等溫滴定量熱法研究鎘離子與GMP 的親合機理

于勁松，黃 煦，任方圓，黎瑛婕，李朝霞，阿麗婭，呂欣欣，曹 慧，袁 敏，葉 泰，吳秀秀，郝麗玲，徐 斐

上海理工大學健康科學與工程學院/上海食品快速檢測工程技術研究中心，上海，200093

鎘離子作為一種對人體危害性極大的重金屬離子，是一種世界公認的嚴重污染物，并且很多產品都設立了對鎘含量的限值[1-2]。目前已有的檢測手段，都需要經歷較為復雜的前處理過程，將鎘離子富集和分離[3-5]。而離子印跡技術作為一種重要的重金屬檢測技術已逐漸被運用于很多關鍵領域，離子印跡技術一般以離子為模板，通過靜電作用和配位作用等手段與功能單體結合，形成螯合物，之后以酸性試劑為洗脫劑，將模板離子從螯合物上洗脫[6-8]。最終制備出具有與目標金屬離子相對應的三維孔穴結構的離子印跡聚合物[9]。現如今，離子印跡技術已逐漸被應用于食品，分析化學，工業廢水治理等領域[10-11]。

但值得注意的是，離子印跡檢測技術仍需要進一步完善，其主要問題在于金屬離子半徑過小，且各種金屬離子結構相近，導致目前常用的功能單體都無法做到將特異性與模板離子的特異性相結合[12-13]。基于此。本研究的主要目標就是探究重金屬鎘離子和功能單體鳥嘌呤核糖核苷酸（GMP）的結合機理，為篩選出可以與鎘離子的特異性結合的優秀功能單體提供理論基礎和實驗基礎。

研究中采用等溫滴定量熱法研究二者的親合機理。等溫滴定量熱法（ITC）是一種直接測量雙分子反應過程中熱量釋放或消耗的物理技術，是一種在恒定溫度下配體與大分子接觸的分析方法[14-15]。它根據熱力學的基本原理工作，兩個分子之間的接觸會導致熱量產生還是吸收，往往取決于結合的類型，即放熱或吸熱[16-17]。通過對ITC 結果進行分析，可以定量測定分子結合過程中的化學計量比（N）、親合常數（K）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS）等參數[14]。獲取的這些參數將為研究鎘離子與單體的親合機理提供直接的熱力學數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鎘、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）及氫氧化鈉均購自國藥基團化學試劑有限公司；鳥嘌呤核糖核苷酸（GMP）購自上海寶曼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

等溫滴定量熱儀（ITC200）（美國馬爾文儀器有限公司）；Heraeus TMFresco TM17 離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Brand 普蘭德單道可調移液器（德國普蘭德Brand 有限公司）；磁力攪拌器（IKA）、pH 計（梅特勒托利多）。

1.3 實驗步驟

（1）溶液配制：用pH 7.5 的HEPES 緩沖溶液按實驗所需配制不同濃度的氯化鎘和GMP 溶液。

（2）溶液脫氣：因為等溫量熱滴定法測量的是微量反應熱，溶液中含有氣泡會使實驗結果存在較大的誤差。為了預防產生誤差，在實驗開始前，需要對溶液進行離心，這樣不僅可以使溶液體系均勻，還可以去除其中的氣泡。在配制完溶液后，將其放入離心機中，在25 ℃的條件下，離心5 min。

（3）樣品池加樣：使用專用進樣針抽取離心管中的樣品，在抽取過程中要盡量保證進樣針內無氣泡進入，抽取之量大概為樣針的三分之二。抽取完畢后，將進樣針插入樣品池中，緩慢勻速地將樣品推入樣品池中，直到樣品與樣品池等高。之后用針筒的針頭緩慢攪動樣品池，排出樣品池中的氣泡。

（4）滴定注射器加樣：在樣品進樣完畢之后，將裝有滴定物的PCR 管放到儀器的對應孔中，儀器就會自動抽取一定體積的滴定物。在儀器抽取完滴定物之后，需確認滴定注射器內是否含有氣泡，如果有，則需操作儀器重新取樣，直到滴定注射器中沒有氣泡。

（5）進行等溫量熱滴定實驗：在滴定物裝載完畢后，將滴定物注射器插入樣品池中，按照提前設定好的滴數和相關參數將滴定物加入樣品池中，用滴定物注射器進行攪拌，使滴定物和被滴定物充分結合。

（6）數據處理：將通過ITC 得到的熱反應曲線導入ITC200 配套的original 軟件中，通過軟件計算得出反應熱曲線的各項數值，結合常數K，化學計量比N，焓變ΔH，熵變ΔS。

1.4 試驗設計

本研究選用的緩沖液為非離子緩沖液HEPES。非離子型緩沖液可以減少實驗過程中緩沖背景對電導率測試的干擾。為了研究GMP 與鎘離子的作用機理，實驗分別選取四種比例濃度的GMP 和鎘離子進行反應，分別為：5∶1、8∶1、10∶1 和20∶1，即將5、8、10、20 mmol/L 的氯化鎘分成20 滴逐滴加到1 mmol/L 中的GMP 中。其中探針中氯化鎘的總體積為40 μL，除了第一滴為0.4 μL 外，其他19 滴都為2 μL，GMP 的體積為210 μL。

此外，還需進行背景滴定實驗。分別用5、8、10、20 mmol/L 的氯化鎘滴定實驗所用的緩沖溶液HEPES，使最終結果扣除背景的影響。背景扣除也是采用ITC200 配套的original 軟件進行的。

2 結果與討論

2.1 不同比例的鎘離子與GMP 的等溫滴定量熱研究

2.1.1 鎘離子和GMP 濃度比為5∶1 時的ITC 實驗研究

圖1 是鎘離子和GMP 濃度比為5∶1 時的ITC滴定曲線和OneSite 模型擬合結果，圖中上半部分的兩條曲線分別為鎘離子滴加到緩沖液中所產生的背景熱量和鎘離子與GMP 結合產生的熱量變化曲線。兩條曲線本來都是以縱坐標0 為基線的，但為了方便比較，都將背景熱量向上平移了4 個單位，之后的幾組數據也采用了同樣的處理方式。在整個實驗過程中，一共向GMP 中滴加了20 滴鎘液，除了第一滴鎘液是用來確定基線的，之后每一個峰都代表著一滴鎘液滴加到GMP 中所產生的熱量變化。在這個濃度比中，每個反應峰都在基線以下，說明電源代償的功率為負值，參比池的溫度低于樣品池，由此得知此過程為放熱反應。而終點的峰并未返回基線，說明在這個濃度比中，GMP 未全部與鎘離子結合。

圖1 鎘離子和GMP 濃度比為5∶1 時的ITC 圖譜

圖1 的下半部分，是將圖1 上半部分兩條熱量變化曲線的每個峰值相減，再積分求它們的面積，最后得到19 個數值，擬合出來的就是下邊的曲線，它反映了整個結合過程中的熱量變化。圖的縱坐標為反應的熱量，橫坐標為摩爾比率，在該反應過程中，曲線斜率變化不大，說明該反應是以一種較為均勻的速度進行的。右邊方框里的四個數值分別為結合常數K，化學計量比N，焓變量ΔH，熵變量ΔS。N 值反應了鎘離子與GMP 的反應比例，K 值反應了鎘離子與GMP 結合的性能。在此反應中K 值大約為1.51E 3，說明其結合性能并不理想。焓變值ΔH 和熵變值ΔS 分別代表整個反應過程中的熱量變化和體系混亂程度的變化，在此濃度中，ΔH＜0，ΔS＞0，根據吉布斯函數公式ΔG=ΔH-TΔS，ΔG＜0，說明該反應是一個以焓變為主要驅動力的自發反應，可以在任何條件下自發進行。

2.1.2 鎘離子和GMP 濃度比為8∶1 時的ITC 實驗研究

圖2 是鎘離子和GMP 濃度比為8∶1 時ITC 滴定曲線和OneSite 模型的擬合結果，從上半部分的兩張圖可以看出，比值為5∶1 時，該濃度下熱量變化曲線的最后幾個峰已經接近基線了，但還沒有完全回到基線，說明GMP 仍未反應完全。

圖2 鎘離子和GMP 濃度比為8∶1 時的ITC 圖譜

從圖下半部分的曲線可以看出，一開始斜率較大，之后慢慢趨于平緩，進入了一個平臺期。而右邊的圖框顯示N 值變小了，這是由于鎘離子的濃度變高，其化學計量比下降了。而K 值增加（8.92E 3），說明在該濃度下，鎘離子與GMP 的結合更加穩定了。同時表明，該反應也是一個以焓變為主要驅動力的自發反應。

2.1.3 鎘離子和GMP 濃度比為10∶1 時的ITC 實驗研究

圖3 是鎘離子與GMP 的濃度比為10∶1 時ITC 滴定曲線和OneSite 模型的擬合結果，該圖相較于上述兩個濃度的ITC 曲線明顯不同。從上半部分的圖可以明顯看出整個反應從放熱反應變為了吸熱反應。但在第一個吸熱峰之后存在一個小的放熱峰，所以推測可能同時存在吸熱和放熱兩種反應。

圖3 鎘離子和GMP 濃度比為10∶1 時的ITC 圖譜

從圖的下半部分來看，曲線的構型與前兩個濃度正好相反，說明在該濃度下，而者的結合反應發生了變化。而從圖中的擬合參數可知，N 值高達1.89，幾乎是前兩個濃度的N 值的兩倍，說明鎘和GMP的結合比例大約為2∶1。該濃度比例下，K 值是前兩個濃度的10 倍，但K 值的誤差也較大，為6.01E 4±1.50E 5，說明該比例下的擬合結果不理想。

2.1.4 鎘離子和GMP 濃度比為20∶1 時的ITC 實驗研究

圖4 是鎘離子和GMP 的濃度比為20∶1 時ITC 滴定曲線和OneSite 模型的擬合結果。從圖中上半部分的滴定曲線可知，鎘離子與GMP 的結合延續了10∶1 的濃度比，一開始為吸熱反應，且反應迅速；第6 滴之后，滴定曲線顯示，二者的結合過程從吸熱反應變成了放熱反應；且在第9 滴之后反應趨于穩定，基本與滴定的背景結果值一致。

圖4 鎘離子和GMP 濃度比為20∶1 時的ITC 數據

從圖3 下半部分的模型擬合結果可知，N 值為0.998，說明鎘離子與GMP 是接近并按照1∶1 的比例結合的。該比例下擬合得到的K 值為1.21E 4±2.26E 3，擬合誤差小，結果較為理想。

2.2 不同比例鎘離子和GMP 反應的熱力學擬合結果分析

表1 的結果顯示了不同比例的鎘離子與GMP反應的各個熱力學參數，通過比較四組數據，研究發現當體系中鎘離子濃度較低、GMP 濃度較高時，反應為放熱反應。反應化學計量比也在1 以下，說明此時大分子GMP 與鎘應該只有1 個結合位點，這個結合位點與鎘離子結合會產生放熱反應。但當體系中鎘離子濃度升高且GMP 濃度降低到一定比例時，反應就會變成吸熱反應，同時N 值也會突然升高到1.89，此時鎘離子與GMP 的化學計量比將近2∶1，即一個GMP 結合兩個鎘離子，說明此時GMP 與鎘離子可能存在兩個結合位點。在其他人研究中也出現了類似的情況，周潔和王延華等[18]在用ITC 研究Zn 離子和血清蛋白的結合機制時，發現在反應濃度較低時，只發生放熱反應，但當濃度升高到一定比例時，會同時出現吸熱和放熱反應。他們推斷血清蛋白和Zn 離子有吸熱和放熱兩種結合位點，在濃度較低時，只有放熱結合位點會發生反應，而當濃度升高到一個適當的比例時，放熱反應產生的熱會“激活”吸熱位點，同時發生吸熱和放熱結合。

表1 不同比例鎘離子和GMP 反應的熱力學擬合參數

從熱力學的角度進行分析，在5∶1 和8∶1 時，ΔH＜0，ΔS＞0，根據吉布斯函數，該反應在任何情況下都可以自發進行，而到10∶1 和20∶1 時，ΔH＞0，ΔS＞0，該反應只有溫度T 大于一定程度才會自發發生。而分析下圖的縱坐標得知，起始熱量會隨濃度上升而越來越高，說明初始溫度上升，會使吸熱結合位點自發發生反應。

因此，我們推測在本實驗中GMP 和鎘也可能同時含有吸熱和放熱兩個結合位點，但在濃度較低時，只有放熱結合位點發生結合，N 值小于1。但當濃度到達一個適合的比例時，GMP 的另一個吸熱結合位點就會被激活，此時溶液會同時發生吸熱和放熱兩種結合，且由于吸熱位點的結合能力較放熱位點強很多（K 值較大），反應以吸熱為主，這也可以解釋結合常數K 在反應變為吸熱反應后突然上升的現象。而當反應體系中鎘離子的濃度進一步升高時，鎘離子只與結合能力強的吸熱位點結合，N 值又回到了1 以下。當然此結論都是基于GMP 有吸熱和發熱兩種結合位點的假設，具體結論還有待研究。

2.3 反滴法研究鎘離子與GMP 的結合機理

為了進一步研究鎘離子與GMP 的結合機理，我們采用反滴法，以GMP 為滴定物，鎘離子為被滴物，選擇1∶10 的濃度比進行試驗。滴定和擬合結果如圖5 和表2 所示。

表2 正滴法和反滴法反應的熱力學擬合參數對比

圖5 反滴法（GMP→Cd）濃度比為10∶1 時的ITC圖譜

不同于正滴法，再10∶1 的濃度下，二者的結合過程依然是放熱反應，且反應速度很快，8 滴之后反應基本就結束了。其熱力學參數與正滴法中的放熱反應相似，結合常數K 為6.05E 3±2.38E 3，介于正滴法的5∶2 和8∶1 之間。焓變ΔH＜0，熵變ΔS＞0，ΔG＜0，得知該過程也是一個以焓變力為主要驅動力的自發反應。因為是反滴法，此時的化學計量數與正滴法互為倒數，換算成正滴法應為2.3，說明此時可能已經出現兩個結合位點，但吸熱結合位點的活度不夠，整體反應還是以放熱為主。但反應的焓變相較于前兩種濃度已經降低了很多，且反應的后半段已經出現了吸熱小峰。該體系很可能正處于放熱反應和吸熱反應的交界點附近。總體而言，在同樣的濃度比下，反滴法的結果與正滴法存在很大的差距，說明反應樣品的加入順序對整個反應有顯著影響。

3 結論

離子印跡技術作為一種特異性檢測和重金屬離子去除技術，目前所面臨的主要難點在于其對功能單體的選擇，常用的幾種分子印跡聚合物都無法很好地與重金屬離子的特異性結合，而國內外關于相關功能單體的研究仍主要集中于單體性能，缺乏對結合機理的深入探究。本文通過研究鎘離子與GMP的結合機理，希望可以為之后功能單體的選擇研究提供一些幫助。

從研究中得出的主要結論如下：鎘離子和GMP的濃度比不同會對二者的結合過程產生顯著影響，在低濃度比下，反應為焓驅動的放熱反應；在高濃度比下，反應為吸熱反應。根據數據推測GMP 與鎘離子存在兩個結合位點，一個為放熱結合位點，一個為吸熱結合位點，在低濃度比下，只有放熱結合位點發生結合，濃度比達到一定值時，才會激活吸熱結合位點，同時發生吸熱和放熱結合。而且因為吸熱結合位點的結合能力更強，反應可能呈現為吸熱反應。通過反滴法與正滴法的比較，發現在同一濃度下，不同的滴加方式和滴加順序也會對結合結果造成較大的影響。

ITC 法作為一種熱力學分析方法，可以從得到的熱力學參數來解釋物質之間親合力的強弱，是研究物質之間相互作用的黃金標準。本文的研究結果將為篩選可以與鎘離子結合的優秀功能單體提供一定的理論數據支撐和實驗指導。