酸筍中微生物區系演替和風味物質形成機制的研究進展

薛冰潔,胡榮,吳良如,楊金來,李彬,張甫生*,鄭炯*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(國家林業和草原局竹子研究開發中心,浙江 杭州,310012) 3(重慶市林業科學院,重慶,400036)

竹筍營養豐富、肉質脆嫩、滋味鮮美,是一種深受廣大消費者青睞的森林食品。我國竹筍產量巨大,其中60%用于加工。酸筍是以竹筍為原材料,經無鹽或加鹽處理,在密封條件下經微生物代謝而成的一種竹筍加工制品。酸筍按照加工技術分為自然發酵和人工發酵,人工發酵因具有發酵周期可控性強、發酵效率高、安全等優點成為目前最常用的發酵方式。經發酵處理的酸筍不僅風味多樣,而且口感爽、脆、酸、嫩,微生物資源也更為豐富,產品品質得到顯著提高,感官體驗也更優[1-2]。

酸筍中含有豐富的乳酸菌資源,包括明串珠菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬和魏斯氏菌屬等。微生物的代謝是決定酸筍風味的關鍵,乳桿菌屬、乳球菌屬與部分有機酸、低閾值的醛類、酚類以及高閾值的醇類、酯類呈顯著正相關,而酸筍的復雜菌群是風味產生的基礎條件,兩者緊密相連。目前酸筍中微生物演替以及風味物質形成的研究受到越來越多的關注。因此,本文總結了酸筍中微生物群落的構成、變化規律及其影響因素,分類概述了酸筍中的風味物質,從微生物代謝的角度闡釋了酸筍中風味物質的形成機理,旨在為酸筍品質的提升提供理論參考。

1 酸筍發酵過程中的主要微生物群落

1.1 酸筍中微生物群落的構成

酸筍中的微生物以細菌為主,主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)等乳酸菌,這些通常也是發酵蔬菜中富集的優勢菌群。研究表明,傳統發酵酸筍中微生物群落的多樣性較高,主要為乳桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬、明串珠菌屬等[3],其中部分菌種具有嗜鹽、嗜酸的特性。LI等[4]將廣西柳州的麻竹筍自然發酵60 d,發現其微生物的多樣性顯著增加。在門水平上,以藍菌門、變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為代表,在屬水平上,代表性菌屬包括假單胞菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、腸球菌屬,明串珠菌屬。在種水平上,主要有植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、醋酸桿菌、瑞士乳桿菌等,而醋酸桿菌、乳酸桿菌是整個發酵階段的優勢菌種。為了解酸筍腌制過程中細菌的動態變化,XIA等[5]在自然發酵的麻竹筍中檢測到多株嗜鹽菌,紅桿菌屬、堿桿菌屬、鹽單胞菌屬、食甲基菌屬在10%(質量分數)NaCl溶液中正常生長,其中格氏乳球菌、乳酸乳球菌、食竇魏斯氏菌、融合魏斯氏菌在6.5%的NaCl溶液中也可維持正常活性。

酸筍中相關的功能性菌株為短乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、戊糖片球菌和腸系膜明串珠菌亞種等,具有益生、保健、提高食品安全性等作用[6]。研究表明,植物乳桿菌LZ-2-12的膽固醇降解率高達54.27%[7],當植物乳桿菌LC-3-3添加量為6%,pH值為6.0、溫度為37 ℃的條件下,亞硝酸鹽的降解率為76.58%[8]。部分乳桿菌不僅具有良好的抗氧化[9]、抗炎特性[10],而且還能高效分解木聚糖[11]、高產乳酸和甘露糖[12-13]。

迄今為止,已明確酸筍中的真菌主要為酵母菌,但相關研究鮮少報道。GUAN等[14]首次利用高通量測序研究酸筍中的真菌群落,發現子囊菌門和擔子菌門是酸筍中的主要真菌門,其中畢赤酵母屬、假絲酵母屬、德巴利酵母屬、絲孢酵母屬、青霉屬、哈薩克斯坦屬、曲霉屬為廣東酸筍的主要真菌屬,其中赤壁酵母屬最為豐富,占比28.32%,其次是含量為13.88%的假絲酵母屬,而云南酸筍中主要有赤壁酵母屬、接合酵母屬、絲孢酵母屬、哈薩克斯坦酵母屬、青霉屬,其中赤壁酵母屬為40.62%,其次為19.9%的接合酵母屬。

1.2 酸筍發酵過程中微生物群落的演替

酸筍中的發酵微生物在初期變化較大,中后期趨于穩定。腸膜明串珠菌、檸檬明串珠菌等異型發酵乳酸菌在發酵前期占據優勢,乳酸、乙酸等有機酸不斷積累,異型發酵乳酸菌在發酵后期被植物乳桿菌、乳酸乳球菌等同型發酵乳酸菌代替,最終乳酸菌群落趨于簡單化。CHI等[15]發現酸筍發酵初期有酵母菌、丁酸細菌、E-大腸桿菌、霉菌等,在發酵10 d后,發酵液中的乳酸菌出現明顯下降,非乳酸菌群體的消失可能是由于乳球菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬產生的抗微生物肽。GUAN等[16]利用MiSeq測序得出厚壁菌門在酸筍發酵初期持續增長,相對豐度最高為98.97%,其中乳桿菌屬持續為優勢菌種,而乳球菌屬、明串珠菌屬、腸桿菌屬和魏斯氏菌屬的豐度在發酵后期普遍降低。也有研究基于PCR-DGGE和Illumina測序技術檢測酸筍中群落結構,結果表明1～2 d酸筍中的乳酸菌從105 CFU/g升至109 CFU/g,以魏斯氏菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬為優勢菌屬。發酵完成時,僅有耐酸乳桿菌和約氏乳桿菌大量存在[17]。

1.3 酸筍中微生物群落的影響因素

發酵方式是影響酸筍微生物群落的重要因素。鄭文迪[18]從自然發酵酸筍中挑選耐酸、耐鹽,高產乳酸,有效降解亞硝酸的發酵乳桿菌NCU003039為發酵劑進行人工發酵。經對比發現,人工發酵酸筍中微生物的多樣性較低,但其安全性更高、品質更優。發酵劑的接種情況也會對酸筍微生物群落產生影響,LU等[19]將傳統酸筍中分離的檸檬明串珠菌NM-12和植物乳桿菌L01以不同比例接種到竹筍中,發現混合菌種不僅使酸類、醇類物質含量顯著提高,而且還能抑制腸球菌和梭菌,并且植物乳桿菌的含量隨發酵劑的增加而升高。

食鹽是酸筍咸味的主要來源,同時也是影響其微生物代謝的重要因素之一[20]。研究表明,在高鹽濃度下魏斯氏菌和乳酸桿菌的活性較高,但在低鹽濃度下明串珠菌的活性較高[21],并且在2.5%和3.5%鹽濃度下含有較高數量的酵母菌[22]。也有研究得出食竇魏斯氏菌、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、乳酸乳球菌為低鹽腌制筍的主要發酵菌,而高鹽腌制筍中主要為趨向于耐鹽、耐酸性的綠色氣球菌、芽孢桿菌屬[23]。

2 酸筍中的風味物質

2.1 有機酸

酸筍中的有機酸來源于原料和微生物的發酵作用。在發酵前期,通過丙酮酸的還原反應生成大量的乳酸、乙酸[24],發酵后期,各類有機酸發揮協同作用構成酸筍的酸味。BADWAIK等[25]在鮮筍中檢測到草酸、酒石酸、甲酸、丙酮酸和乳酸,而發酵酸筍中檢測不到草酸和丙酮酸,但乳酸、酒石酸從初期2.824 mg/g、1.733 mg/g最高增至39.492 mg/g、51.021 mg/g。酸筍中的有機酸受到發酵方式的影響。ZHENG等[26]采用頂空固相微萃取法檢測到自然發酵酸筍中的有機酸占風味物質總量的11.5%,其中乙酸已占6.08%,又利用氣相色譜-嗅聞聯用技術鑒定出丁酸和己酸為主要的有機酸。LU等[19]發現植物乳桿菌與乳酸呈高度正相關,而檸檬明串珠菌與乙酸呈高度的正相關。

2.2 呈味氨基酸

呈味氨基酸主要源自酸筍發酵微生物對原料中蛋白質、肽的代謝作用,大部分氨基酸呈酸味、甜味和鮮味,小部分氨基酸呈苦味。發酵前期,竹筍的內源酶與微生物共同作用產生游離氨基酸[27]。發酵后期,氨基酸作為微生物的營養物質、風味物質的前體物質而被消耗。武源等[28]采用在酸筍中測定到16種游離氨基酸,其中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等必需氨基酸含量較高。ZHENG等[29]發現酸筍中17種氨基酸的滋味活性值均小于1,但它們可轉化為酚類、醛類從而影響酸筍的滋味。WANG等[6]發現酸筍經發酵后,呈味氨基酸含量顯著增加,谷氨酸為含量最高的游離氨基酸,但未檢測到半胱氨酸和精氨酸。

2.3 揮發性風味物質

酸筍中的揮發性風味物質主要包括酚類、醛類、醇類、酯類以及其他的酮類、呋喃類等,是賦予酸筍獨特風味的主要途徑。目前從酸筍中已鑒定出的主要風味物質如表1所示,酸筍中的酚類、醛類含量較高且普遍閾值較低,主要在發酵前期積累,呈現先升高后降低的趨勢,是酸筍異味的主要來源,其中酚類主要源自酪氨酸的轉氨、脫羧作用,醛類來自streker降解、酵母菌的發酵作用以及支鏈氨基酸的轉氨、脫羧作用。醇類、酯類則普遍閾值較高,主要在發酵中后期積累,賦予酸筍花果香及清香味,其中醇類源自原料和乳酸菌的發酵作用,呈現先減少后增加的變化趨勢,而酯類由酯化反應和醇解作用產生,在發酵過程中含量不斷降低。總的來說,大部分風味物質與乳酸菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬等呈正相關,與不動桿菌屬、腸桿菌屬等呈負相關。

表1 酸筍中的主要揮發性風味物質Table 1 The main volatile flavor compounds in Suansun

此外,發酵方式、發酵劑的種類和比例也會影響酸筍中的揮發性風味物質,并且采用不同測定方法,風味物質的檢測結果也不同。研究發現人工發酵酸筍中的酯類含量高于自然發酵,其中乙酸甲酯的含量最高,而醛類含量低于自然發酵,酚類、酮類、酸類則較為接近[30]。郭榮燦等[31]比較研究了廣西發酵酸筍風味物質的不同提取方法,發現液液萃取法和蒸餾萃取法的萃取物質種類分別為34種和24種,而頂空固相微萃取法的萃取物質種類為41種。

3 微生物誘導酸筍風味形成機制

微生物體系的代謝是產生風味物質的主要途徑,通過基因測序的結果構建出酸筍主要風味物質的代謝網絡圖如圖1所示。由圖1可知,碳水化合物代謝、氨基酸代謝是酸筍中微生物的2條主要代謝途徑,其中糖酵解、磷酸戊糖途徑、莽草酸途徑以及三羧酸循環是醛類、酚類和各類氨基酸的主要來源,并且各氨基酸之間,酸、醛、酯之間也可相互轉化。

圖1 酸筍主要特征風味物質形成的代謝網絡圖[38]

3.1 碳水化合物代謝

竹筍中的葡萄糖、蔗糖、果糖是酸筍中微生物代謝的主要能量來源[39],糖酵解、糖異生途徑,丙酮酸代謝以及葡萄糖和蔗糖降解是最為活躍的3條代謝途徑。關倩倩[38]分析了酸筍宏基因組KEGG代謝通路,發現乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、腸桿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、克雷伯氏菌屬通過蔗糖磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸轉移酶系統、β-呋喃果糖苷酶等酶將蔗糖分解為葡萄糖。降解而來的單糖與竹筍原料中的葡萄糖成為糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑直接能量來源,其中糖酵解對酸筍風味的形成至關重要。發酵前期,乳酸菌將葡萄糖轉化為丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等中間代謝產物。隨后,逐漸豐富的乳酸菌參與到糖酵解、丙酮酸代謝等途徑中,其中乳球菌屬、乳桿菌屬等同型發酵乳酸菌經糖酵解途徑將葡萄糖轉化為乳酸,而魏斯氏菌屬、明串珠菌屬等異型發酵乳酸菌則通過戊糖磷酸途徑將葡萄糖轉化為乳酸、乙酸、乙醇和CO2等代謝產物。此外,乳酸菌還能進一步將有機酸轉化為酯類、酮類、醛類等其他揮發性風味物質。

3.2 蛋白質和氨基酸代謝

乳球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬和腸桿菌屬等具有蛋白質水解活性,可將竹筍中的蛋白質水解為肽和氨基酸,氨基酸也可由糖酵解、三羧酸循環的中間產物或有機酸作為前體物質合成。氨基酸又可進一步通過轉氨、脫羧、裂解等轉化為醛類、醇類等風味物質。SONAR等[40]測定了從傳統發酵酸筍中分離的植物乳桿菌、短乳桿菌、彎曲乳桿菌、木糖乳桿菌等的蛋白質水解性能及蛋白酶活性,發現它們在脫脂乳瓊脂平板上均有清晰的酪蛋白水解區,其中木糖乳桿菌的蛋白酶活性高達64.2 nmol/mL。劉艷婷等[41]發現毛竹筍發酵后蛋白質含量從2.2 g/100 g降低到0.89 g/100 g,表明蛋白質在發酵過程中發生了降解,這也是生成風味物質的一條重要途徑。有研究報道纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸在轉氨酶作用下生成α-酮酸,之后經α-酮酸脫羧酶作用轉化為3-甲基丁醛、2-甲基丁醛等醛類物質及對應的醇類物質,與之相關的微生物有乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬,其中乳球菌屬也對芳香族氨基酸表現出較高的活性[42]。

4 小結與展望

酸筍中以乳球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬等為代表的微生物在不同階段發生的演替決定著酸筍生產過程中的風味形成,而風味又是評價酸筍品質的關鍵。因此,研究酸筍中微生物和風味物質及兩者的相關性逐漸成為酸筍研究的熱點,未來可針對以下幾方面展開探索：a)從傳統發酵酸筍中分離出發酵性能優良的菌株制備直投式的酸筍專用復合發酵劑,提高發酵效率,從而用于酸筍的工業化和標準化生產。b)目前酸筍中各類微生物的代謝通路并不明晰,隨著分子生物學技術的發展,利用宏基因組學、宏轉錄組學、蛋白質組學等解析不同微生物的完整代謝途徑及微生物的互作效應,揭示主要微生物的特定功效及其對不同風味物質形成的影響機制。c)對特征性風味物質形成具有較大影響的代謝微生物進行基因改造,通過調節其產酶的類型及酶活力來定向調節特征性風味物質的含量,從而實現酸筍風味品質的定向調控。

酸筍作為一種傳統發酵蔬菜制品,其風味獨特、口感豐富,被稱作螺螄粉的靈魂配料,深受人們的喜愛。以乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、腸桿菌屬等為主的乳酸菌通過代謝產生有機酸、氨基酸以及豐富的揮發性風味物質,賦予酸筍獨特的風味。因此,通過對酸筍中微生物演替和風味物質形成機制的系統研究,將為高品質酸筍的標準化和工業化提供有益依據。