。由此可見，OMVs 表面的LPS 可以作為很好的免疫激活劑，且具有很大的研究價值。

將OMVs 用作佐劑的研究可以追溯到二十世紀末[37]。在HIV 疫苗的研究過程中，OMVs 佐劑被證明可以誘導T 細胞反應[38]。Nagaputra 等[39]研究表明，脂多糖（LPS）修飾糖型（LgtB-LpxL1）與非修飾糖型Lpxl1 血清組腦膜炎球菌H44/76 天然外膜囊泡（nOMVs）對重組腦膜炎球菌蛋白、破傷風類毒素或腦膜炎球菌C 血清群莢膜多糖等具有佐劑作用，能夠取得與傳統佐劑相同甚至優于傳統佐劑的效果。

2.3 作為藥物遞送系統

OMVs 相對穩定，可以保護內部物質免受細胞內核酸酶與蛋白質水解酶降解[21，40-41]。有研究表明，OMVs 可在4 ℃下長期儲存，甚至在短暫的高溫作用下仍能保持酶活性和抗原性[42]。而且，其不會因長距離運輸而降解，由此可解決疫苗長距離運輸抗原活性低的問題。有研究表明，利用基因工程技術可使OMVs 負載的抗原不僅可以暴露于OMVs 表面，也可以負載于OMVs 的腔體中[43-44]。上述技術優勢一方面可以保護OMVs 內的抗原，另一方面還可以于OMVs 表面在其他外源抗原的幫助下將內部抗原靶向遞呈于抗原遞呈細胞中。

目前OMVs 領域一個新的研究方向是將異源抗原表達于OMVs 表面從而構建新疫苗。目前，已有學者通過基因工程改造技術將甲型流感病毒的基質蛋白M2 異源表達于大腸桿菌的外顯子中，并成功表達出了包含此蛋白的OMVs，通過動物實驗進行臨床檢驗，證明此種方式制得的疫苗可以抵抗同型流感病毒的攻擊[45]。OMVs 疫苗相較其他疫苗具有更高的可修飾性，可通過基因工程等手段加強疫苗的靶向性，由此可見，OMVs 疫苗擁有更廣泛的研究方向。

3 細菌外膜囊泡的其他領域的應用

3.1 作抗菌劑的研究

細菌需要附著于宿主細胞并定植在相關組織中，然后再擴散到其他組織，才能感染機體[46]。目前，已經出現了一種通過使用抗菌黏附劑來抑制細菌的黏附作用從而治療感染的新型抗菌治療方法，其被稱為抗菌黏附療法[47]?？咕じ絼┲饕ㄟ^破壞細菌上的黏附素或競爭性，與宿主細胞結合來抑制細菌與宿主細胞結合[48]。

OMVs 中含有較多細菌黏附素，這種性質決定了OMVs 可以競爭性地與宿主細胞結合，起到抗菌黏附劑的作用。Zhang 等[49]通過帶有黏附素的幽門桿菌OMVs 包裹納米顆粒，構建了一種抗菌黏附劑納米平臺。其實驗結果顯示，該OMVs 納米平臺能夠降低幽門桿菌對宿主細胞的黏附性，同時，通過對小鼠胃組織幽門桿菌的研究也證實了該OMVs 可以削弱細菌的黏附作用。

3.2 在醫療用藥方面的應用

OMVs 對細菌的一個重要作用就在于可以為其提供適宜的生存環境。細菌在產生應激反應對會產生更多OMVs，而抗生素就是刺激細菌產生OMVs的因素之一。腸出血性大腸埃希菌分泌的志賀毒素2a 會引起溶血性尿毒綜合征。研究發現[50]，磷霉素、環丙沙星等抗生素會刺激出血性大腸埃希菌O104:H4 和O157∶H7 產生OMVs，其中，環丙沙星還會使OMVs 中的志賀毒素含量增加。因此，治療此類患者時不應使用上述抗生素。同時，細菌遇到抗生素發生應激反應產生OMVs 的性質也可以應用于OMVs 的制備過程中。

3.3 抗腫瘤應用研究

OMVs 作為一種不具有分裂能力、穩定度較高的納米粒子，包含母體細菌的主要免疫原性蛋白質，可以有效激活免疫系統，特異性殺傷異常的腫瘤細胞，同時還可以高效轉運藥物。以上性質使OMVs 成為了一種治療腫瘤的新型手段[26]。

正常情況下，人體的免疫系統可以識別并清除腫瘤細胞，但腫瘤細胞可以通過破壞抗腫瘤-免疫循環，實現“免疫逃逸”，得以不受控制地生長。腫瘤免疫治療主要通過重新激活機體的抗腫瘤-免疫循環來殺死腫瘤細胞[51-52]。Li 等[53]通過融合大腸桿菌OMVs 和黑色素瘤細胞膜（TCMs）即BTs，整合PLGA 到BTs 中作為核心形成BTs@PLGA，開發有效的囊泡疫苗。BTs@PLGA 的治療顯著增強了DC靶向、DC 成熟、腫瘤抗原呈遞以及抗原特異性T 細胞的反應，具有良好的抗腫瘤治療效果。

4 總結與展望

鑒于上述OMVs 疫苗區別于其他疫苗的優點，以及已開發的OMVs 疫苗平臺，我們可以看出OMVs 疫苗應用領域廣泛且擁有良好的發展前景。OMVs 疫苗的應用研究已成為國內外研究的熱點，但是，目前有關OMVs 疫苗的研究和應用主要是針對細菌引起的相關疾病，而針對病毒研發的OMVs疫苗卻少之又少。

2019 年末新型冠狀病毒肺炎肆虐中國，開發擁有長效免疫能力且能夠應對不同變種新型冠狀病毒的疫苗是預防疾病、增強機體抵抗力的一種高效方法。目前市場上常見的針對新冠病毒的疫苗主要分為三種，一是新冠滅活疫苗，二是新冠腺病毒載體疫苗，三是新冠重組蛋白疫苗。雖然這三種病毒均對抑制新冠肺炎具有一定的有效性，但都各有缺點，并且在注入人體后均會引發一系列不良反應，而有研究證明百日咳菌的OMVs 疫苗在使機體產生的炎癥反應更少的情況下，可以起到相同的保護作用[2]，由此可推斷新冠病毒的OMVs 疫苗也可能擁有相同的防護效果。因此，研制針對新冠病毒的OMVs 疫苗具有重要的研究價值和應用前景。