基于超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜建立雞肉中雙酰胺類和雙酰肼類農藥殘留分析方法

張朋杰,盧俊文,張憲臣,李勇,黃碧嘉,曾苑嫦,盧柏淇

(中山海關技術中心,廣東 中山,528403)

雙酰胺類殺蟲劑作為魚尼汀受體調節劑,通過破壞鈣離子通道影響害蟲肌肉收縮,導致行動受阻,進而使得害蟲死亡,具有作用機理獨特、殺蟲活性強以及殺蟲譜廣的特點[1];雙酰胺類農藥在土壤中的殘留期較長,移動性也較強,長期大量施用可能會產生富集作用,氟苯蟲酰胺及其脫碘代謝物會對水生無脊椎動物造成急性和慢性風險,威脅到水生食物鏈 (尤其魚類),硫蟲酰胺和環溴蟲酰胺對魚類和藻類高毒,該類農藥可能對水生生態環境造成潛在威脅[2];雙酰肼類殺蟲劑屬蛻皮激素類似物,主要通過誘導昆蟲提前蛻皮,發育成熟不完全,抑制其進食來達到滅殺作用,具有用藥量少、選擇性高等特點[3];甲氧蟲酰肼在使用初期被普遍認為對人畜毒性較低且對環境安全,在世界范圍內被迅速推廣,然而隨著甲氧蟲酰肼大量廣泛使用,越來越多的研究證明其具有殘效期長、且毒性較高、對地下水和水生生物具有極高的毒性風險[4]。由于這兩類農藥在防治農業害蟲和城市衛生害蟲上得到廣泛應用,這些農藥的殘留會對養殖業相關的飼料、水體、土壤造成污染,從而在動物體內積累,進一步影響人類的身體健康,因此關注動物產品中的農藥殘留很有必要。為保障食品安全各國對農藥殘留實施嚴格的監控,如日本肯定列表規定雞肉中最大殘留甲氧蟲酰肼0.01 mg/kg、蟲酰肼0.02 mg/kg;歐盟規定雞肉中氯蟲苯甲酰胺、環丙蟲酰胺、氟苯蟲酰胺、甲氧蟲酰肼最大殘留0.01 mg/kg,蟲酰肼最大殘留0.02 mg/kg;我國GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定禽肉中最大殘留氯蟲苯甲酰胺0.01 mg/kg,溴氰蟲酰胺、蟲酰肼最大殘留0.02 mg/kg。

當前測定雙酰胺類和雙酰肼類農藥殘留量的方法主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6-7]和液相色譜-串聯質譜法[8-13],檢測以蔬菜、水果、油料為主,僅有少量報道是關于動物源性食品的[14-15];同時檢測雙酰胺類和雙酰肼類農藥的研究報道較少,目前僅涉及溴蟲氟苯雙酰胺、氯氟氰蟲酰胺、四唑蟲酰胺[16-18]。超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry, UPLC-Q-Orbitrap HRMS)具有分辨率高、定性定量能力好的優點[19-21],可用目標物母離子精確質量數的豐度值直接定量,避免低分辨質譜易受基質干擾而產生假陽性的現象,近年來在檢測工作中得到快速應用。本研究結合分散凈化技術,用UPLC-Q-Orbitrap HRMS建立同時測定雞肉中8種雙酰胺類和5種雙酰肼類農藥的殘留分析方法,擴大了可同時檢測農藥的數量,方法具有操作簡便、快速、精確的特點,在5、10、50 μg/kg 3個不同加標水平下的平均回收率為90.1%～117.7%,相對標準偏差為1.2%～8.6%,檢出限為0.2～1.0 μg/kg,可為雞肉中雙酰胺類和雙酰肼類農藥殘留的例行檢測、風險評估等提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈(色譜純),Merch公司;無水硫酸鎂(色譜純),上海麥克林公司;乙酸銨、PSA、C18、石墨化碳黑(graphitized carbon black, GCB)、陶瓷子(長2 cm×直徑1 cm)、0.22 μm微孔濾膜,上海安譜公司;氯化鈉(分析純),廣州化學試劑廠。

標準品：溴蟲氟苯雙酰胺、氯氟氰蟲酰胺、環丙蟲酰胺、四唑蟲酰胺、環蟲酰肼(純度≥95%),德國Dr.Ehrenstorfer 公司;氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺、氟苯蟲酰胺、四氯蟲酰胺、甲氧蟲酰肼、蟲酰肼、抑食肼、呋喃蟲酰肼(質量濃度1 mg/mL),上海安譜公司。

標準溶液配制：準確稱取約5 mg(精確至0.01 mg)固體農藥標準品分別用乙腈溶解并定容至5 mL,制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液,液體標準品直接開瓶作為儲備液,于-18 ℃保存。混合標準工作溶液：吸取適量上述標準儲備液,用乙腈稀釋配成質量濃度為1 μg/mL的混合標準工作溶液,于-18 ℃保存。

1.2 儀器與設備

Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用儀、UltiMate3000超高效液相色譜,Thermo公司;3-16KL臺式冷凍離心機、CP255D電子天平,賽多利斯公司;超純水系統,Millipore公司;渦旋振蕩器,IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜-質譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm);流動相：乙腈(A)和0.002 mol/L乙酸銨溶液(B);梯度洗脫程序：0～1 min,10% A～40% A,1～8 min,40% A～90% A,8～10 min,保持90% A,10～10.1 min,90% A～10% A;10.1～12 min,保持10% A。流速：0.3 mL/min;柱溫：40 ℃;進樣量：10 μL。

離子源噴霧電壓為3.2 kV,毛細管溫度為320 ℃,鞘氣流速為40 L/min,輔助氣流速為10 L/min,輔助氣加熱溫度為350 ℃。掃描模式為Full scan/dd-MS2,采集范圍為100～800 Da,全掃描分辨率為70 000 FWHM,據依賴子離子掃描分辨率為17 500 FWHM,質譜信息見表1。

表1 雙酰胺類和雙酰肼類農藥的保留時間和質譜信息Table 1 Retention times and mass parameters of diamide and dihydrazide pesticides

1.3.2 樣品處理

準確稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中,加入5 mL水渦旋振蕩30 s,使樣品充分分散,再加入10 mL 1%(體積分數,下同)醋酸乙腈,振蕩提取2 min;加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉和1顆陶瓷子立即搖散,振蕩1 min,在4 ℃下以4 000 r/min轉速離心5 min;定量吸取3 mL上清液至內含450 mg無水硫酸鎂、50 mg C18和100 mg PSA的離心管中,渦旋混勻1 min;4 200 r/min離心5 min,吸取上清液過微孔濾膜,上機測定。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

與三重四極桿低分辨質譜分辨力不足僅能將離子質量數準確到小數點后1位、易受m/z近似離子干擾不同,四極桿靜電場軌道阱的高分辨率能夠將離子質量數準確到小數點后5位,質譜峰寬顯著小于三重四極桿低分辨質譜,可區分相同質量數的不同離子,分辨能力強。高分辨質譜的Full scan/dd-MS2掃描模式可每次對一個母離子的所有碎片離子進行全掃描,監測精度高、圖譜信息全,定性準確度高,且無需事先對目標物逐個確定離子對和優化碰撞能量。對質量濃度為100 ng/mL的雙酰胺類和雙酰肼類農藥混合標準溶液,在m/z100～800內用高分辨質譜的Full scan/dd-MS2掃描模式進行正負離子掃描,一級全掃描(full scan)分辨率為70 000 FWHM,數據依賴掃描(dd-MS2)分辨率為17 500 FWHM,13種農藥母離子精確質量數的實測值與理論值誤差均在4.04×10-6范圍內,質量誤差、信號強度和信噪比詳見表1。以各農藥母離子精確質量數建立目標列表,當一級全掃描過程中發現目標列表中的離子信號強度超過預設值時觸發數據依賴掃描,獲得二級碎片全掃描信息。選擇一級全掃描的母離子作為定量離子,選擇2個具有代表性的二級碎片離子作為定性離子。通過上述質譜參數優化和篩選建立包括農藥名稱、分子式、離子形式、保留時間、精確質量數及特征碎片離子質譜掃描數據庫,詳見表1。

2.2 色譜條件的優化

選擇3款色譜柱考察對13種農藥的分離效果,Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm)色譜柱的填料具有實心核和多孔層的特點,能夠限制化合物的擴散距離,提高分離速度,Waters Atlantis T3 (150 mm×2.1 mm, 3 μm) 色譜柱對極性化合物保留能力強,在水流動相中性能穩定,低pH條件下色譜柱壽命長,Ultra AQ C18(100 mm×2.1 mm, 3 μm) 色譜柱適合極性大的化合物,其鍵合技術能夠減弱由于硅羥基封閉不完全而引起的色譜峰拖尾現象。有機相選擇乙腈,水相選擇水、0.05%(體積分數)甲酸水溶液、0.002 mol/L乙酸銨溶液。結果表明,低濃度的甲酸、乙酸銨可以有效改善色譜峰的分離度和靈敏度,對負離子化合物的響應值抑制較小,當使用乙腈和0.002 mol/L乙酸銨溶液作為流動相時,13種農藥均可取得較好的響應值;在相同的梯度洗脫條件下,同分異構體化合物環蟲酰肼、呋喃蟲酰胺(m/z395.23292)在Waters Atlantis T3、Agilent Poroshell 120 EC-C18上的分離效果要優于Ultra AQ C18,在3款色譜柱上的分離度依次為1.97、1.93、1.31;13種農藥中除了四氯蟲酰胺、呋喃蟲酰肼、抑食肼之外,其他農藥在Agilent Poroshell 120 EC-C18上的離子響應強度均優于Waters Atlantis T3。因此,從分離度和離子響應強度綜合考慮,選擇Agilent Poroshell 120 EC-C18為本研究使用的色譜柱(圖1)。

a-正離子色譜圖;b-負離子色譜圖圖1 雙酰胺類和雙酰肼類農藥的正、負離子色譜圖

圖2 不同吸附劑組合對農藥回收率的影響

2.3 提取凈化方法的優化

2.3.1 萃取劑的選擇

實驗比較了乙腈、1%甲酸-乙腈、1%醋酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%醋酸-乙腈5種提取溶劑對雙酰胺類和雙酰肼類化合物的提取效果,添加量為10 μg/kg的空白雞肉樣品分別按照實驗方法處理,13種農藥的回收率為：乙腈89.5%～99.2%、1%甲酸-乙腈為85.6%～107.4%、1%醋酸-乙腈為94.3%～106.5%、0.1%甲酸-乙腈為85.7%～96.5%、0.1%醋酸-乙腈為89.7%～102.2%,1%醋酸-乙腈的提取效率總體情況最好,因此采用1%醋酸-乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 水化量的優化

由于乙腈具有一定的沉淀蛋白作用,直接加入會導致雞肉有一定程度結塊,不利于農藥的充分提取,加入一定量的水使其充分分散后再進行有機溶劑提取可提高萃取效率。在10 μg/kg 的添加水平下,在雞肉中分別加入1、3、5、7 mL水,渦旋振蕩30 s,然后分別按照實驗方法處理上機測定,通過回收率對比以確定適合雞肉的最優水化量。結果表明,加入1 mL水時,四氯蟲酰胺的回收率為83.3%,低于其他3種情況;當加水量為3、5、7 mL時,結果差異性并不顯著,13種農藥的回收率依次為92.2%～103.9%、92.9%～105.0%、92.1%～103.6%,5 mL的數據略微優于3 mL和7 mL的數據,因此研究采取5 mL作為加水量。

2.3.3 萃取鹽包的選擇

萃取鹽包的加入可以起到鹽析、調節pH作用,能夠提高萃取的效率,常見的萃取鹽有硫酸鎂、氯化鈉、醋酸鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉等,在10 μg/kg 的添加水平下,按照方案1：4 g硫酸鎂和1 g氯化鈉;方案2：6 g硫酸鎂和2 g氯化鈉;方案3：6 g硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉;方案4：4 g硫酸鎂、1 g 氯化鈉、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉,來探究適合雞肉的最優萃取鹽包組成。結果表明,在加入鹽包后方案1、3的放熱高于方案2、4;各方案農藥的回收率分別是：方案1為96.8%～108.0%、方案2為92.4%～103.8%、方案3為91.3%～102.2%、方案4為89.1%～99.3%,方案1各農藥的回收率是4個方案中最好的,僅有環蟲酰肼、四唑蟲酰肼的回收率出現低于其他方案的情況,所以采用方案1作為本研究的萃取鹽包。

2.3.4 凈化條件的優化

通過分散吸附的方式使吸附劑與樣品中的基質雜質相互作用以達到凈化效果,常用的吸附劑有PSA、C18、GCB等。PSA常用來吸附色素、糖和脂肪酸等極性基質成分;C18是非極性吸附劑,能夠吸附非極性干擾物,如蛋白、脂質物質等。研究在除水劑無水硫酸鎂用量為450 mg時,PSA、C18、GCB不同使用量的凈化效果,設計8種吸附劑組合,組合1：100 mg PSA+50 mg C18;組合2：100 mg PSA+100 mg C18;組合3：100 mg PSA+150 mg C18;組合4：50 mg PSA+100 mg C18;組合5：150 mg PSA+100 mg C18;組合6：100 mg PSA+50 mg C18+5 mg GCB;組合7：100 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB;組合8：100 mg PSA+50 mg C18+15 mg GCB,以陰性雞肉樣品加標量10 μg/kg考察凈化效果。對比組合1～5的加標回收率,組合1的回收率優于其他組合;在組合1的基礎上分別加入5、10、15 mg GCB,凈化后溶液顏色變得更加清澈,但與組合1相比多數農藥的回收率均有所下降,推測是GCB的平面結構在吸附色素的同時對具有苯環結構的雙酰胺類、雙酰肼類農藥也有一定程度的吸附的原因,因此本研究采用450 mg無水硫酸鎂、100 mg PSA和50 mg C18為最終的凈化劑組合。

2.4 方法學考察

2.4.1 方法的線性范圍和檢出限

吸取適量的混合標準工作溶液,用空白基質溶液稀釋成一系列濃度的標準溶液,用高分辨質譜測定。以定量離子峰面積對質量濃度進行線性回歸,繪制標準曲線,13種農藥的線性范圍和相關系數詳見表2。高分辨質譜的基線噪音極低,不能用傳統的信噪比計算檢出限,本文用空白基質溶液逐級稀釋標準溶液,直至儀器能檢出最低濃度情況下連續測試10次,計算檢測結果的標準偏差(s),以3s作為方法的檢出限,13種農藥的檢出限為0.2 ～1.0 μg/kg,詳見表2。

表2 13種農藥的線性范圍、標準曲線方程、相關系數、檢出限、回收率和精密度(n=6)Table 2 Linear ranges, linear equation, correlation coefficient, LOD, spiked recoveries, and RSD of 13 pesticides(n=6)

2.4.2 方法的準確度和精密度

采用標準加入法,取混合標準溶液在陰性雞肉樣品中添加5、10、50 μg/kg三個濃度水平進行回收率實驗,每個水平測試6次,測得13種農藥加標平均回收率為90.1%～117.7%,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為1.2%～8.6%(表2),符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中檢測方法確認技術要求中關于回收率、精密度的要求。

2.4.3 實際樣品測定

收集市場和超市上不同品種的雞肉20批次,利用本方法進行測定,未檢出雙酰胺類和雙酰肼類農藥。

3 結論

通過對色譜質譜條件、提取試劑、水化量、萃取鹽包以及凈化劑組成的優化,本文建立了一種同時測定雞肉中雙酰胺類和雙酰肼類農藥的超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜方法,方法具有操作簡單、檢測效率高的特點,其方法靈敏度、線性范圍、相關系數、準確度及精密度等均滿足國內外法規對農藥殘留檢測的要求,為雞肉中雙酰胺類、雙酰肼類農藥殘留的檢測提供了新方法,為監管部門的例行檢測、風險評估等提供了技術支撐。