艾葉總黃酮提取工藝優(yōu)化和抗氧化活性的初步探究

張小鳳，曾穎欣，周麗萍，黃麗華，凌海燕

肇慶學(xué)院，廣東 肇慶 526061

現(xiàn)代藥理研究表明，艾葉中富含的黃酮類(lèi)化合物具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理活性[1]。本篇初步探究艾葉黃酮類(lèi)化合物的提取方法及其相應(yīng)的抗氧化活性作用，以期為進(jìn)一步優(yōu)化提取艾葉中黃酮類(lèi)化合物的工藝條件和抗菌活性作用的研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

艾新鮮葉片：采摘于肇慶學(xué)院生物園。純水、DPPH、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸緩沖液（0.2 mol/L）、無(wú)水乙醇、TCA、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、K3[Fe（CN）6]、FeCl3、CH3OH、FeSO4、H2O2、C7H6O3等。

電熱鼓風(fēng)干燥箱、粉碎機(jī)、電子天平、超聲波清洗器、可見(jiàn)分光光度計(jì)、循環(huán)水真空泵等。

1.2 方法

1.2.1 工藝提取流程

將艾葉清洗、擦干，稱(chēng)量其鮮重（FW）；烘干，稱(chēng)量其干重（DW）；按以下公式計(jì)算艾葉含水量（WC）：

艾葉粉碎→稱(chēng)取粉末→加入乙醇溶液→浸泡4 h→超聲波提取→減壓抽濾→艾葉總黃酮提取液→進(jìn)行含量測(cè)定和抗氧化活性測(cè)定及分析。

1.2.2 艾葉黃酮的提取

保持其他條件不變，測(cè)定艾葉黃酮的提取量受浸取液乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL）、超聲提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）各因素的影響。

為減少繁多的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，使用以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的正交法，選擇不同的正交試驗(yàn)因素與水平，詳見(jiàn)表1，以此優(yōu)化提取工藝條件并進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.3 艾葉黃酮含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為試樣，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法并測(cè)定吸光度值，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取不同提取條件處理的0.5 mL 艾葉黃酮提取液，將其移到25 mL 容量瓶里并加入6 mL 純水，艾葉黃酮的測(cè)定同樣按照比色法測(cè)定其吸光度值，艾葉黃酮的含量可代入得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中算出。

1.2.4 艾葉黃酮的抗氧化活性

測(cè)定不同質(zhì)量濃度（0.125、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的艾葉黃酮對(duì)DPPH·清除能力的吸光度值，并參考黃麗華等[2]文獻(xiàn)中DPPH·清除率公式計(jì)算。黃酮對(duì)·OH 清除能力的測(cè)定。測(cè)定不同質(zhì)量濃度（0.125、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的黃酮提取液對(duì)·OH清除能力的吸光度，并參考黃麗華等[2]文獻(xiàn)中·OH清除率公式計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾葉含水量測(cè)定

植物的水分狀況對(duì)植物的生理活動(dòng)有著極重要的影響，植物的含水量是衡量植物生長(zhǎng)的重要指標(biāo)之一。測(cè)量艾葉的含水量，取平均值，得到艾葉含水量為85.8%。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)測(cè)定，變量為蘆丁質(zhì)量濃度c（mg/mL），隨機(jī)變量為吸光度A，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1，可得回歸方程：A=12.775c - 0.01，R2=0.999 4，表明在測(cè)定濃度區(qū)間內(nèi)趨于線性關(guān)系。上述結(jié)果可用作推導(dǎo)艾葉黃酮提取量。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)艾葉黃酮得率的影響

黃酮類(lèi)化合物一般易溶于甲醇、乙酸乙酯等溶劑中，其中乙醇毒副作用小，被選為提取溶劑。由圖2 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，艾葉黃酮得率呈上升趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，黃酮得率為2.894%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)艾葉總黃酮得率的影響

2.3.2 料液比對(duì)艾葉黃酮得率的影響

根據(jù)溶解平衡原理，未溶解的黃酮與已溶解的黃酮處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)料液比增加的時(shí)候，黃酮溶出速度減慢；黃酮進(jìn)入溶劑的同時(shí)，一些其他成分化合物也會(huì)浸出，從而起到阻礙作用；隨著料液比增加，艾葉黃酮得率總體呈下降趨勢(shì)。由試驗(yàn)結(jié)果得出，艾葉黃酮提取最佳料液比為1∶25（g/mL），得率為2.442%。

2.3.3 超聲提取時(shí)間對(duì)艾葉黃酮得率的影響

艾葉黃酮濃度隨著超聲提取時(shí)間的增加而略微下降，隨后緩緩上升，但總體變化不明顯。根據(jù)結(jié)果，50 min 為適宜提取時(shí)間。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

本正交試驗(yàn)的試驗(yàn)指標(biāo)為提取率。艾葉黃酮的提取率受浸取液乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲提取時(shí)間（C）因素的交叉影響[3]。

每個(gè)因素下對(duì)應(yīng)水平1 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的和為K1值，以此類(lèi)推各個(gè)因素對(duì)應(yīng)其余水平的K 值；每個(gè)因素下K 值的最大值減最小值為R 值。進(jìn)行極差分析，范圍誤差最小的是超聲提取時(shí)間，范圍誤差最大的是浸取液乙醇體積分?jǐn)?shù)，說(shuō)明艾葉黃酮提取率受超聲提取時(shí)間的影響不顯著，而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)其影響最大，對(duì)比以上3 個(gè)因素的影響程度主次排列為：提取時(shí)間＜料液比＜乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.5 最佳提取條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)結(jié)果可知，黃酮最高得率達(dá)到3.53%是在兩個(gè)變量為80%乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比1∶25 條件下實(shí)現(xiàn)的。因此，綜合結(jié)果來(lái)看，用80%乙醇溶液浸取1∶25（g/mL）超聲輔助提取50 min，提取率最高。

2.6 艾葉黃酮提取液的抗氧化活性分析

2.6.1 艾葉黃酮提取液的總還原能力

艾葉黃酮吸光度隨著提取液濃度升高而整體呈上升趨勢(shì)，表示艾葉黃酮的總還原能力增強(qiáng)，其抗氧化活性相應(yīng)加強(qiáng)。樣品濃度（x）與吸光度（Y）間的回歸方程為Y=3.625 1x+0.253 2，R2=0.990 6。

2.6.2 艾葉黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除作用

黃酮質(zhì)量濃度為0.125～0.25 mg/mL 內(nèi)的區(qū)間，DPPH·的清除率隨著濃度增加發(fā)生急劇上升；而黃酮為0.25 mg/mL 后的濃度區(qū)間，清除率隨著濃度的增加而趨于平緩增長(zhǎng)的趨勢(shì)，清除率總體呈“S”型增長(zhǎng)曲線關(guān)系。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得出，最大清除率為96.35%。因此，艾葉黃酮對(duì)DPPH·有很好的清除作用。

2.6.3 艾葉黃酮提取液對(duì)·OH 的清除作用

如圖3 所示，對(duì)·OH 的清除率隨著提取液濃度上升而升高，整體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。數(shù)據(jù)顯示，對(duì)·OH 的清除率在0.5～1 mg/mL 區(qū)間質(zhì)量濃度內(nèi)急劇上升，隨著黃酮提取液濃度增加，黃酮提取液對(duì)·OH 的清除率呈正比關(guān)系。消除偶然，增加一組質(zhì)量濃度0.75 mg/mL 的實(shí)驗(yàn)，黃酮提取液對(duì)·OH 的清除率為90.9%。當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為1 mg/mL，黃酮提取液對(duì)·OH 的清除率達(dá)到97.49%，證明其抗活性氧基團(tuán)的能力強(qiáng)，抗氧化活性表現(xiàn)明顯。

圖3 黃酮對(duì)·OH 的清除效果

3 結(jié)論

由上述試驗(yàn)可知，艾葉黃酮的提取受浸取液濃度、料液比、超聲提取時(shí)間等因素不同程度的影響。運(yùn)用正交試驗(yàn)法優(yōu)化，初步選取艾葉黃酮最佳提取的條件，得到的結(jié)果顯示，用80%乙醇溶液浸取1∶25（g/mL）料液比浸泡4 h，超聲輔助50 min 為最優(yōu)提取條件。根據(jù)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)可知，艾葉黃酮具有較強(qiáng)的總還原能力和自由基清除活性，在抗氧化方面具有良好的效應(yīng)，可以作為一種很好的抗氧化劑。國(guó)內(nèi)各領(lǐng)域持續(xù)開(kāi)發(fā)利用艾葉的有效成分，證明其有可利用的價(jià)值。對(duì)艾葉黃酮含量的提取及其抗氧化作用進(jìn)行的初步研究，能為進(jìn)一步深入研究提供新思路。