產氣糟辣椒的微生物與揮發性風味物質研究及相關性分析

付為藝,蘇偉,2,3*,母應春,陳添艷,尹學東

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550025) 2(貴州大學貴州省農畜產品儲藏加工技術重點實驗室,貴州 貴陽,550025) 3(貴州大學辣椒產業技術研究院,貴州 貴陽,550025)4(貴三紅食品有限公司,貴州 遵義,563099)

糟辣椒是一種備受消費者喜愛的傳統發酵制品,其以新鮮辣椒為原料,生姜、大蒜為輔料,剁碎后添加食用鹽和其他調味料拌勻,裝罐密封發酵,形成特有的香、辣、鮮、酸、咸等風味。隨著人們對食品安全的重視,糟辣椒的研究不僅體現在加工方式的優化上[1-2],其有害成分[3]、微生物污染[4]、生花[5-6]、產氣[7-8]等情況也受到業界的廣泛關注。市面上大多數糟辣椒產品為延長其貯存時間并穩定風味,通常添加適當的鹽和防腐劑抑制有害微生物的生長[9-10]。但夏季溫度下,糟辣椒品質不穩定,易出現產氣脹罐等現象,使風味發生改變。因此,探究30 ℃貯存條件下糟辣椒的產氣和風味變化的原因十分必要。

高通量測序(high-throughput sequencing,HTS)作為新一代分子生物學技術,區別于傳統培養分離方法,可以快速全面地反映樣品微生物群落的組成情況[11],已廣泛用于多種發酵食品的微生物多樣性、群落結構變化以及功能微生物的研究。母應春等[12]通過高通量技術對貴州3種酒曲的優勢細菌和真菌進行分析,揭示了酒曲中微生物組成種類的復雜程度;NIU等[13]也通過此技術對紅辣椒醬中細菌群落進行動態分析,發現乳酸菌是腌制辣椒的核心細菌。頂空固相微萃取氣相色譜-質譜聯用(headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME/GC-MS)也廣泛應用于揮發性風味物質的定性和定量分析,例如四川泡菜[14]和銅仁糟辣椒[15]。目前,將高通量技術和GC-MS進行結合,探究特色發酵食品中微生物群落結構與揮發性風味之間的關系是代謝組學的常見方法。母雨等[16]從盤縣腐敗火腿中發現腸桿菌科微生物是造成腐敗的菌群,也是火腿揮發性風味的主要貢獻者;XIAO等[17]發現,在傳統發酵蔬菜中,乳酸桿菌占很大比例,與20多種風味化合物密切相關。

本研究對正常、微產氣、產氣脹罐的3種樣品進行研究,并將微產氣樣品置于30 ℃貯存,加速發酵產氣,跟蹤指標變化;采用高通量測序技術,揭示糟辣椒中微生物群落結構及其多樣性變化,并利用HS-SPME/GC-MS對其揮發性風味物質進行檢測,通過主成分分析和正交偏最小二乘判別篩選出重要風味物質。最后,通過相關性分析挖掘特征產氣微生物,探究微生物與揮發性風味物質之間的潛在相關性,以期為解決夏季糟辣椒產氣問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糟辣椒由貴州省貴三紅食品有限公司提供,辣椒品種為遵義線椒。生產工藝流程如下：

新鮮辣椒→清洗→剁碎→添加鹽、輔料拌勻→發酵→水洗脫鹽(無菌水)→配料裝罐→檢測→成品

對正常、微產氣和產氣脹罐樣品進行取樣,分別標記為ZC、LW、CQ,并將微脹氣樣品置于30 ℃培養箱發酵加速產氣過程,跟蹤其指標變化至其破罐,分別在5、12、18 d樣品進行取樣,標記為L5、L12、L18。上述樣品均設置3個生物學重復,在無菌條件下進行取樣,并立即置于-80 ℃冰箱貯存待分析。

氫氧化鈉,重慶川東化工有限公司;酚酞,成都金山化學試劑有限公司;E.Z.N.A.?soil試劑盒,美國Omega Bio-Tek;2%瓊脂糖凝膠,西班牙Biowest;FastPfuDNA聚合酶,中國TransGen;AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒,美國Axygen Biosciences;99.5%色譜級環己酮,中國上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

FA1004 N電子分析天平,上海精密科學儀器有限公司;FieldScout SoilStik pH計,美國Spectrum公司;ABI GeneAmp?9700 PCR儀,美國ABI公司;NanoDrop2000超微量分光光度計、Trace1300-TSQ8000 HS-SPEM/GC-MS,美國Thermo Fisher Scientific公司;QuantiFluorTM-ST微型熒光劑,美國Promega公司;Illumina Miseq測序儀,美國Illumina公司;DYY-6C電泳儀,中國北京市六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 產氣及理化性質

產氣高度測定：瓶口到封口膜頂點的高度;pH測定：參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》處理樣品,利用便攜式pH計測定;總酸測定：參考GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法。

1.3.2 DNA提取和PCR擴增

根據E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書提取糟辣椒樣品的總DNA,利用NanoDrop2000檢測DNA濃度和純度,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。細菌使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對16SrRNA基因的V3-V4可變區進行PCR擴增;真菌用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)引物對ITS1-ITS2區進行擴增。擴增程序為：95 ℃預變性3 min,細菌27個循環,真菌35個循環(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL,4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。

1.3.3 高通量測序和生物信息學處理

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit對回收產物進行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測后,利用QuantusTM熒光儀對回收產物進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫。利用Illumina公司Miseq PE300平臺進行測序。數據處理使用QIIME2 dada2插件對序列進行質量控制、修剪、去噪、拼接、去嵌合體后,形成最終特征序列表格[18]。基于序列數據進行豐度、多樣性指數等分析,并對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。

1.3.4 GC-MS測定揮發性風味物質

參照陳添艷等[19]方法。稱取2.5 g樣品置于20 mL頂空瓶,加入7.5 mL飽和食鹽水和20 μL環己酮(20 μg/mL,以色譜級無水乙醇作為溶劑),用PTFE硅膠隔膜密封。樣品在60 ℃下孵育10 min,將50/30 μm(DVB/CAR/PDMS)涂層纖維導入SPME裝置,插入頂空瓶并在60 ℃振搖提取40 min以吸附揮發性風味物質。色譜條件：毛細管柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),氦氣(99.999%)為載氣,流速為1 mL/min,無分流模式。升溫程序：初始溫度40 ℃保持5 min,以5 ℃/min升至150 ℃,保持3 min,然后以5 ℃/min上升至240 ℃,保持5 min。質譜條件：電子轟擊離子源,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,傳輸線溫度240 ℃,在50～450 amu進行數據采集。

1.3.5 揮發性風味物質的數據處理

定性分析：將實驗結果與NIST數據庫對比,保留匹配度大于700的化合物。

定量分析：采用內標法對揮發性風味化合物進行定量,計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ci為任一組分的質量分數,μg/kg;Cis為內標的質量分數,μg/kg;Ai為任一組分的色譜峰面積;Ais為內標的色譜峰面積;20為內標物體積,μL;2.5為待測樣品質量,g。

1.4 數據處理與分析

所有數據至少測量3次,結果用平均值±標準差表示;Excel 2020用于統計試驗數據;IBMSPSS Statistics 26進行單因素方差分析(ANOVA),確定差異顯著性(P<0.05);通過SIMCA 160軟件進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)模型分析;繪圖使用Origin 2020bC;R軟件進行相關性分析,并用Cytoscape軟件可視化。

2 結果與分析

2.1 糟辣椒的產氣、pH和總酸變化

對糟辣椒樣品進行產氣、pH和總酸的測定,結果如表1所示。微產氣樣品置于30 ℃培養箱加速發酵產氣,其產氣狀況用產氣高度進行表征,各階段均差異顯著(P<0.05)。pH和總酸是確定發酵產品質量的重要指標。ZC和CQ樣品的pH和總酸存在顯著差異(P<0.05),CQ總酸可達(12.42±0.2) g/kg,約為ZC和LW的3倍。ZC與LW的pH并無顯著差異(P>0.05),總酸略有升高。隨貯存時間延長,LW的pH和總酸呈現先慢后快的變化的趨勢,總酸持續上升至(5.29±0.12) g/kg,但與CQ相比還是有顯著差異(P<0.05)。大多數發酵食品在貯存期間都會發生pH降低和總酸升高的現象,如剁椒山筍和剁椒姜絲[19-20],最終都會趨于平緩,但30 ℃下,糟辣椒樣品的pH和總酸持續變化,沒有平緩的趨勢,可能導致產品變質。

表1糟辣椒的產氣、pH和總酸變化Table 1 Changes in gas production, pH and total acidity of fermented peppers

2.2 糟辣椒中微生物的α多樣性分析

糟辣椒微生物的α多樣性指數如表2所示。Chao1指數反映物種豐富度,指數隨著菌群豐富度的升高而增加,Simpson和Shannon指數評估樣本的物種多樣性,指數越高,表明多樣性越復雜[21]。樣品產氣過程中,細菌的Chao1指數表明其豐富度隨時間呈現降低趨勢,真菌變化則相對平緩。此外,Simpson指數和Shannon指數表明細菌群落多樣性也呈現下降趨勢,真菌群落多樣性僅有較小波動,說明糟辣椒貯存過程中細菌的多樣性變化較真菌更為顯著,這與YANG等[22]對6種不同的蘿卜泡菜中微生物多樣性研究結果一致。綜上所述,微生物豐富度和多樣性隨時間不斷降低,且所有階段細菌豐富度都高于真菌。稀釋曲線和香農曲線(附圖1,https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034865)趨于平緩代表當前測序數據量足夠大,可信度高,可進行后續分析。

a-細菌門水平;b-真菌門水平;c-細菌屬水平;d-真菌屬水平圖1 糟辣椒中細菌門水平、真菌門水平、細菌屬水平、真菌屬水平的相對豐度

表2 糟辣椒中微生物α多樣性分析Table 2 Analysis of alpha diversity of microorganisms in fermented peppers

2.3 糟辣椒中微生物群落組成變化

圖1顯示了樣品的細菌和真菌群落組成情況,展示相對豐度大于0.01的優勢門和屬,其余歸為others。由圖1-a可知,細菌門水平共鑒定出5個細菌門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和綠菌門(Chloroflexi)。CHEN等[23]研究表明,厚壁菌門和變形菌門在不同鹽度的剁辣椒中均為優勢菌。在ZC和LW中變形菌門為優勢菌群,分別占總數的77%和79%,而在CQ中優勢菌門為厚壁菌門,占總數的96%。微產氣樣品在30 ℃條件下貯存,產氣過程中厚壁菌門逐漸占據優勢,L12、L18中占總數的98%和99%。糟辣椒產氣過程中優勢菌門由變形菌門轉變為厚壁菌門。由圖1-c可知,共檢出12個細菌屬,ZC、LW中Unspecified_Enterobacteriaceae和Unspecified_Xanthomonadaceae分別占總數的27%和29%,Unspecified_Xanthomonadaceae和歐文氏菌屬(Erwinia)的比例都大于或等于總數的10%,而在CQ中優勢菌屬為乳酸桿菌,占總數的95%。L5中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)逐漸占據優勢(53%),在L12、L18中分別為98%、99%。糟辣椒等發酵蔬菜體系中,發酵前期以異型發酵菌株如腸膜明串珠菌、短乳桿菌占主導地位,啟動發酵;發酵中后期植物乳桿菌等同型發酵菌株占據優勢,完成發酵[24]。在其他泡蘿卜、泡菜等[25-26]發酵食品中均發現乳酸桿菌屬為優勢菌株,在剁辣椒中其相對豐度可達45.52%[23]。RHEE等[27]提出韓國泡菜發酵過程中乳酸菌會迅速繁殖并發展成優勢菌群,抑制其他微生物的生長。乳酸桿菌屬微生物相對豐度過高,在貯存過程中過度產酸,產氣,使產品發生酸化和脹罐的情況。例如：乳酸桿菌屬的短乳桿菌耐酸能力強,是異型乳酸桿菌,能利用葡萄糖產酸、產氣。顧雙等[28]對泡菜中的乳酸菌及其產氣特性進行研究,發現短乳桿菌具有產氣特性。王向陽等[29]對胖袋的真空包裝蘿卜干中微生物進行分離鑒定,發現短乳桿菌是引起胖袋的原因之一。

由圖1-b所示子囊菌門(Ascomycota)是真菌門水平中的優勢菌門,在每個樣品中都約占總數的99%,Unspecified_Fungi和擔子菌門(Basidiomycota)均主要在CQ中出現。圖1-d顯示真菌屬水平共檢出5種真菌屬,其中優勢菌株為刺盤孢屬(Colletotrichum),在ZC-L18中均占總數的91%～98%,CQ中鏈格孢霉屬(Alternaria)也有明顯升高,占總數的15%。刺盤孢屬是十大植物病原真菌類群之一,會引起農林作物的炭疽病及水果采后腐爛,造成嚴重的經濟損失。辣椒炭疽病是辣椒栽培中一種常見的真菌性病害,主要危害果實和葉片,也可侵染莖部[30]。鏈格孢霉屬也是一類可能引起植物發生病變的病原菌,所以,樣品中的這類真菌可能是由辣椒原料污染所致。

2.4 糟辣椒揮發性風味化合物變化情況

通過GC-MS對糟辣椒揮發性風味物質及含量進行檢測,共檢測出39種揮發性風味物質(附表1,https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034865),醇類8種、烷烴類8種、酚類5種、醛類4種、酸類6種、酯類5種、其他類3種。圖2分別是揮發性風味物質相對含量、數量、PCA、OPLS-DA和投影變量重要性因子(variable importance factor,VIP)>1的物質聚類分析。由圖2-a可知,揮發性風味物質中酸類物質含量為85%以上,L12和L18中可達90%,酸類物質隨時間延長逐漸增多,醇類和酚類的相對含量存在減少的趨勢。由圖2-b可知,ZC中的揮發性風味物質為25種,樣品產氣過程中風味物質逐漸增多,CQ中增加到29種。主成分結果如圖2-c所示,第一主成分(PC1)為48.2%,第二主成分(PC2)為14.7%,總貢獻度為62.9%,產氣過程中糟辣椒風味差異顯著。為了更準確地體現各樣品間的差異,采用有監督的OPLS-DA建立代謝物表達量與樣本類別之間的關系模型,來實現對樣本類別預測分析。如圖2-d模型的自變量擬合指數(R2X)為0.927,因變量擬合指數(R2Y)為0.955,模型預測指數(Q2)為0.61,R2和Q2超過0.5表示模型擬合結果可接受[31]。通過VIP發現共有14種重要風味物質(VIP>1)可能反映出產氣糟辣椒的風味變化情況,其聚類分析如圖2-e所示。

a-揮發性風味物質相對含量;b-數量;c-主成分分析;d-正交偏最小二乘判別分析;e-VIP>1的風味物質聚類分析圖2 糟辣椒揮發性風味物質相對含量、數量、主成分分析、正交偏最小二乘判別分析和VIP>1的風味物質聚類分析

由于糟辣椒為開放式自然發酵,不同批次樣品的風味不穩定,揮發性風味物質組成存在差異,但物質變化趨勢相同,可分為四類。正辛酸、正十六烷、羥基十一烷酸內酯聚為一類,在CQ中含量較高;2,4-二叔丁基苯酚、正十二烷、油酸甲酯、辛酸乙酯聚為一類,含量隨產氣逐漸降低;1-甲基萘和視黃醛在產氣前期含量較高,山梨酸、二氫丁香酚、1-十五醇、正己醇主要集中產氣后期。

酸類物質中山梨酸的含量最高,作為一種國際上廣泛使用的防腐劑,山梨酸具有較高抗菌性能,能有效抑制霉菌、酵母菌和好氧性細菌的活性,但對厭氧芽孢菌與嗜酸乳桿菌等有益微生物幾乎無效[32]。乙酸、反式-2-甲基-2-戊烯酸和正辛酸在貯存過程中含量顯著上升(P<0.05),其中乙酸和反式-2-甲基-2-戊烯酸僅在產氣的中后期(L12、L18)和CQ中檢測到,ZC及產氣初期(LW、L5)并未檢測到,乙酸等物質的增多會給糟辣椒帶來刺激性酸味[33]。除酸類物質,LW及其產氣過程中存在的1-甲基萘是一種閾值極低的多環芳烴類化合物,具有“刺鼻、酸味”的氣味特征[34]。

醇類和酯類是構成糟辣椒風味的主要物質[15]。本次樣品中共檢測出8種醇類,其中含量最高的物質是芳樟醇,具有鈴蘭等花香味[35],XU等[36]發現,芳樟醇是發酵辣椒中關鍵香味物質之一。ZC中芳樟醇含量為(44.06±1.65) μg/kg而在CQ中含量減少至(36.9±12.16) μg/kg,LW的產氣過程也證實芳樟醇含量具有減少的趨勢。此外,具有清甜玫瑰花香的苯乙醇含量在LW、L12、L8中逐漸減少,豐富糟辣椒滋味的乙醇含量在此過程中先升高,后減少。酯類化合物大多數都具有水果香味,氣味閾值較低。樣品中多數酯類物質含量呈現下降趨勢,如油酸甲酯、辛酸乙酯和2-甲基丁酸丁酯。2-甲基丁酸丁酯是泡椒中散發花香、果香的酯類之一[37],其含量在ZC中為(5.83±3.32) μg/kg,CQ中為(1.96±0.9) μg/kg,具有菠蘿的水果香氣的辛酸乙酯[38]在ZC中含量為(1.06±0.21) μg/kg,CQ未檢出,2種風味物質含量在LW產氣過程中逐漸減少。

糟辣椒中烴類主要有烯烴和飽和烷烴兩類,其中飽和烷烴大多數由于脂肪酸烷氧自由基的斷裂形成,閾值較高,對整體風味貢獻不大,而烯烴類物質閾值較低,會影響整體風味[39]。異松油烯呈現木香味和微微的柑橘甜味,α-萜品烯具有柑橘和檸檬似香氣,2-蒈烯有植物香味。酚類物質閾值較低,對糟辣椒風味有較大貢獻,RAO等[25]發現2,4-二叔丁基苯酚是四川泡菜中的主要化合物之一,比較各階段發現,其含量隨產氣逐漸降低,ZC中含量為(56.29±12) μg/kg,CQ中含量為(22.6±5.2) μg/kg。醛類的主要來源是脂肪酸氧化和氨基酸降解,閾值較低,能帶來清香或果香味。ZHONG等[40]發現視黃醛是由蔬菜中的β-胡蘿卜素在微生物作用下水解產生的揮發性風味物質。CQ中出現的壬醛具有柑橘香味,2-乙基丁烯醛具有可可香氣,在榨菜和萵筍等其他發酵蔬菜制品[14]中發現醛類物質主要來源于原料本身。

2.5 微生物屬間及其與重要揮發性風味化合物的相關性分析

探究產氣糟辣椒中微生物群落相關性及其與揮發性風味物質之間的潛在相關性可以為兩者提供調控指南,改善產品品質。基于Pearson相關性分析對微生物屬間和微生物屬與VIP>1的14種重要揮發性風味物質進行相關性分析,并使用Cytoscape可視化。由圖3-a可知,16個微生物屬間共有6個相關性(|r|>0.8,P<0.05),乳酸桿菌屬(Lactobacillus)作為優勢細菌屬與其他細菌存在負相關關系,刺盤孢屬(Colletotrichum)也與其他真菌微生物屬為負相關關系,細菌屬與真菌屬間并無相關性。

a-微生物屬間的相關性分析;b-微生物屬和重要揮發性風味物質的相關性分析圖3 微生物屬間的相關性分析、微生物屬和重要揮發性風味物質的相關性分析

微生物屬與重要揮發性風味物質之間共51個相關性(|r|>0.8,P<0.05)。如圖3-b所示,在微生物與揮發性風味物質之間共有43個正相關(紅色實線)和8個負相關(綠色虛線)。12種細菌屬和4種真菌屬對7種揮發性風味物質的影響較大。YE等[41]在腌制辣椒中也發現,與真菌群落相比,細菌群落與風味的相關性更強。51個相關性關系中,23個都是酯類物質和細菌之間產生的,如明串珠菌屬(Leuconostoc)與油酸甲酯和辛酸乙酯存在強正相關性(|r|>0.95),優勢細菌屬乳酸桿菌屬(Lactobacillus)與這2種酯類存在負相關,這表明糟辣椒中細菌群落的變化對酯類物質的影響最大。此外,乳酸桿菌屬與揮發性風味物質的5種相關性都屬于負相關,這表示在貯藏過程中乳酸桿菌屬的生長使大多數風味物質都有減少的趨勢。MONTANARI等[42]研究發現,乳酸桿菌通過分解碳水化合物產生乳酸,從而影響碳水化合物向酯類或其他途徑的轉化。其余3種負相關都發生在正己醇與真菌微生物之間,表明醇類的減少可能是多種真菌共同作用的結果。

3 結論

綜上所述,糟辣椒產氣過程中總酸顯著上升,pH呈下降趨勢。優勢細菌門由變形菌門轉變為厚壁菌門,優勢細菌屬為乳酸桿菌屬;優勢真菌門為子囊菌門,優勢真菌屬為刺盤孢屬。貯存過程中乳酸桿菌屬微生物迅速繁殖并發展成優勢菌群,相對豐度過高,并快速產酸,產氣,使產品發生酸化和脹罐的情況。通過HS-SPME/GC-MS檢測到39種揮發性風味物質,包括醇類8種、烷烴類8種、酚類5種、醛類4種、酸類6種、酯類5種、其他類3種。貯存前后化合物由25種增加到29種,酸類物質種類增加,酯類物質和醇類物質種類減少,使糟辣椒產生刺鼻的酸味,花香、果香味減弱,對風味的影響較大。Pearson相關性分析發現乳酸桿菌屬與其他細菌屬為負相關關系,刺盤孢屬也與其他真菌微生物屬存在負相關關系。微生物屬與14種重要揮發性風味物質的相關性中,細菌演替對酯類物質的影響最大,真菌的演替對醇類物質的影響較大;乳酸桿菌屬與5種風味物質都呈現負相關關系。此研究為糟辣椒夏季產氣脹罐的微生物變化和風味改變提供參考,并可結合產氣糟辣椒有害微生物、生物胺等食品安全指標,為后續糟辣椒質量安全控制提供依據。