如何快速高效分離李斯特菌屬

賀炎娜，李 丹，張云鮮，王 丹，王海蕓，崔永靜

蒙牛乳業（焦作）有限公司，河南 焦作 454000

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）常出現于土壤中，是以死亡的和正在腐爛的有機物為食的腐生菌，能產生溶血素，引起人類發燒、腹瀉、頭痛、發冷、惡心、肌痛等癥狀，也是肉制品、乳制品、魚類、冷藏類食品中的一種污染物，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎，對人類健康危害較大。

對于單增李斯特氏菌，檢驗技術機構采用國家標準法作為基礎方法進行檢驗。如何有效地鑒別單核細胞增生李斯特菌，則需要與其他相似菌進行對比試驗，在試驗過程中記錄生理生化試驗結果的相同點及不同點，從而準確快速地分辨單核細胞增生李斯特菌。

從2021 年開始，本實驗室陸續購入李斯特菌屬的標準菌株：英諾克李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌。依據GB 4789.30-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[1]，人為地將李斯特菌屬的標準菌株添加至樣品中，在連續的試驗中觀察對應標準菌株的菌落形態、生化及溶血試驗，從而找出不同菌株的差異性，提升實驗人員的綜合水平。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

標準菌株：伊氏李斯特氏菌ATCC19119[美國菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC）]、斯氏李斯特氏菌CICC35967、英諾克李斯特氏菌CICC10417、單增李斯特氏菌CICC21635[中國工業微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）]。

含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉湯（Trypticase Soy-Yeast Extract Agar，TSA-YE）、BHI 肉湯（Brain Heart Infusion Broth）、血瓊脂平板、PALCAM 瓊脂基礎（PALCAM Agar Base）、李斯特氏菌顯色培養基（Listeria Chiomogenic Medium）、半固體培養基（Motility Test Medium（Semisolid））、單增李斯特氏菌干制生化鑒定試劑盒（Listeria Monocytogenes Dehydration Biochemical Identification Kit）、3%過氧化氫溶液、PALCAM 選擇性添加劑、革蘭氏染色液（GRAM STAIN SETS）試劑盒。以上培養基均來源于北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器

BSP-250 生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、SPX-250B 生化培養箱（上海福瑪實驗設備有限公司）、BSC-1300ⅡA2 生物安全柜（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、培養皿（玻璃培養皿或一次性培養皿）、18 mm×180 mm 試管、接種針及對應的滅菌裝置（如酒精燈或紅外滅菌器）、Primo Star 顯微鏡（卡爾蔡司股份公司）、VITEK 2 COMPACT 微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司）。

1.3 實驗方法

參照GB 4789.30-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》方法。

1.3.1 菌種的活化

標準菌株需從專業從事微生物菌種保藏管理的機構處獲得，嚴格按照標準菌株附帶的操作流程活化。實驗室按照相應的操作流程將菌株活化后，將其保存在營養肉湯中，同時添加10%～15%的甘油作為冷凍保護培養基[2]，獲得標準儲備菌株，并將其貯存在（-20±2）℃的專用冰柜中。

1.3.2 菌種的復活

將上述活化后的菌株取出，分別放置在營養肉湯或BHI 肉湯（Brain Heart Infusion Broth）中（36±1）℃培養18～24 h。

1.3.3 劃線分離與純化

使用李斯特氏菌顯色培養基（Listeria Chiomogenic Medium）和PALCAM 瓊脂基礎（PALCAM Agar Base）劃線培養后的營養肉湯或BHI 肉湯，于（36±1）℃培養（24±2）h 后，觀察菌落形態。同時將上述平板上的菌落劃線純化至TSA-YE 平板上，進行后續的鑒定實驗。

1.3.4 鑒定

①染色鏡檢；②動力試驗；③生化鑒定：用3%過氧化氫溶液及干制生化試劑盒鑒定，生化試劑盒包含木糖、鼠李糖、MR-VP、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、七葉苷；④溶血試驗：穿刺接種；⑤使用VITEK 2 COMPACT 微生物鑒定儀進行鑒定[3]。

2 結果與分析

2.1 分離與純化

不同菌株在相應培養基上的菌落形態見表1。由于試驗過程中使用非選擇性增菌培養基TSAYE，故在TSA-YE 生長的菌株均為乳白色，從菌落形態上無法進行區分。

表1 各菌株在不同培養基上的生長情況

2.2 鑒定

2.2.1 染色鏡檢

挑取TSA-YE 平板上的菌落進行染色鏡檢見圖1。鏡檢結果表示，四種標準菌株均為革蘭氏陽性短桿菌。

圖1 顯微鏡下的形態

2.2.2 動力試驗

使用接種針將TSA-YE 平板上的菌落穿刺至半固體培養基中，于（30±1）℃培養48 h～5 d。半固體生長狀態見圖2。

圖2 半固體動力培養基中的形態

2.2.3 生化鑒定

生化鑒定結果見表2，MR-VP、葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、過氧化氫酶試驗無法區分斯氏李斯特氏菌CICC35967、英諾克李斯特氏菌CICC10417、伊氏李斯特氏菌ATCC19119、單增李斯特氏菌CICC21635四種菌株。伊氏李斯特氏菌ATCC19119、斯氏李斯特氏菌CICC35967 鼠李糖和木糖的結果分別為（-）、（+），英諾克李斯特氏菌CICC10417、單增李斯特氏菌CICC21635 鼠李糖和木糖的結果分別為（+）、（-），這兩個試驗可進行有效區分。

表2 各菌株的生化鑒定結果

2.2.4 溶血試驗

單增李斯特氏菌產生狹窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產生弱的透明溶血圈，英諾克李斯特氏菌無溶血圈，伊氏李斯特氏菌產生寬的、輪廓清晰的β-溶血區域。

2.2.5 VITEK 2 COMPACT 微生物鑒定儀鑒定

利用VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統對伊氏李斯特氏菌ATCC19119、斯氏李斯特氏菌CICC35967、英諾克李斯特氏菌CICC10417、單增李斯特氏菌CICC21635 四種菌株進行鑒定，磷脂酰磷脂酶C（PIPLC）、D-木糖（dXYL）、α-葡萄糖苷酶（AGLU）、α-甘露糖苷酶（AMAN）、酪氨酸芳胺酶（TyrA）、多粘菌素B 耐受（POLYB）、乳糖（LAC）、新生霉素耐受（NOVO）、6.5%NaCl 生長（NC6.5）、D-海藻糖（dTRE）等10 項檢測結果不一致，其余33 項生化鑒定結果一致，結果分別判定為伊氏李斯特氏菌（93%概率）為非常好的鑒定，斯氏李斯特氏菌（97%概率）為極好的鑒定，英諾克李斯特氏菌（99%概率）為極好的鑒定，單核細胞增生李斯特氏菌（99%概率）為極好的鑒定。

3 結論

本研究表明，菌株的關鍵特性在試驗中可快速、高效的區分與分離，同時木糖和鼠李糖試驗可初步篩選區分4 株標準菌株。未來可以通過科學技術，將木糖和鼠李糖加入鑒別培養基中，在劃線分離步驟中通過顏色信息進行區分，縮短試驗過程，提高檢測效率。