射頻技術處理糙米自由基與脂肪酶的作用效果研究

王嵐峰,史鋒,黃金榮,李永富,3*

1(江南大學,糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學,江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇 無錫,214122) 3(江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心,江蘇 無錫,214122)

糙米與白米相比,糙米富含蛋白質、脂質、維生素、礦物質以及抗氧化活性成分[1]等,多食用糙米及其制品可以增加人們對營養物質的吸收,同時可以降低慢性病的患病風險。糙米中的脂肪含量約為白米的3倍,糙米在貯藏期間脂質氧化是導致其品質下降的主要因素,這是糙米消費流通主要障礙。糙米約含有43%的多不飽和脂肪酸,在貯藏期間極易發生氧化哈敗,造成糙米貯藏困難,貨架期短。糙米中有脂肪酶、脂肪氧合酶、過氧化物酶等,脂肪酶是其中耐熱性最好的酶,被認為是小麥[2]貯藏期間品質劣變的重要因素。因此,通過熱處理去滅活脂肪酶有利于糙米的貯藏穩定性,但同時也會產生自由基,從而促進不飽和脂肪酸的自動氧化進程,且自由基的強度越高,氧化的速率越快[3]。因此,控制自由基強度并適度滅酶對糙米的貯藏穩定性具有重要意義。

射頻是基于交變電磁波的加熱技術,射頻加熱工藝是傳統食品熱處理和化學加工的一種高效且環保的替代方法。介電能通過偶極旋轉和離子遷移在食品和農產品內部產生摩擦熱,迅速提高材料整體溫度,從而最大限度地減少傳統熱傳導因加工時間過長而導致的質量劣化[4]。在農產品干燥中,射頻被廣泛用于堅果、新鮮水果和蔬菜[5-6],射頻還可以選擇性加熱,可以有效地用于采后害蟲防治和微生物滅活[7]。而射頻用于谷物的品質穩定性的研究很少,目前大多數文獻只針對米糠等谷物加工副產品的脂肪酶、脂肪氧合酶、過氧化物酶的滅活[8]。張晶晶[9]與李永富等[10]的研究表明射頻加熱對薏米仁與青稞脂肪酶有良好的滅活效果,但她們均發現自由基強度增加對貯藏穩定性的不利影響。目前,關于射頻技術處理糙米自由基與脂肪酶的作用效果及貯藏穩定性影響的研究還鮮有報道。

本研究以最低自由基強度、脂肪酶活性、脂肪酸值、過氧化值、脂肪酸組成、己醛含量等指標對射頻處理后糙米的貯藏品質進行評價,研究結果可以為延長糙米保質期提供創新有效的技術手段,為射頻加熱處理延長谷物貯藏穩定性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南粳46,江蘇艾津稻園農業科技服務有限公司于2021年3月生產,水分含量為(12.80±0.02)%(質量分數),于-18 ℃貯藏備用。無水乙醇、無水乙醚、三油酸甘油酯、三氯甲烷、冰醋酸、氫氧化鉀、己醛標準品、硫代硫酸鈉滴定液等試劑為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GJ-3-27-JY高頻真空介質加熱射頻裝置(27.12 MHz),河北華氏紀元高頻設備有限公司;EMX plus-10/12電子自旋共振波譜儀,德國布魯克科技有限公司;AX224ZH/E電子天平,常州市奧豪斯儀器有限公司;LXJ-ⅡB低速離心機,上海安亭科學儀器廠;PB-10型PH計,德國Sartorius公司;DZ-280/2SE多功能真空封口機,上海三聯包裝機械有限公司;GC-2010氣相色譜儀,日本島津公司;LRH-150恒溫生化培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;MSH-20A磁力攪拌器,德國明智公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 糙米脂肪酶的射頻滅活處理

稱取550 g米置于聚丙烯盒(14.0 cm×10.5 cm×4.5 cm)中,放入泡沫盒(外徑21.0 cm×17.0 cm×8 cm,內徑16 cm×12 cm×7 cm)組合使用,盒內糙米高約4.0 cm,泡沫盒可減少散熱,用于保溫,然后將置于射頻下極板中心位置,分別設置相應的極板間距、物料中心的目標溫度和射頻處理結束后的保溫時間。射頻處理結束后立即將糙米取出,平衡溫度后裝入8.5號自封袋中,貯備用于進行分析。

1.3.2 脂肪酶活性的測定

脂肪酶活性測定方法參照GB/T 5523—2008《糧油檢驗糧油脂肪酶活性測定》。

1.3.3 自由基強度的測定

電子自旋共振波譜法(electron spin resonance spectrometer, ESR)是一種快速且普遍應用于農產品中自由基的檢測工具[11],糙米原料的烷基自由基強度的ESR光譜圖在3 355 G處出現一個明顯的信號峰,信號峰的最高點和最低點之間的差值反應了自由基的強度。將糙米樣品粉碎過60目篩,精確稱取糙米粉樣品(60.0±0.5) mg于核磁管中,稱量過程中避免樣品粉末粘壁,稱量好后在桌面輕敲,使糙米粉末均勻分布在底部。ESR測定條件：磁場寬度100 G,磁場中心為3 350 G,掃描3次,每次1 min,功率20 mW。自由基強度用3 350 附近峰高與1 g糙米粉(干基)質量的比值來表示。本研究中ESR所測自由基為以碳為中心的穩定型自由基。

1.3.4 射頻處理糙米最佳實驗參數單因素實驗

1.3.4.1 極板間距對糙米度、自由基強度的影響

550 g糙米,不補水,在射頻溫度100 ℃,設置極板間距分別為110、120、130、140、150 mm進行射頻處理,射頻處理時間分別為9.9、10.3、13.9、17.8、21.9 min處理結束后不保溫立即取出備用。

1.3.4.2 溫度對糙米脂肪酶活性、自由基強度的影響

550 g糙米,不補水,在極板間距140 mm條件下,設置射頻溫度分別為80、90、100、110、120 ℃進行射頻處理,射頻處理時間分別為12.7、15.4、17.8、22.2、29.3 min。

1.3.4.3 補水量對糙米脂肪酶活性、自由基強度的影響

使用微量噴壺對550 g原料糙米進行補水處理,在自封袋中邊噴邊用玻璃棒攪拌,使樣品均勻補水,獲得補水量質量分數為1%、2%、3%、4%和5%的糙米樣品,分別混勻后于25 ℃恒溫搖床中平衡14 h。射頻條件為極板間距140 mm,物料中心溫度100 ℃,射頻處理時間分別為15.8、14.8、14.3、12.3、10.4 min。

1.3.4.4 保溫時間對糙米脂肪酶活性、自由基強度的影響

將550 g糙米樣品在極板間距140 mm、物料中心溫度為100 ℃、補水率為4%的條件下進行射頻處理,射頻處理時間約11.50 min,射頻處理結束后,將糙米分別保溫0、10、20、30、40、50 min后取出備用。

1.3.5 正交試驗

選擇影響糙米脂肪酶活性和自由基強度的因素：極板間距、溫度、補水率。根據單因素試驗的結果,進行三因素三水平正交試驗,設計方案如表1所示,共進行9組射頻處理,每組射頻處理用量為550 g,不保溫。

表1 正交實驗設計Table 1 Orthogonal experimental design

1.3.6 貯藏實驗

選取正交試驗結果得到的兩組最佳實驗條件進行射頻處理,將射頻處理好的糙米用自封袋包裝,和原料糙米一起在37 ℃恒溫培養箱中貯藏28 d,貯藏濕度11%,每7 d取樣1次,取樣后放入-20 ℃冰柜貯備用于分析。

1.3.6.1 含水量的測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》進行測定。

1.3.6.2 過氧化值的測定

參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》進行測定。

1.3.6.3 脂肪酸值的測定

參照 GB/T 5684—2015《谷物碾磨制品脂肪酸值的測定》進行測定。

1.3.6.4 己醛含量的測定

采用頂空氣相色譜法測定己醛的含量。以癸烷標準品為內標,用甲醇配制1 mg/mL內標液。用95%乙醇配制己醛標準品至100 μg/mL貯備液,4 ℃冰箱避光冷藏。稱取約1 g糙米粉加入氣相瓶中,加入1 mL質量濃度為20 μg/mL的正癸烷內標液和5 mL去離子水,振蕩混勻待測,另外用去離子水將己醛儲備液稀釋至2 μg/mL,再向氣相瓶中加入5 mL稀釋的標準溶液和20 μL的癸烷內標液,用振蕩器混勻,待測。測試參數按照MEXIS等[12]方法。

1.3.6.5 脂肪酸組成的測定

將提取出來的脂肪酸,先甲酯化前處理,再通過氣相色譜法測定[13]。取脂肪50～80 mg,加2 mL NaOH甲醇溶液,振蕩,60 ℃水浴30 min,冷卻后加入2 mL 25%(體積分數)的三氟化硼甲醇溶液,60 ℃水浴20 min。冷卻后加入2 mL正己烷、2 mL飽和氯化鈉溶液,振蕩萃取分層,取1 mL上清液進行氣相分析。

1.4 數據處理

每個實驗都有3個平行實驗,數據均采用均值±標準差表示,數據采用Excel 2019進行處理。用SPSS Statistics 20 進行顯著性分析,選擇LSD檢驗和Duncan檢驗,顯著性水平為P<0.05。采用 Origin 2018繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 極板間距對糙米脂肪酶活性、自由基強度的影響

由圖1可知,射頻的升溫速率隨著板間距的增大而減小;在極板間距為130 mm 時,脂肪酶活性最低,滅酶率達60.46%。分析原因為若極板間距增大,極板之間的電場強度減弱,帶電離子前后移動幅度減小,故發生碰撞產熱也減少,升溫速率也逐漸減慢[14];若極板間距變小,則射頻加熱電路的頻率與射頻產生電路固有頻率的耦合程度越大,樣品吸收的功率越大,升溫速率越高,但升溫速率過高會有邊角效應,導致加熱不均勻,滅酶效果不佳。140 mm的極板間距下升溫速率為4.2 ℃/min,與WANG等[15]用于射頻加熱處理豆類等適宜升溫速率約為5 ℃/min相接近。根據選取最低自由基強度并適度滅酶的原則,因極板間距為130 mm時的自由基強度顯著高于極板間距為140 mm時的自由基強度(P<0.05),且此兩種條件下的脂肪酶活度并無顯著性差異。故最終選擇 140 mm 的極板間距作為最佳極板間距。

圖1 極板間距對升溫速率、脂肪酶活度和自由基強度的影響

2.1.2 溫度對糙米脂肪酶活性、自由基強度的影響

由圖2可知,隨著射頻處理的溫度升高,脂肪酶活性均顯著下降(P<0.05)。當物料中心達到120 ℃時,射頻的滅酶效果最好,脂肪酶活性為2.95 mg/g,滅酶率達到66.7%。射頻溫度越高,糙米脂肪酶活性越低,滅酶率越高,VEARASILP等[16]隨著射頻加熱溫度升高和保溫時間的延長能使得脂肪酶的活性顯著降低的研究也有類似發現。隨著射頻處理的溫度越高,自由基強度增長速率越大,BOLUMAR等[17]也有類似報道。在物料中心溫度達到100 ℃時的自由基強度顯著低于其他溫度下的自由基強度,且脂肪酶活性較低,為5.17 mg/g,滅酶率能夠達到42.7%。故最終選取100 ℃為最佳溫度。

圖2 溫度對脂肪酶活性和自由基強度的影響

2.1.3 補水量對糙米脂肪酶活性、自由基強度的影響

補水一方面可以降低酶的耐熱性,使脂肪酶活性下降[18],另一方面可以提高升溫速率,縮短射頻時間[19],而且可以淬滅因高溫產生的自由基[20],由圖3可看出,滅酶率最佳時補水率為3%,這說明對糙米進行適當的補水可提升滅酶率。但當補充的水分過多時,伴隨著糙米水分的蒸發消耗射頻能量,故用于糙米滅酶的能量減少;若補充水分較少時,糙米水分活度增大,這有利于提高脂肪酶在低介電介質環境中的柔韌性,酶活性增強,滅酶率下降[21],故只有適度對糙米補水才能達到最佳滅酶率。由圖3可看出,補水2%、3%和4%的糙米脂肪酶活性顯著低于其他補水率下的脂肪酶活性(P<0.05),且4%補水率下的糙米自由基強度顯著低于這3組中的另2組(P<0.05)。故最終選取最佳補水率為4%。

圖3 補水率對脂肪酶活性和自由基強度的影響

2.1.4 保溫時間對糙米脂肪酶活性、自由基強度的影響

由圖4可知,脂肪酶活度隨著保溫時間不斷延長出現了先上升下降的趨勢。在保溫時間20 min時脂肪酶活度最性,為5.75 mg/g,滅酶率最低,為29.71%,保溫時間50 min時脂肪酶活度最低,此時滅酶率為55.68%。在保溫10 min以后,脂肪酶活度短暫增大的可能的原因是電場的作用：射頻通過靜電相互作用改變了脂肪酶電荷的分布,改變了蛋白質的二級結構,增加了底物與活性中心接觸的機會,導致了酶活性變大,滅酶率下降[22]。與保溫0 min相比,隨著保溫時間增加,自由基強度逐漸增大,從保溫0 min的1.141增加到保溫50 min的1.730,射頻后的糙米保持高溫的環境有利于自由基的不斷生成。綜合滅酶率和自由基強度指標,選擇不保溫作為單因素最優實驗條件。

圖4 保溫時間對脂肪酶活性和自由基強度的影響

2.2 正交試驗

根據單因素試驗的結果,進行正交試驗。選擇自由基強度、脂肪酶活性并計算滅酶率作為評價指標。正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experimental result

由表3和表4可知,極差R的大小順序為A>B>C,說明極板間距對滅酶率的影響最大,補水率影響滅酶率程度最小。僅因素A對實驗結果有顯著影響(P<0.05)。由此,以滅酶率為評價指標,得到的最佳加工工藝為A3B3C3,即極板間距145 mm、溫度105 ℃、補水率4.5%。

表3 滅酶率極差分析Table 3 Range analysis of enzyme inhibition rate

表4 滅酶率方差分析Table 4 Variance analysis of enzyme inhibition rate

由表5和表6可知,極差R的大小順序為A>C>B,說明極板間距對滅酶率的影響最大,而溫度影響滅酶率程度最小。僅因素A對實驗結果有顯著影響(P<0.05)。由此,以自由基強度為評價指標,得到的最佳加工工藝為A3B1C3即極板間距145 mm、溫度95 ℃、補水率4.5%。

表5 自由基強度極差分析Table 5 Range analysis of radical intensity

表6 自由基強度方差分析Table 6 Variance analysis of radical intensity

2.3 最佳加工工藝的選取

根據正交實驗滅酶率的極差分析結果可以得到最佳實驗條件為A3B3C3,但因輪空未測,補測結果如表7所示。

表7 正交實驗最佳工藝驗證Table 7 Optimal process verification for orthogonal experiments

2.4 射頻處理對糙米貯藏穩定性的影響

2.4.1 貯藏期間糙米脂肪酸值的變化

由圖5可知,射頻處理對糙米的初始脂肪酸值有顯著影響(P<0.05),相較糙米原料的脂肪酸值,射頻處理后的脂肪酸值降低了約30.29%,這說明射頻處理能夠降低糙米脂肪酸值,其原因可能部分脂肪酸與淀粉形成了復合物或發生了進一步降解。由于射頻處理脂肪酶活度下降,所以脂肪酶水解反應受到抑制,脂肪酸值顯著降低[23]。在貯藏過程中,各樣品的脂肪酸值先升高后下降,在21 d時達到峰值,射頻組脂肪酸值約23.70 mg/100 g,而原料則已達到33.17 mg/100 g。在21～28 d期間脂肪酸值有所下降,可能是游離脂肪酸氧化速度大于生成速度,也可能是積累過多的游離脂肪酸會對水解有抑制作用,故此時脂肪氧化速率高于水解速率[24]。脂肪酸的積累會導致脂肪加速降解,這是由于游離脂肪酸中帶有極性基團,它能夠催化氫過氧化物發生分解,不斷生成自由基,進入鏈式反應,導致脂肪降解的速率加快[25]。一般認為稻谷的宜存品質的脂肪酸值≤25 mg/100 g,射頻處理后的糙米在加速貯藏實驗中脂肪酸值峰值在安全范圍內,而原料糙米的品質已不宜繼續貯藏。綜上,射頻可顯著降低糙米在貯藏期間的脂肪酸值,有利于提高其貯藏穩定性。

圖5 貯藏期間糙米脂肪酸值的變化

2.4.2 貯藏期間糙米過氧化值的變化

過氧化值是反映谷物貯藏期間品質的指標之一。圖6顯示貯藏期間原料與射頻處理后的糙米的過氧化值均呈現不斷上升的趨勢,過氧化值的增加表明樣品中脂質氧化形成的中間體的積累,過氧化值小于0.25 g/100 g被認為是一般植物油的可接受閾值,當過氧化值超過0.35 g/100 g時,則認為完全不能被消費者認可,貨架期結束。射頻樣品A3B3C3和原料的過氧化值在28 d時已超過0.35 g/100 g,不適宜繼續貯藏。而此前基于最低自由基強度選取A3B1C3為射頻處理條件的糙米樣品,得到的過氧化值在3組糙米樣品中最低,且在安全范圍以內,故需要選取合適的射頻條件進行處理。綜上,基于最低自由基強度原則進行射頻處理可使在貯藏期間糙米的過氧化值明較低,脂肪酸值在適宜范圍內,有利于提高其貯藏穩定。

圖6 貯藏期間糙米過氧化值的變化

2.4.3 貯藏期間糙米自由基強度的變化

圖7顯示,在0 d 2組射頻處理后的糙米自由基強度均顯著低于原料糙米(P<0.05)。原因可能是射頻處理時對糙米進行了補水處理,水分對自由基有猝滅作用;并發現在2組射頻糙米中,射頻加熱溫度越高,自由基強度越高。在貯藏28 d時,射頻處理后的糙米自由基強度均顯著高于原料組(P<0.05),與0 d相比射頻處理后的糙米自由基強度增加了約47.5%;這與林露芬等[26]微波處理糙米貯藏過程中自由基的變化相似,且自由基的信號強度隨著貯藏時間的延長而增加。觀察到貯藏0 d時射頻處理能顯著降低糙米自由基強度(P<0.05),但在貯藏28 d后射頻處理后的糙米自由基強度卻顯著高于原料,這與李永富等[10]結論不一致。糙米處理前后自由強度在貯藏期間的變化趨勢發生了逆轉,這一變化的原因需要進一步研究,這種變化與脂肪氧化的關系也需要深入研究。較低自由基強度的射頻處理糙米,其自由基強度峰值也較低,其脂肪酸值與過氧化值也較低,這證明較低的自由基強度對改善糙米貯藏穩定性有益。

圖7 貯藏期間糙米自由基強度的變化

2.4.4 貯藏期間糙米己醛含量的變化

糙米貯藏過程中主要的異味成分是醛類化合物,其中己醛占最大比例。由圖8可知,在貯藏期間,貯藏28 d時,用射頻條件A3B1C3、A3B3C3處理后的糙米的己醛含量與0 d相比分別升高了109.6%、145.5%,而原料僅升高了27%。射頻處理后己醛的升幅更高,且射頻處理的溫度越高,脂肪酶活性越低,己醛含量升高的幅度越大,加速氧化的程度越重。這與PEKKA等[27]研究一致,他們發現在長期貯藏過程中,脂肪酶活性越低,己醛的含量越高,如果將燕麥麩皮熱處理至脂肪酶活性為0,則貯藏12個月后檢測到的頂空己醛含量是未經熱處理的麩皮的5～7倍。在37 ℃貯藏28 d后,射頻A3B1C3處理的糙米樣品的己醛含量顯著低于射頻A3B3C3處理的糙米,說明控制自由基強度能一定程度上改善射頻處理糙米的貯藏穩定性。

圖8 貯藏期間糙米己醛含量的變化

2.4.5 貯藏期間糙米脂肪酸組成的變化

不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids, UFA)比飽和脂肪酸(saturated fatty acids, SFA)更容易被氧化,故探究糙米中游離脂肪酸的組成是探究糙米貯藏過程中脂肪氧化的重要指標之一。由表8結果可看出,糙米中含量最多的脂肪酸為油酸和亞油酸,含量為34.56%和41.63%。糙米中的不飽和脂肪酸的含量達到78.56%,而其中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)比例較單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids, MUFA)的更大。在貯藏期間,3組樣品的UFA的含量都顯著下降(P<0.05),SFA的含量都顯著上升(P<0.05),說明參與油脂氧化反應的主要是UFA,而3組樣品的MUFA含量都顯著升高(P<0.05),PUFA都含量顯著下降(P<0.05),可說明在糙米的UFA中,PUFA較MUFA更容易被氧化。這與WANG等[28]研究一致。A3B1C3、A3B3C3和原料的PUFA含量分別下降了1.34%、2.08%、2.39%,射頻處理后的樣品的PUFA含量下降速率：A3B1C3

表8 貯藏期間糙米的脂肪酸組成變化Table 8 Changes in fatty acid composition of brown rice during storage

3 結論

基于自由基強度控制的糙米脂肪酶射頻滅活可改善其貯藏穩定性。最佳加工工藝為A3B1C3,即極板間距145 mm、溫度95 ℃、補水率4.5%,極板間距對脂肪酶活性、自由基強度均有顯著影響(P<0.05)。在37 ℃下貯藏28 d后,射頻處理糙米的脂肪酸值和過氧化值與原料相比均顯著降低(P<0.05);射頻處理后的糙米的PUFA含量下降速率與原料相比均顯著降低(P<0.05),其中以最低自由基強度的射頻處理糙米綜合品質最好。結果表明,在控制自由基強度的前提下,適度滅活糙米脂肪酶能夠有效改善其貯藏穩定性。關于糙米處理前后自由強度在貯藏期間的變化趨勢發生了逆轉,這一變化的原因及其與脂肪氧化的關系也需要后續深入研究。本研究中只采用了江蘇艾津稻園農業科技服務有限公司提供的南粳46糙米,所得到的射頻最佳加工工藝在更多糙米品種中的適用性還可以進行對比研究;本研究中射頻系統只局限于實驗室規模,尚未開展射頻工業規模的研究,這給評估能源消耗和經濟效益帶來了一定的困難。此外,射頻滅酶處理與其他傳統滅酶方式處理后糙米的品質比較還需更多的試驗研究。