多級雙水相萃取木瓜蛋白酶的研究

朱恒偉,白新鵬,*,梁秋楊,鐘瀧彬,常會敏,陳運坤,喬振栓

1(海南大學 食品科學與工程學院,海南 海口,570203) 2(熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心,海南 海口,570203) 3(海口植之素生物資源研究所有限公司,海南 海口,570100)

木瓜蛋白酶是一種分子質量23.4 kDa,含有212個殘基的半胱氨酸內肽酶,在pH 5～8有著較高的酶活性,最佳溫度為65 ℃,等電點值為8.75[1]。

木瓜蛋白酶普遍應用于食品、飼料等行業,如肉類嫩化[2]、乳品加工[3]、烘焙[1]、飼料[4]、牙齒美白[5]、治療燒傷和去除齲齒[6]等。

制作木瓜蛋白酶的傳統方法有鹽析法、有機溶劑法、超濾法、親和層析法等。鹽析法簡單方便,但是最高只有39%的純度以及無法去除其他雜蛋白使得這種方法無法應用于大規模及高純度木瓜蛋白酶的制作[7];有機溶劑法能獲得純度較高的木瓜蛋白酶,但酶活性回收率較低[8];超濾法由于濃差極化現象,會影響木瓜蛋白酶的萃取效果,并且無法分離分子質量與木瓜蛋白酶分子質量相近的酶[9];親和層析法要求前處理液必須經過一定步驟的純化,且操作復雜,產量較低,不適合大規模生產,優點是純度較高[10]。

雙水相萃取(aqueous two-phase extraction, ATPE)在下游加工中表現出巨大的技術和經濟優勢,具有巨大的應用潛力。涉及分離、濃縮和純化的幾個階段可以減少并被ATPE取代,從而使整個回收過程更加節能、成本更低[11]。與傳統方法相比,使用ATPE進行分離萃取具有許多優點,包括工藝簡單、分離迅速、選擇性高、能耗低、成本低等[12],然而很少有研究以中試規模開發連續。多級ATPE使用最多的2種設備是混合沉淀柱和萃取柱,離心分離色譜法和逆流色譜法也被應用于連續或半連續的ATPE[13]。

本課題組通過前期實驗,發現聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000,PEG6000)和檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)組成的雙水相體系相比于其他PEG-鹽體系在萃取木瓜蛋白酶方面有著更好的表現。本研究通過研究多級PEG6000-Na3C6H5O7雙水相體系萃取木瓜蛋白酶獲得理論萃取級數并設計出優化的萃取方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸鈉(Na3C6H5O7),上海麥克林生化科技有限公司;PEG6000,天津光復精細化研究所;木瓜蛋白酶,海口炫錚科技有限公司;L-酪氨酸,上海源葉生物科技有限公司;三氯乙酸、考馬斯亮藍G-250,西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

GL-88B旋轉混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Varioskan LUX多功能酶標儀,Thermo Fisher;752 N紫外分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;HH-4恒溫水浴鍋,常州凱航儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 木瓜蛋白酶活性測定

參考張興燦等[14]方法測定木瓜蛋白酶活性。

1.3.2 萃取級數對木瓜蛋白酶酶活性回收率的影響

參考BABALOLA等[15]方法將雙水相相比固定在0.5,分別進行1～7級錯流雙水相萃取,并與同萃取級數的逆流萃取相對比。每一級雙水相體系混合均勻并靜置完全分相后,測定每一級上相中的木瓜蛋白酶的酶活性回收率。

1.3.3 木瓜蛋白酶萃取平衡等溫線的繪制

參考RZIKI等[16]方法繪制萃取平衡等溫線。

1.3.4 多級逆流雙水相理論級數的計算

參考LIU等[17]方法和ROSA等[18]方法進行多級逆流雙水相理論級數的計算。

1.3.5 PEG6000-Na3C6H5O7多級雙水相萃取木瓜蛋白酶

參考劉毅[19]方法分別使用多級錯流和多級逆流雙水相方法萃取木瓜蛋白酶。

相比Vr計算如公式(1)所示：

(1)

分配系數K計算如公式(2)所示：

(2)

酶活性回收率Ye如公式(3)所示：

(3)

式中：Ct和Cb分別代表目標物質木瓜蛋白酶在雙水相體系在上、下相中的不同質量濃度,mg/mL;Vt和Vb分別代表上相和下相的體積,mL;Et為上相酶活性濃度,U/mL;Me為加入系統酶的總活性,U。

2 結果與分析

2.1 相比對木瓜蛋白酶分配行為的影響

如圖1所示,隨著雙水相兩相的體積比Vr從0.25增加到1.6,木瓜蛋白酶的酶活性回收率從71.52%增大至87.21%,分配系數從1.21增加至3.17,說明增加相比能顯著提高萃取效率。當相比從1.6增加至2.0,分配系數和酶活性回收率均有所下降,這是因為PEG6000的質量分數增加,導致上相濃度增加,空間阻力增加,木瓜蛋白酶的選擇性分配效果減弱[20]。

圖1 相比對木瓜蛋白酶分配行為的影響

2.2 萃取級數對木瓜蛋白酶酶活性回收率的影響

在多級雙水相萃取中,如果在第一級沒有富集到很高的回收率是不重要的,因為可以通過增加萃取級數來進行補償,且相比較高時,會使更多的污染物從下相分配到上相,導致目標物的純度降低[18],因此,選擇0.5的相比進行多級雙水相的研究。由圖2可以看出,在同相比的條件下,隨著萃取級數的增加,多級錯流和逆流雙水相都能夠較為顯著地提升木瓜蛋白酶的酶活性回收率。對于多級錯流雙水相,經過5級錯流萃取后,木瓜蛋白酶的酶活性回收率達到了96.63%,6～7級的錯流萃取略有下降。由圖2可知,在3級雙水相錯流萃取后,酶活性回收率的增長幅度明顯降低,僅增加了1.53%,這說明大部分的木瓜蛋白酶已在前3級完成萃取;多級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的趨勢與錯流相似,在第5級時達到最大酶活性回收率為97.92%,略高于同級數的錯流萃取,且大部分的木瓜蛋白酶已在前3級被萃取出來。

圖2 相同相比條件下的多級錯流萃取和多級逆流萃取

以上結果說明,在相比為0.5的條件下,通過多級錯流或逆流萃取提高木瓜蛋白酶萃取率的方法是切實可行的,經過5級錯流雙水相萃取,木瓜蛋白酶的酶活性回收率增加了15.57%,經過5級逆流雙水相萃取,酶活性回收率增加了18.19%。

2.3 多級錯流雙水相對比多級逆流雙水相

如圖3所示,比較了0.3、0.5、0.7相比下五級錯流雙水相萃取木瓜蛋白酶的差異,并與0.5相比下的5級逆流雙水相萃取進行比較,可以發現相比增加和萃取級數增加都能使最終的酶活性回收率得到明顯提高。經過五級錯流萃取后,分別能達到90.41%、96.32%、95.38%的酶活性回收率,在相比0.5的條件下,5級逆流萃取后,酶活性回收率也達到了97.92%。

圖3 相同相比條件下的多級錯流(Cro)萃取和多級逆流(Coun)萃取

圖4 木瓜蛋白酶的萃取平衡等溫線

由于多級錯流萃取和多級逆流萃取原理上的差異,為了提高酶活性回收率,多級錯流萃取每一級都要加入新的PEG萃取相。因此要想獲得同樣的酶活性回收率,多級錯流萃取需要的PEG萃取劑的量要多于多級逆流萃取[19]。由圖2和圖3可知,相同相比和萃取級數條件下,多級逆流萃取的酶活性回收率要高于多級錯流萃取,因此選擇多級逆流萃取進行多級雙水相萃取木瓜蛋白酶的研究。

2.4 萃取平衡等溫線的繪制

萃取平衡等溫線(extraction equilibrium isotherm)是雙水相萃取過程中的一個關鍵的萃取因素,能夠很好地反映出目標物在平衡兩相之間的分配關系[21],并且可以用于模擬多級萃取的級數及相關規律,最具代表性的就是McCabe Thiele圖解法[22]。表1是不同相比條件下,上相中木瓜蛋白酶的濃度(Ct)和下相中木瓜蛋白酶的濃度(Cb)。因為在雙水相萃取過程中,上相PEG的質量以及下相檸檬酸鈉的質量均為常量,所以可以下相中木瓜蛋白酶濃度Cb為橫坐標,上相中木瓜蛋白酶的濃度Ct為縱坐標繪制曲線,即為萃取平衡等溫線。得到的擬合曲線方程為Y=0.689 58-0.696 85×exp(-X/0.051 01),其中R2=0.994 2,AdjR2=0.991 9。

表1 不同相比下木瓜蛋白酶雙水相在上下相的質量濃度Table 1 Concentration of papain in top and bottom phase at different volume ratio

2.5 多級逆流雙水相的模擬計算

在這個過程中假設各級加入的PEG用量相同,與下相互溶度很小,且雙水相完全分相后只有上相及下相2個部分,萃取過程中沒有發生熱效應。參考ROSA等[18]方法,對目標物進行物料衡算可得：

VBP×[Solute]BP inlet+VTP×[Solute]TP inlet=VBP×[Solute]BP outlet+VTP×[Solute]TP outlet

(4)

進而可得操作線方程為：

(5)

式中：[Solute]BP inlet和[Solute]BP outlet表示系統中各級雙水相上相和下相的木瓜蛋白酶的質量濃度,mg/mL;VBP表示下相的體積,mL;VTP表示上相的體積,mL。

圖5 多級逆流萃取在X-Y坐標上圖解理論級數

使用McCabe Thiele圖解法可以得到多級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的理論萃取級數。由圖6可以看出,在原料液下相的木瓜蛋白酶的初始質量濃度為0.12 mg/mL的情況下,當相比為0.5時,即操作線1,此時多級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的理論級數為3;當相比為0.25時,即操作線2,此時多級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的理論級數為4。

圖6 多級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的理論級數

2.6 多級雙水相萃取工藝設計

將上述理論級數結果進行實驗驗證,結果如表2所示。經3級逆流雙水相萃取后,木瓜蛋白酶的酶活性回收率達到了96.75%。由此可得多級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的預測優化方案,如圖7所示。

表2 0.5相比下3級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的酶活性回收率Table 2 Enzyme activity recovery rate of papain in three-stage countercurrent ATPE at 0.5 volume radio

圖7 相比0.5條件下的3級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的預測優化方案

3 結論

本文探究了多級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的理論級數,結果表明,當相比為0.5,原料液下相的木瓜蛋白酶的初始質量濃度為0.20 mg/mL時,使用3級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的酶活性回收率達到了96.75%,并設計出多級逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的優化方案,對多級雙水相萃取木瓜蛋白酶的方法在工業上大規模應用具有一定的意義。