基于宏基因組測序和純培養技術解析脹袋生抽醬油的微生物類群

王玉榮,席啦,易宗偉,付彩霞,葛東穎,郭壯*

1(湖北文理學院,湖北省食品配料工程技術研究中心,湖北 襄陽,441053) 2(湖北土老憨生態農業科技股份有限公司,湖北 宜都,443000) 3(湖北省發酵調味品工程技術研究中心,湖北 宜都,443000)

作為中國傳統的發酵調味品,醬油以大豆、小麥和食鹽為主要原料,經人工添加含有米曲霉等微生物的曲種發酵而成[1]。雖然醬油中含有大量的食鹽,但由于制作的開放性,產品中亦可能存在部分微生物,貨架期內若貯藏溫度過高,則產品可能會出現脹氣和變酸等質量問題[2]。以貨架期內出現脹壺現象的醬油為研究對象,上官宗渺[3]發現其微生物類群主要由破布子乳桿菌(Lactobacilluspobuzihii)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、埃切畢赤酵母(Pichiaetchellsii)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)構成。楊卓等[4]通過基因測序和產氣實驗證明了工廠中脹罐醬油的厭氧產氣菌為L.pobuzihii。蔣雪薇等[5]在成品變質醬油中解析出地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、嗜鹽芽胞桿菌(Bacillushalodurans)和B.megaterium等3株耐鹽性較好的產氣菌。張佳惠等[6]研究亦表明變質醬油中可能存在金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等食源性致病菌,并且隨著貯藏時間的延長,醬油中菌落總數會逐漸增加,食用后對身體健康存在極大的危害。由此可見,系統解析脹氣醬油中微生物的類群,對提升貨架期內醬油的穩定性和食用安全性均具有積極的意義。

目前大量研究人員對微生物的產氣途徑進行了分析,發現通過異型乳酸發酵部分微生物經戊糖磷酸途徑可產生乳酸、乙酸和二氧化碳[7],另外微生物的乳糖發酵產酸產氣也是一個重要途徑[8]。具體來講,部分酵母菌等真菌通過呼吸作用可產生二氧化碳[9],梭菌等嗜溫及嗜熱細菌可利用碳水化合物發酵產氫氣[10];產甲烷菌在厭氧環境中可利用揮發性脂肪酸產生甲烷[11]。由此可見,通過發酵產氣的微生物是多樣的,但可引起生抽醬油脹氣的具體微生物類群還有待進一步研究。利用宏基因組技術,SULAIMAN等[12]對醬油發酵過程中微生物類群和功能的變化進行了解析,結果發現發酵前期魏斯氏菌(Weissella)為優勢菌群而發酵后期則轉變為念珠菌(Candida),該研究亦同時揭示了不同發酵時期蛋白質和碳水化合物異養發酵的特征,這也直接證實了宏基因組技術在醬油微生物類群和功能解析中可行性。

湖北省某調味品公司生產的生抽醬油在留樣貯藏期間出現了脹氣現象,本研究采集了2個批次的脹袋生抽醬油樣品,首先采用宏基因組測序技術對其微生物類群進行了解析,繼而采用純培養技術對其微生物菌株進行了分離鑒定,最后對分離出的微生物菌株進行了產氣驗證實驗。通過本研究的開展以期為生抽醬油脹氣問題的解決提供數據支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2022年7月中旬和8月初,從湖北某醬油生產廠家采集在貯藏期間中出現漲袋現象的生抽醬油樣品2份,分別編號為Q1和Q2,同時采集正常醬油樣品2份,所有樣品的生產時間均為2022年5月。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒,德國QIAGEN公司;Illumina Novaseq 6000高通量測序平臺配套試劑,美國Illumina公司;PDA、LB和MRS培養基,青島海博生物技術有限公司;十六烷基三甲基溴化銨、酚、氯仿、異戊醇、氯化鈉、乙酸鈉、乙醇,國藥集團化學試劑有限公司;PCR buffer、dNTP mix、rTaq酶、Solution I、pMD18-T載體和Loading buffer,寶生物工程(大連)有限公司;PCR產物清潔試劑盒,艾思進生物技術(杭州)公司;引物27F/1495R、NS1/NL4和M13F(-47)/M13R(-48),武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Veriti FAST梯度PCR儀,美國ABI公司;164-5050基礎電泳儀,美國Bio-Rad公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統,美國Protein Simple公司;Illumina novaseq 6000高通量測序平臺,美國Illumina公司;R920型機架式服務器,美國DELL公司;DG250型厭氧工作站,英國Don Whitley公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 宏基因組測序及生物信息學分析

使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒提取生抽醬油樣品的宏基因組DNA,并將通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格的DNA寄往北京諾禾致源科技股份有限公司進行雙端各150 bp的宏基因組測序,測序平臺為Illumina HiSeq XTen。首先使用fastp v0.23.2軟件(https：//github.com/OpenGene/fastp)對下機序列進行質控,剔除長度<50 bp、平均質量值<20 bp和含有N堿基的序列[13];繼而通過與人類基因組比對,去除實驗中引入的人類基因組序列后得到可用于后續分析的有效序列;最后將有效序列與kraken2(v2.1.1)[14]和Bracken(v2.5)數據庫[15]比對以解析出脹氣生抽樣品中菌群群落的結構信息。

1.3.2 基于純培養技術脹袋生抽醬油中微生物的分離

使用倍比稀釋法將醬油樣品稀釋至10-1梯度,各取1 mL原液和1 mL稀釋液分別涂布于PDA、LB和MRS平板中,PDA平板在25 ℃有氧條件下正置培養5 d,LB平板在30 ℃有氧條件下倒置培養2 d,MRS平板在37 ℃無氧條件(85% N2,10% H2和5% CO2)下倒置培養2 d。挑取形態、大小和顏色各不相同的菌株,依照三區劃線法連續劃線3次后分別轉接于PDA、LB和MRS的液體試管中,培養1 d后收集菌體進行過氧化氫酶實驗和革蘭氏染色,最后通過觀察鏡檢結果初步判斷分離株的種類[16]。

1.3.3 脹袋生抽醬油中可培養微生物的鑒定及登錄號的申請

參照GUO等[17]的方法提取疑似細菌的DNA,并進行PCR擴增、連接、轉化和鑒定,參照OOI等[18]的方法對疑似酵母菌的菌株進行鑒定,將鑒定的陽性克隆子寄往上海桑尼生物科技有限公司進行測序,拼接返回序列后于美國國家生物技術信息中心NCBI比對,最后將所有分離株序列上傳至GeneBank數據庫,獲得細菌登錄號分別為OP002178-OP002238,酵母菌登錄號分別為OP018542-OP018543。

1.3.4 產氣驗證實驗

a)將分離出的微生物從凍存管中各取200 μL逐一活化在裝有5 mL液體培養基(PDA/LB/MRS)試管(10 mm×150 mm)中,分別于25、30、37 ℃下連續傳3代后離心,去掉上層清液并在菌泥中添加1 mL濃度為0.85%的生理鹽水后重懸待用。

b)取30 mL正常生抽醬油裝入一次性透明自立吸嘴包裝袋(30 mL),密封后于100 ℃沸水中保持15 min,隨后在無菌條件下排盡空氣待用。

c)在15 mm×150 mm的試管中裝入10 mL液體培養基(PDA/LB/MRS)和排盡氣泡的杜氏小管,于121 ℃滅菌15 min,放涼后待用。

驗證實驗一：參照張小麗等[19]的方法,并稍作修改,取200 μL A中重懸后的菌液在無菌條件下逐一接種于B方式處理后的醬油袋,同時制作不接菌的空白對照,分別在25、30、37 ℃條件下培養10 d,觀察是否出現脹袋現象。

驗證實驗二：參照張小麗等[19]的方法,并稍作修改,取200 μL A中重懸后的菌液在無菌條件下逐一接種于C方式處理后的PDA、LB和MRS液體試管,同時制作不接菌的空白對照,分別于25、30、37 ℃培養10 d并觀察結果。

1.3.5 微生物群落結構解析

使用MEGA5.0與R軟件的“tidyverse”、“treeio”和“ggtree”包構建系統發育樹;使用Origin 2018軟件繪制相對含量的柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 基于宏基因組測序技術解析脹袋生抽醬油的微生物類群

本研究首先對2個脹氣和2個正常生抽醬油樣品微生物基因組進行了提取,但2個正常樣品因提取的基因組質量較差無法進行上機建庫,究其原因可能與其微生物含量較少有關,因而本研究僅對2個脹袋生抽醬油樣品的微生物類群進行了解析。在過濾掉人類基因組和低質量序列后,Q1和Q2樣品共產出44 503 218條和47 657 592條序列,測序數據量分別為6.68 G和7.15 G,經比對共鑒定出526個屬和1 199個種。平均相對含量>1.0%屬和種的柱狀圖,如圖1所示。

A-屬;B-種圖1 基于宏基因組學技術脹袋生抽醬油中微生物群落在屬和種水平上的構成分析

由圖1-A可知,脹袋生抽醬油樣品中平均相對含量>1.0%的屬主要由四鏈球菌屬(Tetragenococcus)、聯合乳桿菌屬(Ligilactobacillus)、植物乳桿菌屬(Lactiplantibacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、伴生乳桿菌屬(Companilactobacillus)、腐敗乳桿菌屬(Loigolactobacillus)、促生乳桿菌屬(Levilactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和黏液乳桿菌屬(Limosilactobacillus)組成,平均相對含量分別為28.29%、27.40%、9.93%、4.81%、4.06%、2.95%、2.73%、1.76%、1.46%、1.41%和1.31%。由圖1-B可知,平均相對含量>1.0%的種主要由嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)、酸魚聯合乳桿菌(Ligilactobacillusacidipiscis)、植物乳植物桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)、耐酸乳桿菌(Lactobacillusacetotolerans)、棒狀腐敗乳桿菌(Loigolactobacilluscoryniformis)、短促生乳桿菌(Levilactobacillusbrevis)和屎腸球菌(Enterococcusfaecium)組成,平均相對含量分別為28.01%、25.50%、9.45%、2.49%、1.83%、1.53%和1.33%。值得一提的是,Q1和Q2樣品微生物組成和含量存在較大差異,其中T.halophilus在Q1樣品中最豐富,占比高達53.37%,而L.acidipiscis在Q2樣品中最豐富,占比高達41.99%。ZHANG等[20]的研究表明,T.halophilus與醬油中天冬氨酸和谷氨酸等鮮味化合物的產生呈顯著正相關,麻穎垚等[21]通過變性梯度凝膠電泳技術對脹袋醬油中的污染細菌進行了鑒定,亦發現其中存在L.acidipiscis。綜上所述,納入本研究的脹袋生抽醬油樣品中可能主要以乳酸菌為主,但具體是由于哪類微生物產氣從而引起了漲袋現象尚需進一步研究。并且,宏基因組測序技術是對樣本中存在的所有DNA進行測序,其包含了活細胞和死細胞,這對于解析生抽醬油中產氣微生物類群具有一定的干擾性,因此本研究進一步采用純培養技術對樣品中微生物菌株進行了分離鑒定。

2.2 基于純培養技術解析脹袋生抽醬油的微生物類群

因只有2個脹袋生抽醬油樣品成功完成了上機測序,本研究進一步使用純培養技術對其微生物菌株進行了分離鑒定,從2個脹袋生抽醬油樣品中共分離鑒定出49株細菌與2株酵母菌,其中細菌分離株的系統發育樹如圖2所示。

圖2 基于16 S rRNA基因序列構建的脹袋生抽醬油中細菌的系統發育樹

由圖2可知,49株細菌隸屬于6個屬下的11個種,分別為Ligilactobacillus下的破布子聯合乳桿菌(L.pobuzihii)和L.acidipiscis,Loigolactobacillus下的蛋白原酶腐敗乳桿菌(L.rennini),Bacillus下的枯草芽孢桿菌(Bsubtilis)、暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)、白色芽孢桿菌(B.albus)和擬蕈狀芽孢桿菌(B.paramycoides),Tetragenococcus下的T.halophilus,Rosenbergiella下的羅森伯氏菌(R.epipactidis),Enterococcus下的E.faecium,以及葡萄球菌(Staphylococcus)下的表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。由圖3亦可知,分別有23個和21個分離株隸屬于芽孢桿菌和乳酸桿菌,分別占總分離株的45.10%和42.86%,因而基于純培養技術,本研究發現脹氣生抽中的細菌多由芽孢桿菌和乳酸桿菌組成。李娜[22]運用傳統的純培養技術發現,脹罐醬油中主要的污染菌為B.subtilis、油酸芽孢桿菌(B.oleronius)、彎曲芽孢桿菌(B.flexus)、L.pobuzihii、L.acidipiscis和豌豆乳桿菌(L.piscium),與本研究相比其未分離出隸屬于Tetragenococcus、Rosenbergiella、Enterococcus和Staphylococcus的菌株,這可能是與樣品采集地和分離方式等存在差異有關。值得一提的是,E.faecium具有較強的環境耐受性,是人類和動物的腸道共生菌[23],S.epidermidis主要存在于皮膚的微環境及粘膜中,屬于條件致病菌的一種[24],它們在脹袋生抽醬油中被分離鑒定出,可能是源于釀造車間工人的不規范操作或樣品滅菌不徹底。

圖3 基于28 S rRNA基因序列構建的脹袋生抽醬油中酵母菌的系統發育樹

從脹袋生抽醬油中分離的2株酵母菌系統發育樹,如圖3所示。

由圖3可知,本研究僅從Q2樣品中分離出2株酵母菌,經鑒定均為扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera),隸屬于該種的微生物菌株能夠從可溶性淀粉中積累海藻糖,并產生淀粉酶、酸性蛋白酶和β-葡萄糖苷酶,在各種發酵食品中,被廣泛用作微生物發酵劑[25]。YAN等[26]的研究表明,S.fibuligera在醬油種曲發酵的初始階段生長,其產生的各種酶有助于葡萄糖的積累,與醬油風味的形成密切相關。

本研究進一步對2份樣品中可培養微生物構成情況進行了分析,結果如圖4所示。

圖4 基于純培養技術脹袋生抽醬油中微生物群落構成分析

由圖4可知,2份樣品中分離最多的菌株為B.subtilis,占分離株總數的39.22%,其次是L.pobuzihii、L.rennini和L.acidipiscis,分別占分離株總數的19.61%、11.76%和9.80%。秦南南等[27]從新疆某品牌的脹袋醬油中分離了2株產氣菌,經鑒定分別為B.subtilis和巨大芽孢桿菌(B.megaterium),與本研究結論存在一定的相似性。值得一提的是,采用宏基因組和純培養技術對脹氣醬油微生物類群進行解析時,2種技術獲得的結果存在一定的差異性。究其原因可能在于,醬油中部分微生物菌株處于休眠狀態,受培養基成分和培養條件等因素的影響,在實驗室條件下無法實現其純培養。此外,宏基因組技術是基于微生物的全基因組DNA進行測序,其無法區分微生物菌株存活狀態,因而可能將部分已經死亡的微生物菌株也進行了測序,導致了結果的不準確。

2.3 產氣驗證

為明確引起生抽醬油脹袋的微生物類群,本研究進一步對51株分離株進行了產氣驗證實驗。通過觀察第一個驗證試驗發現,51個分離株在醬油袋中均有少量淡黃色沉淀產生,但均未出現脹袋現象;通過觀察第二個驗證實驗發現,在所有接菌培養的試管底部均有菌體沉淀產生但杜氏小管內無氣泡。由此可見,本研究分離出的微生物菌株均不能引起醬油的脹袋。參照《伯杰細菌鑒定手冊》[28]發現B.subtilis在含有葡萄糖的復雜培養基中生長較為緩慢,但在有氧條件下生長旺盛且能產生二氧化碳,手冊中亦表明Staphylococcusepidermidis能分解精氨酸產氨、分解半胱氨酸可能產生少量硫化氫。由此可見,本研究的產氣實驗中隸屬于B.subtilis和Staphylococcusepidermidis的分離株均未出現產氣現象可能與其培養環境較為不適宜有關,但具體的原因還有待進一步的研究。吳浪濤研究表明,B.subtilis及其亞種(B.subtilissubspnatto)和L.pobuzihii含量較多時對醬油的脹氣現象有很大影響[29]。然而,本研究分別接種B.subtilis和Ligilactobacilluspobuzihii后并未出現醬油脹袋。究其原因可能在于：a)本研究并未分離出造成醬油脹袋的微生物菌株,在后續研究中可采用培養組學策略,通過更換培養基、改變培養溫度或轉換培養條件等方法盡可能多的分離出微生物菌株,對醬油漲袋這一產業問題的解決可能具有積極意義;b)醬油脹袋可能是多菌株協同作用的結果,而本研究接種的菌株均為單一菌株,因而在后續研究中還需進一步考慮多菌株的協同作用;c)除了微生物產氣的生物原因外,后續研究中亦需進一步考慮熱脹冷縮的物理原因或酸堿反應的化學原因[30]。

3 結論

本研究采用宏基因組測序和純培養技術對脹袋生抽醬油微生物類群進行了解析,宏基因組測序結果表明脹氣醬油中主要微生物為T.halophilus和Ligilactobacillusacidipiscis,兩者累計平均相對含量超過了50%。純培養結果表明,脹氣醬油中細菌被鑒定為6個屬下的11個種,具有較高的多樣性,且以B.subtilis、L.pobuzihii、L.rennini和L.acidipiscis為主,隸屬于4個種的分離株占總分離株的80%以上,而酵母菌多樣性較低僅以S.fibuligera為主。經驗證實驗發現,本研究分離的菌株均無法導致生抽醬油漲袋。由此可見,脹袋生抽醬油具有較高的微生物多樣性,在后續研究中引入培養組學策略以獲得更多的分離株,亦或考慮多菌株的協同作用,對醬油漲袋這一產業問題的解決可能具有積極的意義。