泡椒汁中耐受辣椒素乳酸菌的篩選及其耐受性研究

李宏洋,張通化,羅麗蓉,李升

1(貴州大學 生命科學學院,貴州 貴陽,550025)2(貴州大學 農業生物工程研究院,貴州 貴陽,550025)

泡椒是我國一種傳統的發酵食品,由于其獨特的風味和營養益生作用而深受人們的喜愛[1]。泡椒口感辛辣中帶酸,具有增進食欲、促進血液循環、調理腸胃和促進消化等作用。泡椒的辣味和酸味是其最基本的味道,同時也是泡椒特有的風味之一,辣味和酸味相互作用,形成了獨特的口感和滋味[2]。乳酸菌是發酵辣椒的主要菌群,發酵過程中產生的乳酸和乙酸貢獻了泡椒的主要酸味[3],并降低食物基質的pH值,從而創造出一種抑制腐敗菌和致病菌生長的環境,這種作用有助于延長食品的保質期并提高其安全性。辣椒素是引起辣椒辛辣的主要成分,屬于香草類化合物家族中的一種極度辛辣的生物堿,化學式為C18H27NO3[4-5]。由于強烈的刺激性和生物活性,辣椒素具有廣泛抗菌作用[6],可以有效地抑制如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和霉菌等多種病原微生物的生長代謝[7-8],當辣椒素濃度超過一定質量濃度(0.133 g/L)時,也會對乳酸菌細胞產生傷害作用[9]。研究表明,不同品種的辣椒對發酵辣椒制品的品質及風味具有較大影響[10],不同批次的泡椒質量與風味不同,品質不穩定[11],這可能與辣椒的辣度以及自然發酵過程參與的菌株種類有關。篩選出耐受辣椒素的乳酸菌,作為強化發酵候選菌株應用于泡椒工業生產,取代傳統自然發酵,可為更好利用辣椒和乳酸菌資源提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株來自于四川綿陽市和德陽廣漢市農家自制泡椒鹵水,年限分別為6年和5年;商用菌株CICC 6239購于中國工業微生物菌種保藏管理中心;MRS肉湯及瓊脂培養基培養基,杭州百思生物技術有限公司;CaCO3、NaCl、NaOH,國藥集團化學試劑有限公司;辣椒素標準品,索萊寶科技有限公司;乳酸菌成套生化鑒定管,上海撫生實業有限公司;細菌基因組DNA 提取試劑盒、RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、革蘭氏染色液,塞維爾生物科技有限公司。

辣椒素母液制備：用無水乙醇溶解配制30 g/L的辣椒素母液溶液,0.22 μm濾器過濾除菌,4 ℃貯存備用。

1.2 儀器與設備

辣度快速檢測儀,北京盈盛恒泰科技有限責任公司;恒溫水平搖床,塞維爾生物科技有限公司;酶標儀、高速冷凍離心機、全自動高壓滅菌鍋,美國 Thermo公司;便攜式電導率儀,上海雷磁儀器廠;S-3400 N掃描電子顯微鏡;HITACHI(日立)公司;PCR儀、熒光定量PCR儀,美國伯樂。

1.3 試驗方法

1.3.1 泡椒汁的辣度測定

參照GB/T 21266—2007中辣椒素類物質總量計算方法,測定的泡椒汁的斯科維爾指數并換算其辣椒素含量。

1.3.2 菌株的分離純化

將1 mL泡椒老鹵水用生理鹽水倍比稀釋后取100 μL樣液涂布至含0.7 g/L辣椒素、15 g/L CaCO3的MRS瓊脂平板上,37 ℃培養 48 h,根據溶鈣圈和形態特征挑選菌落并進行革蘭染色和過氧化氫酶試驗。

1.3.3 耐受辣椒素菌株的篩選

高濃度辣椒素極易從培養基析出,且溶劑乙醇體積分數較高會抑制菌株的生長,因此根據菌株在較低濃度辣椒素脅迫下的相對生長率進行篩選。將1.3.2節保存的菌株活化2代后,用生理鹽水稀釋至1.0×108CFU/mL制成菌懸液(下同)。根據辣椒素對乳酸菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為0.133 g/L,將Y-6的菌懸液以1%比例接種到0.2 g/L辣椒素MRS液體培養基中,37 ℃, 160 r/min搖床培養,測定0和24 h的OD600nm值,空白培養基作為對照組,將生長狀況好的菌株在0.3、0.4和0.5 g/L辣椒素MRS培養基中復篩,3次重復試驗。通過公式(1)計算相對生長率。

(1)

式中：R,相對生長率,%;a和b為無辣椒素培養基中24和0 h的OD600nm值;c和d為加有辣椒素培養基中24和0 h的OD600nm值。

1.3.4 菌種鑒定

使用pH計和GB 12456—2021 中的酸堿滴定法每2 h測定菌株pH和酸度變化;生理生化鑒定：乳酸菌成套生化鑒定管;16S rDNA 序列分析：提取菌株的基因組DNA[12],以27 F和1492 R為引物進行PCR擴增,PCR產物送上海生工測序,MEGA 7.0 繪制系統進化樹,確定菌株種屬。

1.3.5 辣椒素對乳酸菌的生長抑制作用

將Y-6菌懸液以1%接種量接入0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 g/L辣椒素MRS培養基中,37 ℃,160 r/min培養24 h,測定其OD600 nm值,以未接菌培養基為空白對照,抑菌率按式(2)計算,并用GraphPad Prism 9軟件計算辣椒素的 IC50值,3次重復。

(2)

式中：OD對照,空白處理組OD600nm值;OD處理,辣椒素處理組OD600nm值。

1.3.6 辣椒素對乳酸菌細胞膜通透性的影響

將Y-6菌懸液以1%的比例接入MRS液體培養基中,160 r/min,37 ℃振蕩培養至菌濃度達到1.0×108CFU/mL時,加入辣椒素使其終濃度為IC50值。取3 mL菌液4 000 r/min離心10 min吸取上清液,分別測定0、1、2、3、4 和5 h上清液的電導率;測量0、2、4、6、8和10 h上清液OD260nm與OD280nm值[13],商用菌株6239為對照,無菌水為空白對照。

1.3.7 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)分析

將Y-6懸液以1%的比例分別接入空白培養基和0.57 g/L辣椒素MRS液體培養基中,37 ℃,160 r/min培養12 h,5 000 r/min離心10 min,棄上清液,沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌2次后用2.5%的戊二醛4 ℃固定過夜。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌樣品3次后使用30%、50%、70%、90%、100%(體積分數)乙醇溶液依次進行梯度脫水處理,最后將所有樣品放在真空蒸發器中。鍍一層金屬膜,使用S-3400 N掃描電鏡觀察菌體細胞的變化,以商用菌株6239為對照。

1.3.8 熒光定量PCR

將Y-6菌懸液以1%的比例接入空白培養基和0.57 g/L辣椒素MRS培養基中,37 ℃,160 r/min培養,收集對數生長期(空白對照組8 h和處理組12 h)的菌體,Trizol法提取細菌總RNA后進行反轉錄[14]。以16SrRNA為內參基因,檢測通用應激蛋白usp、ABC轉運蛋白滲透酶、滲透保護劑轉運系統-ATP結合蛋白(opuA)、滲透保護劑轉運系統-透性酶蛋白(opuB)和滲透保護劑轉運系統-底物結合蛋白(opuC)、乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase)：ldh和磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase)：pgk等7個與辣椒素耐受性相關的基因在辣椒素處理前后的表達量變化,每個處理3次重復。

1.4 數據處理

本試驗數據以3 次重復的平均值±標準差表示,Excel 2010進行數據分析,Graph Pad Prism9.0作圖并計算辣椒素的 IC50值。用IBM SPSS Statistics 26軟件Duncan 法對各數據進行顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 耐受辣椒素乳酸菌的篩選

2.1.1 初篩

通過測定泡椒汁的辣椒素含量為(0.685±0.016) g/L,在此基礎之上以0.7 g/L辣椒素濃度對耐受菌株進行初篩,得到30株生長良好、溶鈣圈明顯、革蘭氏染色陽性以及過氧化氫酶測定為陰性的菌株,并分離純化后保存。

2.1.2 復篩

在0.2 g/L辣椒素處理下,30株乳酸菌對辣椒素均有一定的耐受能力,選擇相對生長率在90%以上的8株菌株(表1),進一步復篩(0.3、0.4和0.5 g/L),結果表明菌株Y-6在0.5 g/L辣椒素下的生長率仍在70%以上,其余菌株雖有生長,但其長勢較差(表2)。基于此,我們選擇菌株Y-6為后續的試驗材料。

表1 乳酸菌在0.2 g/L辣椒素培養基中的生長情況Table 1 The growth of lactobacillus in contained 0.2 g/L capsaicin medium

表2乳酸菌在含有不同辣椒素濃度培養基中的生長情況Table 2 The growth of lactobacillus in contained different concentration capsaicin medium

2.2 耐受辣椒素乳酸菌的鑒定

2.2.1 形態觀察

通過形態學鑒定發現菌株Y-6的菌落為乳白色,形狀呈凸起,圓形,濕潤、表面光滑細密,不透明但有光澤,無芽孢(圖1-a),革蘭氏染色結果表明,菌株Y-6菌體呈紫色、桿狀(圖1-b)的革蘭氏陽性菌。

a-菌落形態;b-光學顯微鏡下細胞形態圖1 菌落形態學特征

2.2.2 生理生化鑒定

對菌株Y-6的產酸測定結果表明,其菌液pH值隨著時間的推移而逐漸降低,酸度增加,在20 h趨于穩定,pH值為3.93±0.01,24 h其酸度值達到140 °T(圖2);過氧化氫酶試驗、VP試驗、靛基質試驗結果均為陰性,甲基紅(M.R)試驗為陽性;糖酵解試驗結果表明,菌株Y-6可利用七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖、木糖和阿拉伯糖(表3)。

圖2 菌株Y-6 24 h下的pH和酸度變化

表3 菌株Y-6的生理生化鑒定結果Table 3 Physiological and biochemical identification results of strain Y-6

2.2.3 16S rDNA 序列分析

對菌株Y-6進行16S rDNA 擴增測序并與GenBank 數據庫進行 BLAST 同源性序列比對,使用Megalign程序的鄰接法繪制系統發育樹(圖3),菌株Y-6與植物乳桿菌3596 (登錄號：MT538471.1)的序列以100%的置信度聚在一起,親緣關系最近。

圖3 菌株Y-6和相關菌株的系統發育樹

2.3 耐受辣椒素乳酸菌的耐受性研究

2.3.1 辣椒素對乳酸菌的生長抑制作用

通過對菌株Y-6生長率的測定發現,在0.25 g/L辣椒素處理下,對數期時間點為8 h,穩定期時間點為16 h,作用效果小,與空白對照組一致;在0.5 g/L辣椒素處理下,對數期時間點為12 h,穩定期時間點為28 h。無論是在0.25 還是0.5 g/L辣椒素的脅迫下,并未顯著地降低穩定期(32 h)的OD600nm值,而在高濃度(≥1.0 g/L)辣椒素處理下,菌株不生長或生長緩慢,相對生長率僅10%左右(圖4)。

圖4 不同濃度辣椒素對菌株Y-6的生長的影響

對菌株Y-6和6239在不同濃度辣椒素處理下的生長比較發現,在0.1 g/L的辣椒素處理下2株菌的生長無差異性,辣椒素的作用低;隨著辣椒素濃度的升高,菌體受到的抑制程度隨之增加,但相比于6239,菌株Y-6均保持較高的活性(圖5)。

圖5 不同菌株的辣椒素耐受性比較

通過對菌株Y-6進行辣椒素IC50的測定發現,辣椒素質量濃度為0.5 g/L時,抑菌率(28.53±0.04)%;在辣椒素質量濃度為0.6 g/L時,抑菌效果顯著性升高,抑菌率為(54.38±0.01)%,已超過辣椒素的半抑制濃度;在辣椒素質量濃度為0.7 g/L時,抑菌率為(76.42±0.01)%,與0.8 g/L的抑菌率無顯著差異(P<0.05),選擇IC50(0.571 g/L)進行后續實驗(圖6)。

圖6 菌株Y-6在不同濃度辣椒素處理下24 h的存活率

綜上,高濃度辣椒素可以致死乳酸菌,使其不生長或生長緩慢,低濃度辣椒素增長了菌株的滯后期,且隨濃度的增大抑制效果更明顯;菌株Y-6的IC50為0.571 g/L;相較于菌株6239,Y-6受辣椒素生長抑制作用更低。

2.3.2 辣椒素對乳酸菌細胞膜完整性的影響

相對電導率可反映菌體細胞膜通透性變化,0.57 g/L辣椒素處理下菌株Y-6和6239在0～1 h的胞外電導率呈現出上升的趨勢,1 h均達到最大值,分別為6.36±0.31和7.69±0.008;在2～5 h出現緩慢的下降趨勢,但仍高于空白處理組(圖7);菌株Y-6與6239在2～10 h的OD260nm和OD280nm值均高于空白對照組,結果表明在辣椒素作用下乳酸菌細胞膜的通透性增加,促進了胞內核酸和蛋白等內容物的釋放,導致電導率、OD260nm和OD280nm值升高;但辣椒素處理下Y-6的胞外電導率均低于6239,且核酸OD260nm值和蛋白OD280nm值在2 h后趨于恒定,比6239所需的時間(4 h)更短,表明菌株Y-6相較于菌株6239對辣椒素能更快適應(圖8)。為進一步研究Y-6對辣椒素的耐受性,通過SEM對菌株Y-6和6239的細胞形態觀察。未加辣椒素組下的菌株6239和Y-6的細胞形態完整、輪廓清晰呈桿狀,表面光滑,無顆粒物無膨脹皺縮現象,未見細胞破損,表明細胞膜完整,細胞處于正常狀況;辣椒素處理下菌株6239細胞變形嚴重,失去光澤,細胞出現皺縮和扭曲等形態,發生粘連,界限模糊,細胞發生破損,有明顯的損傷;菌株Y-6在辣椒素處理下部分細胞出現和扭曲和皺縮等形態,但仍能保持細胞膜完整(圖9)。

圖7 辣椒素處理下菌株Y-6和6239的電導率

a-菌株Y-6和6239的蛋白泄露;b-菌株Y-6和6239的核酸泄露圖8 辣椒素處理下菌株Y-6和6239的蛋白和核酸泄漏

綜上,辣椒素通過破環乳酸菌的壁膜結構從而抑制菌體的生長,而Y-6在辣椒素脅迫下可能存在一定的應激反應機制使得其適應環境,相較于商用菌株6239對辣椒素有更高的耐受性。

2.3.3 乳酸菌對辣椒素的耐受調節

選取的7個基因在辣椒素處理下均顯著上調,與空白對照組的表達有顯著性差異(P<0.01),菌株Y-6對辣椒素有一定的耐受性,揭示表明菌株通過提高通用應激蛋白基因usp(3.37±0.04)等熱激蛋白基因的表達應對辣椒素引起的脅迫,保證細胞壁膜的完整性而維持生長;菌株通過自身抑制分裂周期,以求在這種不利條件下存活,所以增加了其生長的滯后期(圖4),通過opuA(4.06±0.05)、opuB(6.39±0.38)和opuC(7.32±0.53)等相容性溶質調控系統基因以及ABC轉運蛋白滲透酶基因(23.24±0.43)的表達上調維持菌體滲透壓的平衡,使其能在辣椒素的環境中適應耐受;最后通過提高與生長代謝相關的如ldh(3.85±0.05)和pgk(3.49±0.06)等糖酵解相關基因的表達,逐漸恢復自身的生長代謝以耐受較高濃度的辣椒素(圖10)。

圖10 選取基因在對數生長期受辣椒素誘導表達情況

3 討論與結論

辣椒素是引起辣椒辛辣的主要成分,具有較好的抗菌活性,通過誘導滲透脅迫元件以及膜生物合成和轉運體網絡的關鍵基因的表達,抑制核糖體成分和生長相關基因等抑制細菌生長[15],大多數革蘭氏陰性菌(包括大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和變形桿菌)的MIC為0.512 g/L,而對革蘭氏陽性菌(如甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的MIC為0.256 g/L;枯草芽孢桿菌MIC為0.128 g/L[16],測定的泡椒汁辣椒素含量為(0.685±0.016) g/L,可有效地抑制病原菌的生長,是篩選耐受辣椒素乳酸菌的主要來源之一,篩選到的菌株Y-6對辣椒素有一定的耐受性,在0.5 g/L下的生長率仍在70%以上,經形態學觀察、生理生化試驗和16S rDNA 序列分析[17]鑒定為植物乳桿菌。

細胞壁膜是多種抗菌劑的直接作用靶標[18],辣椒素破環了菌株Y-6和6239細胞膜的完整性,導致其電導率、OD260nm和OD280nm值均升高,細胞出現一定的皺縮變形等。研究表明辣椒素能破壞肽聚糖結構[19],致使病原菌的細胞膜破壞成孔而達到抑菌作用[20]。辣椒素的酚羥基會改變致病菌的疏水性和細胞質膜中負表面電荷的減少;導致局部破裂和孔形成,在細胞膜中形成孔,產生結構損傷和抑制作用[21],作為一類生物堿,辣椒素可抑制細菌的外排泵活性[22-23]和增加胞外滲透壓[24]致使細胞膜受損而壞死。菌株Y-6在0.57 g/L辣椒素處理下仍能保持細胞形態的相對完整,相關研究表明乳酸菌可誘導專門的修復機制適應不良環境[25],菌株通過上調表達usp等熱激蛋白相關基因維持細胞膜流動性和蛋白質穩定,另一方面,調節opuA、opuB和opuC等相容性溶質調控系統基因以平衡細胞內和細胞外滲透壓之間的差異[26],ABC轉運蛋白滲透酶基因的表達上調可降低藥物對菌株的細胞毒性,提高了菌株的耐受性[27]。辣椒素增長了菌株的滯后期,且濃度越大抑制效果越明顯。0.5 g/L辣椒素下乳酸菌的對數生長期時間點從8 h延滯到12 h,穩定期時間點從16 h延滯到28 h,這是因為菌體可系統調節影響菌體細胞的活性和抑制分裂周期以求在不利條件下存活[28],在適應一段時間后(對數生長期)又提高通過乳酸脫氫酶ldh基因和和磷酸甘油酸激酶基因pgk基因等糖酵解相關的酶活性恢復自身的生長和代謝,最終也能達到最高的生長數量。

植物乳桿菌Y-6對辣椒素有一定的耐受性,可作為高辣度辣椒的發酵劑,為發酵辣椒的工業化生產提供一定理論依據。