超聲波聯合水楊酸處理對冬棗采后黑斑病的防控研究

郭宇逍,雷興夢,劉搖,鄧麗莉,2,曾凱芳,2,3*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室,重慶,400715) 3(西南大學食品貯藏與物流研究中心,重慶,400715)

冬棗(ZizyphusjujubaMill.cv.‘Dong zao’)風味獨特,皮薄多汁,維生素、礦物質和酚類物質含量豐富[1],深受國內外消費者的青睞,但在采后運輸貯藏期間易受病原菌侵染,導致果實腐爛變質,造成極大的經濟損失。冬棗采后的主要病害是由鏈格孢菌(Alternariaalternata)引起的黑斑病。目前,控制鮮棗采后病害的方法主要有低溫貯藏[2]、氣調貯藏[3]、化學殺菌劑處理等,其中化學殺菌劑處理的效果最好[4],但使用傳統化學殺菌劑后存在生態環境污染、病原菌產生耐藥性等弊端[5]。此外,隨著現代生活水平不斷提高,消費者對果蔬的安全性及營養價值越來越關注,對鮮果貯藏保鮮技術提出了更高的要求。

超聲波(ultrasound,US)是一種新興的技術,已被廣泛用于食品加工研究[6],在食品保鮮領域也有良好的應用前景。主要原因是US在液體介質中傳播時會產生空化效應,使果蔬表面或細胞壁與細胞液間產生局部高溫、高壓、微射流和剪切力,從而滅活微生物、改變酶活性和促進表面微生物脫落等;US處理也可以作為一種輔助手段,與其他處理方式結合產生協同增效作用[7-9]。水楊酸(salicylic acid, SA)是一種天然酚類化合物,參與調控植物生理生化過程,可對環境脅迫的響應,且大量研究證明,在采后使用適當濃度SA處理能夠誘導果實產生抗病性,有效降低果實腐爛率[10-11]。然而,關于US聯合SA處理在采后冬棗應用方面鮮有報道。因此,本文探討了US聯合SA處理對采后冬棗果實黑斑病的控制效果及其機理,以期為冬棗采后黑斑病綜合防控提供理論依據和應用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料為冬棗,采摘自山西省臨汾市(東經111.24°,北緯35.72°)采摘后立即運送至實驗室,于4 ℃冷庫預冷24 h散發田間熱,挑選出大小均勻、成熟度一致、無機械傷的果實備用。

鏈格孢菌(A.alternata)由課題組分離于自然發病棗果實,經分子生物學鑒定后保藏于甘油管中,-80 ℃貯藏。使用前,在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar,PDA)上活化后,25 ℃培養6 d,收集病原菌孢子,血球計數板計數,并用無菌蒸餾水稀釋至1×105spores/mL,4 ℃保存備用。分析純SA,上海阿達瑪斯試劑有限公司;乙腈、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁、香草酸、兒茶酸、綠原酸(均為色譜純),成都普瑞法科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺,蘇凈集團安泰有限公司;PB-10賽多利斯酸度計,德國賽多麗斯股份有限公司;GL-20G-Ⅱ,上海安亭科學儀器廠;JSM-6510LV掃描電鏡,日本JEOL公司;HZQ-F100全溫振蕩培養箱,太倉市實驗設備廠;SYNERGYH1MG全自動酶標儀,美國Bio Tek公司;DDS-307A電導率儀,中國上海INESA公司;LGj-10冷凍干燥機,北京松源華興科技發展有限公司;LC-20AT高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 US聯合SA處理對冬棗損傷接種A.alternata后發病率、病斑直徑的影響

參照LEI等[12]的方法。用2%(體積分數)的次氯酸鈉溶液浸泡冬棗果實2 min,清水沖洗,于室溫條件下自然晾干后,在果實赤道對稱部位打2個孔(直徑3 mm,深度3 mm),每孔接入10 μL 1×105spores/mLA.alternata孢子懸浮液,待菌懸液充分吸收。果實隨機分組,前期通過預實驗對超聲波不同功率、時間和水楊酸不同濃度等處理條件進行了初篩,根據預實驗結果,本實驗按以下條件進行處理：a)對照(Control)：無菌水浸泡冬棗10 min;b)US處理：將冬棗置于US水浴槽中,用420 W超聲波處理10 min;c)SA處理：0.1 mmol/L水楊酸溶液浸泡冬棗10 min;d)US聯合SA處理：將冬棗浸泡在0.1 mmol/L SA溶液中后,置于US水浴槽,再用420 W超聲波處理10 min。處理完后撈出果實,待果實自然晾干后于25 ℃貯藏,每天觀察記錄發病率和病斑直徑,果實出現淡紅或淡黃色水漬狀小病斑,或組織凹陷,果肉顏色由乳紅色轉至黑褐色則視為發病[5]。每組10個果實,重復3次。

1.3.2 US聯合SA浸泡處理對冬棗貯藏期自然腐爛率的影響

果實不進行打孔與接種病原菌處理,其他處理方法同1.3.1節,處理后的棗果實于4 ℃貯藏,每隔7 d觀察記錄一次腐爛率,果實出現發病癥狀則視為腐爛,每組50個果實,重復3次。

1.3.3 US聯合SA處理對A.alternata菌落直徑的影響

參照CHEN等[13]的方法并稍作修改。取900 μL,1×105spores/mL的A.alternata孢子懸浮液于1.5 mL無菌離心管中,分別進行以下處理：a)對照(Control)：向離心管中加入100 μL無菌水,搖勻靜置10 min;b)SA處理：向離心管中加入100 μL 1 mmol/L的水楊酸溶液,充分混勻后靜置10 min;c)US處理：向離心管中加入100 μL無菌水,混勻,420 W超聲波處理10 min;d)US聯合SA處理：向離心管中加入100 μL,1 mmol/L的水楊酸溶液,充分混勻,420 W超聲波處理10 min。取10 μL處理完畢后的孢子懸浮液接種于PDA培養基中心,25 ℃培養,第6天時測量菌落直徑,重復5次。

1.3.4 US處理對A.alternata在果實傷口處附著情況的影響

參考LEI等[12]的方法并稍作修改。在棗果實赤道部位等距離打4個孔(3 mm×3 mm),接種10 μL 1×105spores/mL的A.alternata孢子懸浮液,待菌懸液完全吸收后,置于盛有150 mL無菌水的塑封袋中,420 W超聲波處理10 min,用無菌打孔器(直徑5 mm)取接種處棗果實組織于無菌研缽中,加入10 mL無菌水,研磨至勻漿。將勻漿進行梯度稀釋,涂布,28 ℃靜置培養48 h統計活菌數,記錄果實傷口處的剩余活菌數;同時吸取100 μL塑封袋中的無菌水在PDA上均勻涂布,25 ℃培養,48 h后統計活菌數,記錄被清洗下來的活菌數,以沒有進行超聲波處理的為對照(Control)。實驗重復5次。

1.3.5 掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察US對果實表面蠟質層的影響

冬棗處理：果實處理同1.3.2節,只包含對照組(Control)和US單獨處理組。

SEM樣品處理：參照MENG等[14]的方法并稍作修改。取處理后的棗果實樣品,用無菌美工刀修整樣品(5 mm×3 mm×3 mm),2.5%(體積分數)的戊二醛固定12～24 h,固定結束后,梯度(30%、50%、70%、90%和100%,體積分數)乙醇溶液脫水處理,脫水完成后,用梯度濃度的叔丁醇(50%、70%、90%和95%,體積分數)依次置換,100%的叔丁醇置換2次,每次10 min,置換完成后于真空干燥箱中干燥2 h(65 ℃,0.8 kPa)。干燥完成后的樣品進行噴金鍍膜后于掃描電鏡下觀察。重復3次。

1.3.6 冬棗果皮SA含量的測定

果實前處理同1.3.2節。果實隨機分組,按以下方法處理：a)SA處理：0.1 mmol/L SA溶液浸泡冬棗10 min;b)US聯合SA處理：將冬棗浸泡在0.1 mmol/L SA溶液中后,置于US水浴槽,再用420 W超聲波處理10 min。處理完后立即取整個果實的果皮樣品(厚度1 mm)。SA的提取和測定參照林文芳等[15]的方法并稍作修改。液相色譜條件：選用熒光檢測器,激發波長305 nm,發射波長407 nm;色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18柱;流動相：V(甲醇)∶V[乙酸鈉緩沖液(50 mmol/L pH 5.4)]=1∶9;流速：0.8 mL/min;進樣體積：10 μL;柱溫：40 ℃。

1.3.7 US聯合SA處理對冬棗抗病性的影響

果實處理方法同1.3.2節。將處理完的果實4 ℃貯藏,在處理后每7 d取厚度3～5 mm的果皮果肉組織,將其切碎后放入液氮中迅速冷凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.7.1 發病率與病斑直徑

將上述處理完的果實室溫靜置24 h后,在果實赤道對稱部位打2個孔(直徑3 mm,深度3 mm),每孔接入10 μL 1×105spores/mL的A.alternata孢子懸浮液,待菌懸液充分吸收后,25 ℃貯藏,接種后每天測量果實的發病率和病斑直徑。每組10個果實,重復3次。

1.3.7.2 酶活性測定

過氧化物酶(peroxidase,POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase,PAL)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性測定參考曹建康等[16]的方法。PAL活性：以每小時吸光度值變化1為一個酶活力單位(U);POD活性：以每分鐘吸光度值變化1為一個酶活力單位(U);PPO活性：以每分鐘吸光度值變化0.01為一個酶活力單位(U),結果均以U/g表示。

4-香豆酸輔酶A(4-coumaric acid coenzyme A,4CL)活性測定參考梁偉等[17]的方法并稍作修改：稱取少量冬棗樣品,置于研缽中用液氮研磨至粉末,準確稱取5.0 g樣品于離心管中,加入1.5 mL上海源葉生物科技有限公司的提取液,然后于4 ℃,10 000 r/min條件下離心30 min,分離的上清液即為酶提取液。反應體系：0.90 mL 7.5 μmol/L硫酸鎂,0.30 mL 50 nmol/mLp-香豆酸,0.30 mL 2.5 μmol/mL ATP,0.30 mL 38 nmol/mL CoA以及1.0 mL酶液。25 ℃下混勻靜置10 min,在333 nm處測定吸光度值,以吸光度值每分鐘變化0.01為1個酶活力單位(U),結果以U/g表示。

1.3.7.3 游離酚類、結合酚的提取和測定

參考李葦舟[18]的方法。HPLC條件：檢測器：日本島津LC-20A二極管陣列檢測器(diode array detector,DAD);色譜柱：Thermo BDS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A：0.2%(體積分數)甲酸水溶液;流動相B：100%乙腈,洗脫梯度：0～5 min 10% B;5～50 min,10%～40% B;50～55 min 40%～90% B;55～62 min 90% B;62～65 min 90%～10% B;65～75 min 10% B,柱溫30 ℃,流速：0.7 mL/min,進樣量：20 μL。

1.3.7.4 總酚和總黃酮含量的測定

總酚和總黃酮的測定使用1.3.7.3節的提取液測定。總酚含量測定參考李葦舟[18]的方法。

總黃酮含量測定參考陳力維等[19]的方法,采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量,以蘆丁為標準品,于510 nm處測定吸光度值,結果以每克樣品中所含的蘆丁當量表示。

1.4 數據處理

運用Excel 2016統計分析所有得到的數據,應用GraphPad Prism 8軟件制圖;運用SPSS 21.0軟件對數據進行方差分析,利用Duncan′s多重比較進行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 US聯合SA處理對冬棗損傷接種A.alternata后發病率、病斑直徑的影響

如圖1所示,US和SA單獨或聯合處理均能夠顯著降低冬棗貯藏期間黑斑病的發病率(圖1-A)和病斑直徑(圖1-B),其中US和SA聯合處理效果最顯著;在貯藏第11天時聯合處理組的發病率和病斑直徑分別比對照減小39.33%和51.25%,研究結果表明,US處理能夠顯著增強SA對冬棗果實采后黑斑病的防控效力。

A-發病率;B-病斑直徑圖1 US聯合SA處理對冬棗采后黑斑病的控制效果

2.2 US聯合SA浸泡處理對冬棗貯藏期腐爛率的影響

由圖2可知,各個處理組冬棗果實的腐爛率在整個貯藏期間(35 d)的均顯著低于對照組(P<0.05),聯合處理組棗果實的腐爛率最低,在貯藏第14、21和28天時,US聯合SA處理組的,腐爛率分別比對照下降了17.78%、28.89%和37.78%。說明US、SA單獨處理以及聯合處理均能夠有效控制冬棗果實采后病害,其中聯合處理的防治效果最佳。

圖2 US和SA聯合處理對冬棗低溫貯藏期腐爛率的影響

2.3 US聯合SA處理對A.alternata菌絲生長的影響

由圖3可知,經US和SA單獨處理后的A.alternata菌落直徑與對照組相比顯著差異,但US和SA聯合處理顯著抑制菌絲生長(P<0.05),聯合處理組的菌落直徑比對照小2.75 mm(圖3-A)。說明US和SA處理對A.alternata菌絲具有協同抑制作用。

A-菌落直徑;B-Control;C-US;D-SA;E-US+SA圖3 US和SA聯合處理對A.alternata菌落直徑的影響

2.4 US處理對果實傷口處A.alternata孢子附著的影響

利用活菌數評估US處理對果實傷口處A.alternata孢子附著的影響(圖4)。研究結果表明,US處理組果實傷口處剩余活菌數顯著低于對照組(圖4-A),且清洗水中US處理組的活菌數顯著多于對照組(圖4-B),說明US降低A.alternata在棗果實傷口處的附著量。以上結果說明US對A.alternata的清洗作用是其有效控制棗果實采后病害的機制之一。

2.5 US聯合SA處理對果皮中SA含量的影響US聯合SA處理對SA滲透的影響

圖5所示,通過掃描電鏡觀察發現,對照組果實(圖5-A)表面光滑、連續性好,經US處理(圖5-B)后的果實表面變得粗糙,形成微裂紋,US處理可能使棗果皮表面蠟質層形成微小縫隙促進SA向果實滲透;進一步通過高效液相色譜測定棗果實表皮中SA的含量,結果表明US聯合SA處理后棗果皮中SA含量顯著高于SA單獨處理組(圖5-C)。說明US處理能夠促進SA向棗果實表皮滲透,進而更好地發揮作用控制棗果實采后病害。

A-對照的棗表面SEM圖;B-US處理后的棗表面SEM圖;C-SA單獨、US聯合SA處理后的棗果皮SA含量圖5 US處理對棗果實表面的蠟質層和SA含量的影響

2.6 US聯合SA處理對冬棗抗病性的誘導作用

2.6.1 US聯合SA處理對冬棗黑斑病發病率和病斑直徑的影響

為探究US聯合SA處理對冬棗抗病性的誘導作用,研究采用先處理后接種病原菌的方式,實驗結果如圖6所示。與對照相比,US和SA單獨或聯合處理均能顯著降低果實發病率(圖6-A)和病斑直徑(圖6-B),US和SA聯合處理控制病害效果顯著優于US和SA單獨處理,在貯藏第9天時US和SA聯合處理發病率和病斑直徑分別比對照小41.15%和55.80%。說明US和SA處理能夠通過誘導冬棗果實產生抗病性,從而防治棗果實采后黑斑病,而US聯合SA處理的控制效果最佳。

A-發病率;B-病斑直徑圖6 US聯合SA處理對誘導冬棗抗病性的影響

2.6.2 US聯合SA處理對冬棗防御相關酶活性的影響

如圖7顯示,隨貯藏時間延長,棗果實中POD、PAL、4CL 3種酶活性均呈現先上升后下降的趨勢;在貯藏前期和中期(0～21 d),PPO活性隨著貯藏時間的延長緩慢降低,且處理組和對照組PPO活性無顯著性差異,在貯藏后期(28～35 d),PPO活性迅速提高,且US聯合SA處理組的活性顯著高于對照組(圖7-D),在冬棗貯藏第35天時,US聯合SA處理組的POD、PAL、4CL、POD酶活性分別是對照組的1.63、1.35、1.45、4.06倍。說明US聯合SA能誘導抗性相關酶活升高,提高果實抗病性。

2.6.3 US聯合SA處理對總酚和總黃酮含量的影響

由圖8可知,隨貯藏時間延長,對照組以及US聯合SA處理組的總酚含量(圖8-A)先升高后降低,處理組的含量均顯著高于對照組,在第7天時,處理組比對照組高68.11%;對照組和處理組總黃酮含量(圖8-B)呈現先上升后下降的趨勢,處理組總黃酮的含量均顯著高于對照組,且第7天達到最大值,此時的處理組比對照組高48.09%。說明US聯合SA能提高果實貯藏期間的總酚和總黃酮含量,促進果實中總酚和總黃酮的積累。

A-總酚含量;B-總黃酮含量圖8 US聯合SA處理對總酚和總黃酮含量的影響

2.6.4 US聯合SA處理對游離酚與結合酚含量的影響

由圖9、圖10可知,US聯合SA處理組的表兒茶素、阿魏酸、香草酸3種游離酚含量和阿魏酸、兒茶素2種結合酚含量都顯著高于對照組,但游離綠原酸、蘆丁含量無顯著差異。游離表兒茶素(圖9-A)含量先升高后降低,對照組和處理組分別在14 d和21 d達到最大,并且整個貯藏期間處理組顯著高于對照組;貯藏前期游離阿魏酸含量(圖9-B)與對照無顯著差異,在后期顯著高于對照;在貯藏第14天時,處理組游離蘆丁含量(圖9-C)顯著高于對照組;游離香草酸含量(圖9-D)一直處于上升趨勢,且處理組顯著高于對照;游離綠原酸含量(圖9-E)與對照無顯著差異;結合阿魏酸(圖10-A)呈逐漸下降趨勢,對照組在第28天后降為0,貯藏后期處理組顯著高于對照組;從貯藏0 d到7 d,結合兒茶素含量(圖10-B)迅速上升,在第21天和35天時,處理組顯著高于對照組。

3 討論

冬棗果實在采后極易發生真菌潛伏侵染性病害而造成重大損失,其中由A.alternata引起的黑斑病是其采后最主要的病害之一,有效控制棗果實采后病害是棗產業可持續發展的重要組成部分。US和水楊酸作為綠色的防控方式,以其高效、便捷、無殘留等優勢受到廣泛關注,本文探究了US聯合水楊酸SA處理對冬棗采后黑斑病的防控效果及其機理,研究發現US聯合SA處理能顯著控制冬棗采后黑斑病、降低冬棗貯藏期的腐爛率,并優于單獨處理;進一步對其控病機理進行探究,發現US聯合SA處理可以通過直接抑制A.alternata生長、減少傷口處A.alternata孢子的附著、促進SA向果實滲透、通過提高抗性相關酶活性、促進活性物質積累提高棗果實的抗病性,控制棗果實采后黑斑病,延長果實保質期。

US聯合水楊酸SA處理對冬棗采后黑斑病的防控具有協同作用,與單獨處理相比,US聯合SA處理能更顯著地抑制棗黑斑病的發病率、病斑直徑和低溫貯藏期的腐爛率,這與BAL等[20]的研究結果一致,SA聯合US處理能夠更有效地控制櫻桃采后病害。雖然US單獨處理在貯藏前期也能顯著降低腐爛率,但到后期腐爛率增大,與對照無差異,這可能是US處理后出現的應激反應[21]。超聲波作為新型綠色物理防控方式,在果蔬采后病害的防治中廣泛研究,人們更多將其與其他防治方式聯合使用,TAKUNDWA等[22]研究發現,US聯合771.2 IU/g乳酸鏈球菌素和0.185%(體積分數)牛至處理生菜14.65 min,大腸桿菌和單核增生李斯特菌的數量均顯著減少;超聲聯合熱處理能抑制多種腐敗細菌、霉菌和酵母的生長繁殖[23]。清洗和殺菌作用是超聲波防控機制之一,本實驗中發現,US能減少病原菌在棗果實傷口處的數量,并且US與SA聯用時還能顯著抑制菌絲生長,這可能是由于US處理產生的高溫高壓,有利于化學試劑透過細胞膜[24],同時使微生物分散,更容易受到化學試劑的作用,從而促進微生物死亡和分解[25]。除此之外,US的空化效應對果實產生了物理效果,本實驗通過觀察US處理后果實表面蠟質層的形態并測定果皮SA含量,證明US處理有利于SA與果實接觸,促進SA滲透,也可能是由于US空化效應能改變果實組織的顯微結構,形成許多微觀通道,對果實組織的傳質有積極作用[26]。ZHANG等[27]在研究中也有類似發現,US和乳酸鈣單獨或聯合處理番茄時,聯合處理組果實中鈣含量顯著增加,說明US能夠促進外源鈣在水果組織中的滲透。

近年來,研究發現大多數處理可以通過誘導宿主對病原微生物的廣譜抑菌和長效防御來達到防治果蔬采后病害的目的,果蔬的所有復雜的生化反應都受酶的調節,PPO、POD、PAL、4CL等抗性相關酶活性的高低和果實抗逆能力的強弱密切相關[28]。本文發現經US聯合SA處理后,低溫貯藏期間冬棗果實中的PPO、POD、PAL、4CL活性均顯著升高,可能是由于一定強度及頻率條件下US產生的空穴作用、機械振蕩作用等,能改變酶分子構象,暴露更多的酶活性位點,同時加速傳質,增加酶和底物的碰撞頻率,使酶與底物相互作用的機會大大提升[29-30]。董生忠等[31]的研究中也發現,相比于對照組,50 kHz,200 W的US和0.9 μL/L 1-MCP單獨或聯合處理蘋果5 min,在整個貯藏期間,US單獨或聯合處理均能不同程度的提高POD、PPO兩種酶活性,且聯合處理效果最顯著。類似的,YANG等[32]發現,40 kHz,350 W的US聯合0.05 mmol/L SA處理桃果實10 min,在貯藏期第2天,PAL活性由低到高依次為：對照、US單獨處理組、SA單獨處理組、US聯合SA處理組。除了提高酶活性,作為具有較強抗氧化活性的總酚、黃酮,以及酚酸組分阿魏酸、表兒茶素、沒食子酸等物質,在本文的聯合處理組中均顯著高于對照組,這些次生代謝產物不僅能保護細胞抵御活性氧毒害,還能抑制真菌孢子萌發和菌絲體生長、抑制病原微生物浸染等,可以有效提高果實抗病性[28,33]。綜上,US聯合SA處理可通過抑制A.alternata生長、減少傷口處A.alternata的附著、促進SA向果皮滲透、提高棗果實低溫貯藏期間抗性相關酶活性、促進抗氧化活性物質和抑菌物質的積累,從而增強果實抗病性,降低腐爛率。

4 結論

本研究基于綠色物理防控技術的角度,以新鮮冬棗為實驗材料探究了US聯合SA處理對冬棗采后黑斑病的防控效果及其機理。研究結果表明420 W US和0.1 mmol/L SA對冬棗進行單獨或聯合處理均能夠有效控制棗果實采后黑斑病,其中US和SA聯合處理的控制效果最佳。進一步從病原菌及棗果實兩方面對其作用機制進行探究。一方面,研究發現US和SA聯合處理能夠直接抑制A.alternata菌絲生長;US處理能減少A.alternata在果實傷口處的附著,促進SA滲透向棗果實表面滲透。另一方面,US和SA聯合處理能夠通過提高棗果實抗氧化相關酶(PPO、POD、PAL、4CL)的活性以及促進抗病相關物質(總酚、總黃酮以及游離表兒茶素、阿魏酸、香草酸和結合阿魏酸、兒茶素)的積累,誘導棗果實抗病性,從而提高棗果實對病害的防御能力,從而降低果實腐爛率。綜上,US聯合SA處理對冬棗采后黑斑病具有良好的控制效果,能夠應用于冬棗果實采后病害的綠色防治。