低溫等離子體對金鯧魚肌原纖維蛋白結構特性的影響

徐杰,徐雯晴,孫欽秀,2,3*,王澤富,3,高加龍,3,吉宏武,3,劉書成,3

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋食品工程技術研究中心,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東 湛江,524088) 2(江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室,江蘇海洋大學,江蘇 連云港,222005) 3(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,大連工業大學,遼寧 大連,116034)

金鯧魚(Trachinotusovatus)是中國五大海水養殖經濟魚類之一,富含蛋白質等多種營養物質[1]。但是由于金鯧魚含有較高的水分含量以及自身所含酶類使蛋白質降解成小分子產物,這有助于微生物快速繁殖發生腐敗變質,通過殺菌技術可以延緩金鯧魚品質劣變,延長貨架期[2]。目前食品中常見的殺菌技術主要包括熱殺菌技術和非熱殺菌技術。傳統熱殺菌技術雖然能夠有效殺滅食品中的微生物,但高溫也會對食品的感官特性和風味等產生不良影響[3]。

低溫等離子體(cold plasma,CP)被稱為固態、液態、氣態之外的物質第四態,是由活性物質(活性氮和活性氧等)、帶電粒子、自由電子等組成的一種電離氣體[4]。CP作為新型非熱加工技術,具有作用溫度低、不含化學物質、環保、操作成本低等優點,在殺滅各類常見微生物、延長食品貨架期、替代食品添加劑等方面具有重要作用[5-7]。

目前,CP已廣泛應用于食品保鮮,如亞洲鱸魚、帶魚、南美白對蝦以及豬肉等[7-8]。本研究前期發現,CP處理金鯧魚可以有效抑制腐敗微生物的生長,且電壓越高,抑菌效果越好,但過高電壓會導致肌肉品質劣變。這可能是因為CP體系中含有的活性氮、活性氧等物質使蛋白發生氧化,改變蛋白質結構特性,進而影響食品品質[8]。PéREZ-ANDRéS等[9]發現CP處理可以加速鯖魚中羰基的形成,造成蛋白質不可逆損傷。但也有研究指出,對蛋白質進行適度氧化修飾,可能會改善肉品的加工特性和品質,如提升肉品在人體的消化吸收率、產生特定風味以及提升嫩度和保水性等[10]。

因此,本研究以金鯧魚為研究對象,探究不同低溫等離子體電壓(10、20、30 kV)處理對金鯧魚肌原纖維蛋白(myofibrillar proteins,MP)的Ca2+-ATP酶活性、肌原纖維小片化指數(myofibrillary fragmentation index,MFI)、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶解肽、總氨基酸含量、二級結構變化(紅外光譜)、三級結構變化(表面疏水性、紫外吸收光譜)等的影響,結合SDS-PAGE電泳分析,綜合評價CP處理對金鯧魚肉MP結構特性的影響,以期為金鯧魚冰鮮產業提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金鯧魚,鮮活,體表無傷,體質量為(500±50) g,湛江市霞山水產品批發市場。

Tris-緩沖液(1 mol/L)、10×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、PM2610蛋白marker,北京酷來搏科技有限公司;溴酚藍(bromophenol blue,BPB,分析純),上海麥克林生化科技有限公司;溴化鉀(紅外光譜測定用),上海安譜實驗科技股份有限公司;A070-4 Ca2+-ATP酶測試劑盒,南京建成生物工程研究所;BC1575氨基酸含量檢測試劑盒、PC0030 Lowry蛋白濃度測定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;P0006 Bradford蛋白濃度測定試劑盒,上海碧云天生物技術公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CTP-2000S型等離子體處理裝置,南京蘇曼等離子科技有限公司;T25型高速均質機,德國IKA集團;Varioskan Flash型酶標儀,美國Thermo Fisher公司;3-30KS型高速冷凍離心機,德國Sigma Laborzentrifugen公司;TENSOR 27型傅里葉變換紅外光譜儀,德國Bruker公司;Cary 60型紫外分光光度計,美國Agilent公司;GelDoc EZ G型凝膠成像儀,美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

金鯧魚充氧運輸至實驗室后冰浴猝死,潔凈水洗凈,拭干,取背部肌肉,去骨、皮,切成4 cm×3 cm×1 cm塊狀(大約20 g)。將所有樣品隨機分為4組,一組為未處理組(0 kV),其余3組在頻率9 kHz、極板間距20 mm、處理時間45 s的條件下對魚肉進行不同CP電壓處理(10、20、30 kV)。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考LI等[11]的方法略有修改。向2 g攪碎的魚肉中加入20 mL 20 mmol/L Tris-緩沖液A(0.05 mol/L KCl,pH 7.0),冰水浴10 000 r/min均質30 s后,在4 ℃下10 000 r/min離心15 min,棄上清液,收集沉淀,重復2次。向得到的沉淀中加入20 mL 20 mmol/L Tris-緩沖液B(0.6 mol/L KCl,pH 7.0),相同條件均質后靜置1 h,在4 ℃下10 000 r/min離心15 min后過濾,得到的上清液即為MP,濃度用雙縮脲法測定。

1.3.3 Ca2+-ATP酶活性測定

Ca2+-ATP酶活性用測試劑盒測定,ATP酶分解ATP產生ADP和磷,通過測定磷的量來計算Ca2+-ATP酶活性,結果表示為μmol Pi/(mg prot·h)。

1.3.4 肌原纖維小片化指數測定

參考MOTTER等[12]的方法,采用Bradford法將調節MP溶液質量濃度為0.5 mg/mL,在540 nm處測定MP溶液的吸光度。計算如公式(1)所示：

MFI=A540×150

(1)

1.3.5 TCA溶解肽測定

參考SAENGSUK等[13]的方法略有修改。向2 g攪碎的魚肉中加入18 mL 5%的TCA溶液,冰水浴下12 000 r/min均質1 min,靜置1 h后在4 ℃下10 000 r/min離心10 min,測定上清液中酪氨酸(tyrosine,Tyr)的含量,結果表示為μmol Try/g肉。

1.3.6 總氨基酸含量測定

氨基酸含量用試劑盒方法進行測定,氨基酸的α-氨基與水合茚三酮反應產生在570 nm處有特征吸收峰的藍紫色化合物,通過測定其含量來計算氨基酸含量,結果表示為μmol/g肉。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜

參考藍蔚青等[14]的方法略有修改。將MP溶液冷凍干燥制成凍干粉末。將凍干粉與溴化鉀(1∶150,質量比)混合,混勻、研磨、壓片,進行傅里葉變換紅外光譜掃描。參數為：重復掃描64次,分辨率為4 cm-1,在400～4 000 cm-1進行掃描。

1.3.8 表面疏水性測定

參考WANG等[15]的方法略有修改。向2 g攪碎的魚肉中加入20 mL 20 mmol/L PBS緩沖液(pH 6.0),冰水浴下12 000 r/min均質1 min,靜置1 h,調整蛋白質量濃度至5 mg/mL。取1 mL稀釋后的溶液加入200 μL 1 mg/mL BPB,避光混勻10 min后 4 ℃下4 700 r/min離心15 min,取上清液,稀釋10倍,于595 nm處測定吸光度,記為A1。同時以PBS溶液代替蛋白溶液重復上述操作,記為A0,結果以BPB結合量表示,計算如公式(2)所示：

(2)

1.3.9 紫外吸收光譜

調節MP質量濃度為0.5 mg/mL,進行紫外光譜掃描。參數為掃描速度為600 nm/min,間隔為1 nm,在270～350 nm進行掃描。

1.3.10 SDS-PAGE電泳實驗

調節MP質量濃度為1 mg/mL,與上樣緩沖液(5×)以體積比4∶1混合,沸水浴6 min。冷卻后使用15%分離度的膠在非還原條件下進行SDS-PAGE分析,上樣量為15 μL,電壓120 V。結束后利用考馬斯亮藍 G-250進行染色2 h,再使用脫色液V(醋酸)∶V(乙醇)∶V(水)=2∶3∶5,脫色至條帶清晰并進行成像分析。

1.4 數據分析

試驗重復3次,試驗結果用平均值±標準差表示;用JMP16 pro軟件對數據進行單因素方差分析,并用Tukey SD多重評估差異顯著性,95%置信區間為P<0.05;采用Origin 2021b軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 CP對金鯧魚肉Ca2+-ATP酶活性的影響

圖1 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚Ca2+-ATP酶活性的影響

2.2 CP對金鯧魚肉MFI的影響

MFI反映肌原纖維及其骨架蛋白完整度,MFI值越大,則MP內部結構破壞越嚴重[18]。由圖2可知,當CP電壓≤ 20 kV時,MFI與未處理組無顯著差異,這可能是由于CP在較低電壓時產生的活性物質(活性氮和活性氧等)不足以使金鯧魚肌原纖維及其骨架嚴重破壞。但當電壓為30 kV時,MFI顯著升高(P<0.05),是未處理組的1.23倍,這可能是由于CP產生的活性物質(活性氮和活性氧等)以及帶電粒子導致肌節中z線破壞,肌原纖維間隙變大,破壞魚肉蛋白質的完整性,從而增大了MFI[19]。唐玲玲[20]研究了CP處理后凡納濱對蝦的MFI,發現其MFI也隨著電壓的升高的而增加,這與CP產生活性粒子對MP的轟擊有關。同時,MFI也是肉嫩度的一種標志[19],CP處理增加了MP降解的可能性,通過破壞MP緊密結構,提高肌肉嫩度,使肉制品具有更好的口感。

圖2 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚肌原纖維小片化指數(MFI)的影響

2.3 CP對金鯧魚肉TCA溶解肽的影響

TCA溶解肽作為魚類蛋白質降解的指標,包括小肽、游離氨基酸和其他非蛋白含氮物質(如嘧啶、吡啶和核酸等)[13]。CP處理對金鯧魚肉TCA溶解肽的影響如圖3所示。未處理組TCA溶解肽含量為0.80 μmol Tyr/g肉,隨處理電壓的上升,TCA溶解肽顯著升高(P<0.05),30 kV組比未處理組升高0.37 μmol Tyr/g肉,說明CP處理促使蛋白質發生降解和變性。這與OLATUNDE等[21]的研究相一致,CP處理后鱸魚片TCA溶解肽含量因蛋白質氧化發生降解而上升,經過不同處理氣體的CP(A：90% Ar2和10% O2;B：60% CO2,30% Ar2,10% O2)處理后TCA溶解肽升高0.5～0.7 μmol Tyr/g肉(P<0.05)。這可能是由于CP產生的活性物質(活性氮和活性氧等)以及帶電粒子使MP發生氧化和降解,從而導致小肽、游離氨基酸和其他非蛋白含氮物質含量增加[22]。

圖3 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚TCA溶解肽的影響

2.4 CP對金鯧魚肉總氨基酸含量的影響

氨基酸含量的變化一定程度上可以反映蛋白質的變性和降解情況[20]。由圖4可知,CP處理促使總氨基酸含量增加。但是當電壓低于20 kV時,總氨基酸含量與未處理組差異不顯著,而電壓達到30 kV時,總氨基酸含量顯著增加(P<0.05)。這與LIN等[23]研究相似,他們發現生腌泥螺的總氨基酸含量經CP處理后增加,這可能是由于CP產生的活性粒子與蛋白質或者多肽等作用,使其發生變性。雖然總氨基酸含量增多,證明蛋白質發生一定程度的降解,但是作為食品中的營養元素,氨基酸種類和數量能夠影響食品的風味。LIN等[23]發現了CP處理后泥螺的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等含量顯著增加,其中谷氨酸、天冬氨酸作為重要的鮮味來源,有助于泥螺產生特殊風味。綜上,CP處理雖然會引起蛋白質氧化,但也有改善金鯧魚風味的潛在可能性。結合圖2和圖3,CP處理一定程度上增加了小肽以及游離氨基酸等具有功能特性的物質的含量。雖然,這些較低分子質量的物質不利于貯藏,但是將處理電壓控制在合理范圍內(≤20 kV),既有改善品質的可能性,又能防止過度氧化帶來的品質劣化。

圖4 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚氨基酸總量的影響

2.5 CP對金鯧魚肉蛋白質二級結構的影響

圖5 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚紅外吸收光譜的影響

2.6 CP對金鯧魚肉表面疏水性的影響

表面疏水性反映了蛋白質的變性程度,蛋白質變性后結構中的疏水性殘基暴露,導致表面疏水性升高[15]。如圖6所示,隨著CP處理電壓的升高,樣品的表面疏水性先顯著增加(電壓≤10 kV)(P<0.05),隨后趨于平緩,這可能是因為低電壓CP處理導致金鯧魚MP中的疏水性殘基基本完全暴露。EKEZIE等[25]同樣發現凡納濱對蝦經CP處理30 min后表面疏水性顯著升高,這可能是由于CP處理后蛋白質氧化,MP結構展開,苯丙氨酸以及色氨酸等疏水性基團暴露。然而,劉昊天等[10]認為蛋白質的適度氧化,會使其發生去折疊現象,疏水基團的暴露增加了風味物質吸附在蛋白質表面的可能性,有利于揮發性風味的保持。

圖6 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚表面疏水性的影響

2.7 CP對金鯧魚肉紫外吸收光譜的影響

紫外光譜反映了蛋白質發色基團對紫外光的吸收作用,可以表征蛋白質三級結構的穩定性。如圖7所示,CP處理后金鯧魚MP的吸收強度高于未處理組,且隨著電壓的升高,吸光度越高且略有右移。這可能是由于蛋白質結構隨著CP處理電壓的升高進一步展開,更多酪氨酸和色氨酸殘基等芳香族氨基酸暴露,紫外吸收強度上升[25],這與表面疏水性結果一致,都表明蛋白質經過CP處理后發生一定程度的舒展。QIAN等[24]用CP活化水處理雞肉MP凝膠后發現CP活化水能夠促進疏水基團的暴露,紫外吸收強度上升。同時也有研究表明280 nm處的吸收強度上升可能與氨基酸殘基修飾有關,CP產生的活性物質(活性氧和活性氮等)可能可以誘導酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸發生羥基化以及誘導色氨酸和苯丙氨酸硝化[26]。

圖7 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚紫外光譜的影響

2.8 CP對金鯧魚肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響

SDS-PAGE可以表征CP處理后金鯧魚肉蛋白質結構變化[25]。如圖8所示,MP主要集中在10～245 kDa,包括肌球蛋白重鏈(220 kDa)、肌動蛋白(43 kDa)、原肌球蛋白(35 kDa)等,其中肌球蛋白重鏈是主要的蛋白質。經CP處理后蛋白質條帶數量以及強度未產生明顯變化,這說明CP對肽鍵的影響不顯著。實驗結果與KODDY等[27]對帶魚肌肉進行50 kV CP處理(<60 s)時相似,他們發現經過帶魚經過CP處理后,蛋白質條帶變化輕微。此外EKEZIE等[25]也發現凡納濱對蝦MP經CP射流處理后,電泳條帶沒有發生明顯變化,這可能是CP處理不會改變MP分子量或使MP發生降解。但KODDY等[27]也發現當長時間CP處理時,蛋白質會發生共價鍵交聯以及發生氧化而聚集,從而增強肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶強度。綜合紅外光譜(圖5)結果,說明CP短時間處理,不足以引起MP一、二級結構的顯著變化。

圖8 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚SDS-PAGE電泳的影響

3 結論

隨著CP處理電壓的增加,金鯧魚肉MFI、TCA溶解肽和總氨基酸含量升高,Ca2+-ATP酶活力下降。此外,色氨酸等疏水性基團暴露,表面疏水性和紫外吸收強度增加,這表明蛋白質發生的一定程度舒展。但是金鯧魚MP的紅外光譜和SDS-PAGE說明CP處理后蛋白質一級結構和二級結構未發生明顯變化。綜上所述,說明CP處理能夠促進蛋白質變性,使蛋白質三級結構發生改變,且隨著處理電壓升高,蛋白質變性越來越嚴重。因此,在利用CP對水產品進行殺菌時,應控制處理條件,避免過高電壓導致的水產品蛋白質的變性,減小其對魚肉品質不利影響。同時,未來仍需深入了解CP作用機制,選擇更加合理的處理條件,以最大程度減少對食品的不良影響;還應該對CP進行安全性評估,使其更加安全可靠地運用于食物保存。