魔芋葡甘聚糖的氧化度對其與大豆分離蛋白美拉德反應產物的性質影響

劉路,羅國柳,鐘金鋒,劉雄,覃小麗

(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate, SPI)因其具有低成本、高營養價值和良好功能特性的獨特優勢,在食品工業中可作壁材應用于油脂包埋[1]。然而SPI在食品加工中易受溶液環境、加工條件等影響導致沉淀、聚集甚至變性,在一定程度上限制了SPI的應用。美拉德反應因其不需要額外添加化學物質且安全性高,是一種溫和綠色的蛋白質改性方法[2]。研究表明,分子質量較大的碳水化合物能與蛋白質形成具有更好乳化性和穩定性的美拉德反應產物,在此情況下,多糖被廣泛應用于美拉德反應以改善SPI的功能特性[3]。

魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan, KGM)作為一種天然中性多糖,具有良好的生物降解性、成膜性和穩定性[4],可用于美拉德反應改善蛋白的功能性質。KGM與花生分離蛋白發生美拉德反應后,溶解性和乳化性顯著提高[5]。CUI等[6]研究發現KGM與SPI形成的美拉德反應產物可以負載血管緊張素轉換酶并增強其穩定性。劉柳等[7]研究發現KGM與大米蛋白在最佳條件下發生美拉德反應,接枝度僅為14.94%。這可能是由于天然KGM分子溶解度較低,即使在低濃度下仍表現出極高的黏度和較差的分散性[8],在一定程度上限制了其應用于美拉德反應改性蛋白。研究表明,KGM含有豐富的羥基,可被化學氧化為氧化魔芋葡甘聚糖(oxidized konjac glucomannan, OKGM),使KGM黏度降低、溶解度增大[9],有望促進其與SPI的美拉德反應。但是,有關OKGM與SPI發生美拉德反應的研究尚未見報道。此外,OKGM的氧化度對美拉德反應及其產物的性質的影響還未清楚。

因此,本文以KGM為原料,通過高碘酸鈉氧化制備不同氧化度的OKGM,經紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)分析KGM的結構變化。然后通過濕法美拉德反應制備SPI-OKGM,探究OKGM氧化度和SPI與OKGM質量比對SPI-OKGM接枝度、褐變強度以及結構特性的影響,并借助乳化活性和乳化穩定性以及DPPH自由基清除率、還原力和抗脂質氧化能力表征美拉德反應產物的乳化能力和抗氧化能力,以期為拓展OKGM在美拉德反應改性蛋白等方面的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白,合肥博美生物科技有限公司;魔芋葡甘聚糖,湖北十堰花仙子有限公司;金龍魚大豆油,益海嘉里食品工業有限公司;溴化鉀(光譜級),天津光孚精細化工研究所;其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JY98-ⅢDN型超聲波細胞粉碎機,寧波新芝生物科技股份有限公司;TGL-16G臺式離心機,上海安亭科學儀器廠;H4-20KR臺式高速冷凍離心機,湖南可成儀器設備有限公司;FD-1A-50型冷凍干燥機,北京博醫康實驗儀器有限公司;T6新世紀紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;Spectrum Two型傅里葉紅外變換光譜儀,美國PerkinElmer公司;TM 4000 Plus 10101型掃描電鏡,日本日立高新公司;T18 ULTRA-TURRAX型高速均質機,德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 OKGM的制備

將120 g/L高碘酸鈉溶液分別與800 mL 10 g/L KGM溶液按照質量比0.4∶1、0.7∶1和1.1∶1混合,并使用蒸餾水定容至900 mL。避光條件下連續攪拌12 h,然后逐滴加入乙二醇并持續攪拌2 h以終止反應。將得到的反應混合液轉移至3.5 kDa透析袋中,室溫下連續透析24 h,離心后收集上清液,凍干備用。

1.3.2 OKGM的紅外表征和氧化度測定

使用Spectrum Two型傅里葉紅外變換光譜儀對KGM和OKGM進行分析。儀器設定波數范圍為4 000～500 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數為8次。

將0.1 g OKGM樣品添加至25 mL 0.25 mol/L的鹽酸羥胺水溶液(pH 4.0,含3 mL 0.05%的甲基橙)中,室溫下攪拌5 h后,用0.1 mol/L標準氫氧化鈉(NaOH)溶液滴定,以KGM作為空白對照,并按照公式(1)計算氧化度：

(1)

式中：V1為樣品液消耗NaOH的體積,mL;V0為空白液消耗NaOH的體積,mL;CNaOH為NaOH溶液的摩爾濃度,mol/L;Mw為KGM中葡萄糖單元的摩爾質量,162 g/mol;W為OKGM的質量,g。

1.3.3 美拉德產物的制備

參考ZHAO等[10]方法并略作修改。用磷酸鈉緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.4)配制質量濃度為60 g/L的SPI溶液和OKGM溶液。將SPI溶液在204 W下超聲5 min后與OKGM溶液按照不同質量比(4∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶4)混合均勻,恒溫水浴振蕩(60 ℃,200 r/min)30 h后置于冰水浴中冷卻至室溫以終止反應。將反應混合液置于去離子中透析24 h后冷凍干燥。其中,以氧化度為26.80%、42.98%和59.66%的OKGM制備的美拉德產物分別命名為SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66。

1.3.4 美拉德產物的表征

1.3.4.1 接枝度

參考PENG等[11]的方法,采用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)試劑法測定接枝度。將4 mL OPA試劑加入至200 μL 2 mg/mL樣品溶液中,充分渦旋混勻,35 ℃水浴2 min,在340 nm測定其吸光值,將4 mL OPA試劑加入至200 μL去離子水中作為空白對照,并根據公式(2)計算接枝度：

(2)

式中：A0為對照組,是相同培養條件下SPI在340 nm處的吸光度;A1為美拉德反應產物在340 nm處的吸光度。

1.3.4.2 褐變強度

參考PENG等[11]的方法,配制質量濃度為2.0 mg/mL 的樣品溶液,在420 nm處測量其吸光度(A420),以去離子水作為空白。

1.3.4.3 紅外光譜

使用溴化鉀壓片法測定樣品的FTIR光譜。分別將2 mg的SPI、SPI+OKGM共混物以及SPI-OKGM與溴化鉀以質量比1∶100混合研磨,壓制成薄片,試驗條件詳見1.3.2節。

1.3.4.4 表面形貌

采用掃描電子顯微鏡觀察SPI、SPI+OKGM共混物以及SPI-OKGM美拉德反應產物的形貌。將樣品分散于有雙面膠的樣品臺,吹掉浮粉并噴金,進行掃描觀察,放大倍數為300和1 000倍,加速電壓為15 kV。

1.3.5 美拉德產物的乳化性

參照ZHANG等[12]的方法并稍作修改。將30 mL 1 mg/mL樣品溶液與10 mL大豆油混合,利用均質機進行均質(10 000 r/min,1 min),使兩者充分混勻。從底部取出50 μL乳液并加入至5 mL 1 mg/mL十二烷基硫酸鈉溶液中,以1 mg/mL的十二烷基硫酸鈉溶液為空白對照,于500 nm波長下測定吸光度,根據公式(3)和公式(4)計算SPI、SPI+OKGM共混物以及SPI-OKGM的乳化活性和乳化穩定性：

(3)

(4)

式中：N為稀釋倍數;c為樣品濃度,g/mL;φ為乳狀液中油相體積分數,25%;θ為比色池光徑,cm;A0為0 min吸光值;A10為10 min吸光值;t為10 min。

1.3.6 美拉德產物的抗氧化能力

1.3.6.1 DPPH自由基清除率

參考YU等[13]的方法,并略作修改。將2 mg/mL樣品溶液與0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液等體積混合,避光反應30 min,在517 nm下測定其吸光值。相同條件下,用去離子水替代樣品溶液作為對照組,以無水乙醇替代DPPH乙醇溶液作為空白組。DPPH自由基清除率按公式(5)計算：

(5)

式中：At為樣品溶液組的吸光值;A0為樣品對照的吸光值;Ac為DPPH空白對照的吸光值。

1.3.6.2 還原力

參考ZHAO等[14]的方法,并略作修改。將1 mL 5 mg/mL樣品溶液和等體積的10 g/L鐵氰化鉀溶液和磷酸鈉緩沖溶液(0.2 mol/L,pH 6.6)混合。將混合溶液在50 ℃下保溫20 min,冰水浴冷卻后加入1 mL 100 g/L三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)溶液,隨后離心(8 000 r/min,10 min),收集1 mL上清液,并與1 mL去離子水和200 μL 1 g/L的氯化鐵溶液渦旋混合,室溫靜置10 min后測定700 nm處的吸光度。使用等量的去離子水代替樣品作為空白對照。

1.3.6.3 抗脂質氧化能力

參考ZHANG等[15]的方法。將卵磷脂溶于磷酸鈉緩沖溶液(0.01 mol/L,pH 7.4)配制10 mg/mL的溶液并標記為LLS。將15 g TCA、0.37 g硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)和2 mL濃鹽酸加入去離子水中并定容至100 mL,將該溶液標記為TCA/TBA/HCl。分別取1 mL樣品溶液與等體積的LLS和400 μmol/L FeCl3混合均勻,于37 ℃水浴60 min,加入2 mL TCA/TBA/HCl,沸水浴15 min后,取出冰水冷卻。最后將冷卻后的溶液離心(8 000 r/min,10 min),取上清液測定532 nm下的吸光度值A1。空白組用去離子水代替樣品,測定其吸光度A0。抗脂質氧化能力按公式(6)計算：

(6)

1.4 數據處理

所有實驗重復3次,結果以平均值±標準偏差表示。用統計軟件SPSS(Trial version 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進行單因素方差分析(P<0.05時表示組間差異顯著)。

2 結果與分析

2.1 OKGM的制備與表征

A-氧化度;B-紅外光譜圖1 氧化魔芋葡甘聚糖的氧化度與紅外光譜

2.2 OKGM氧化度和SPI與OKGM的質量比對SPI美拉德反應進程的影響

2.2.1 接枝度

接枝度可直接反映蛋白質的美拉德反應程度,是美拉德反應產物最重要的理化性質之一[18]。圖2為SPI與3種氧化度的OKGM在不同質量比下制備的美拉德反應產物的接枝度。當SPI與OKGM質量比為2∶1和1∶1時,SPI-OKGM的接枝度隨OKGM氧化度的增大而增加,表明在特定的SPI與OKGM質量比下,高氧化度的OKGM具有更強的反應活性。隨SPI與OKGM的質量比由4∶1降低至1∶4時,SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的接枝度均呈現先增大后減小的趨勢,并分別在1∶2、1∶1和1∶1時達到最大,為35.15%、38.38%和40.62%,說明與較低氧化度的OKGM相比,較高氧化度的OKGM能在更少質量參與反應的情況下即可達到最大接枝度。

圖2 SPI與OKGM質量比對SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的接枝度的影響

2.2.2 褐變強度

褐變引起吸光值的增加可以在一定程度上評估美拉德反應程度[19]。圖3為SPI與OKGM質量比和OKGM氧化度對SPI-OKGM褐變強度的影響。當SPI與OKGM質量比為1∶1時,SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的褐變強度相比于SPI+OKGM共混物(SPI與OKGM質量比為1∶1)的褐變強度分別顯著提高了0.16、0.30和0.34。SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66褐變強度隨SPI與OKGM質量比的變化趨勢與接枝度隨質量比的變化趨勢(圖2)相似。此外,在所有質量比下(4∶1～1∶4),SPI-OKGM美拉德反應產物的褐變強度隨OKGM氧化度的增大而增加,表明OKGM氧化度越大,其與SPI形成的棕色聚合物越多,接枝產物顏色越深。

圖3 SPI與OKGM質量比對SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的褐變強度的影響

2.3 OKGM對SPI結構的影響

2.3.1 紅外光譜分析

A-SPI-OKGM 26.80;B-SPI-OKGM 42.98;C-SPI-OKGM 59.66圖4 SPI與OKGM的質量比對SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66紅外光譜的影響

2.3.2 掃描電鏡分析

圖5為SPI、SPI+OKGM共混物以及SPI-OKGM的掃描電鏡圖。SPI呈現出緊湊的不規則片狀結構,表面光滑(圖5-A);SPI和3種不同氧化度的OKGM的共混物呈現片狀堆疊的結構,并呈現黑白分明的2種顏色(圖5-B～圖5-D),表明SPI和OKGM僅是簡單的混合,存在不均勻現象。與單一的蛋白相比,SPI與OKGM的美拉德反應產物呈現出相對松散的薄片狀(圖5-E～圖5-G),說明美拉德反應使SPI空間結構延伸,OKGM進入并覆蓋其表面,導致蛋白質之間的聚集程度顯著降低[22-23]。

2.4 OKGM氧化度和SPI與OKGM的質量比對SPI乳化能力的影響

圖6反映了SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66在不同SPI與OKGM質量比下的乳化活性(圖6-A)和乳化穩定性(圖6-B)。由圖6-A可知,隨著OKGM質量占比的增加,SPI-OKGM的乳化活性呈現先增大后減小的趨勢。當SPI與OKGM質量比為1∶2、1∶1和1∶1時,SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的乳化活性增大至最大,分別為103.05、106.55、113.25 m2/g,這是因為SPI和OKGM結合,在油-水界面,增加空間位阻,利于形成親-疏水平衡,接枝產物吸附在油水界面形成緊密的保護層,從而阻止了油滴的聚集[24]。隨著OKGM質量占比繼續增加,SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的乳化活性反而分別降低了33.81、13.83、5.93 m2/g,但始終高于單一SPI(36.39 m2/g)。同時,乳化穩定性結果與乳化活性結果有著相似的趨勢(圖6-B)。

A-乳化活性;B-乳化穩定性圖6 OKGM氧化度和SPI與OKGM質量比對SPI-OKGM乳化活性及乳化穩定性的影響

2.5 OKGM氧化度和SPI與OKGM質量比對SPI抗氧化能力的影響

DPPH自由基清除率、還原力和抗脂質氧化能力均是評價物質抗氧化性能的重要指標。不同SPI與OKGM質量比下OKGM氧化度對SPI-OKGM的DPPH自由基清除率和還原力的影響如圖7-A和圖7-B所示。SPI與OKGM物理共混以及發生美拉德反應后,DPPH自由基清除率和還原力均增強,且與SPI+OKGM共混物(SPI與OKGM質量比為1∶1)相比,相同質量比下的SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的DPPH自由基清除率分別增加了42.98%、45.78%和47.91%;還原力分別增加了0.45、0.44和0.48,這是因為SPI與OKGM發生美拉德反應形成了具有抗氧化能力的中間體和類黑精等棕色聚合物[13],表明通過美拉德反應對SPI改性是提高SPI的抗氧化能力的有效途徑。此外,SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的DPPH自由基清除率和還原力均隨OKGM質量占比的增加呈現先增大后減小的趨勢,與接枝度隨質量比的變化趨勢相似(圖2)。

A-DPPH自由基清除率;B-還原力;C-抗脂質氧化能力圖7 OKGM氧化度和SPI與OKGM質量比對SPI-OKGM抗氧化能力的影響

圖7-C顯示了不同SPI與OKGM質量比下SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的抗脂質氧化能力。SPI與不同氧化度的OKGM以質量比1∶1物理共混后,抗脂質氧化能力顯著提升,但低于相同質量比下SPI-OKGM的。隨著SPI與OKGM從4∶1到1∶4,SPI-OKGM的抗脂質氧化能力呈現先增大后減小的趨勢。SPI-OKGM 26.80、SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的抗脂質氧化能力分別在SPI與OKGM質量比為1∶2、1∶1和1∶1時升高至最大,為40.68%、43.76%和39.16%。此外,除SPI與OKGM質量比為1∶2和1∶4時,SPI-OKGM 42.98和SPI-OKGM 59.66的抗脂質氧化能力均高于SPI-OKGM 26.80。

3 結論

本文研究了3種不同氧化度的OKGM在不同質量比下和SPI的美拉德反應。接枝度和褐變強度結果表明SPI-OKGM 59.66的美拉德反應程度更深,褐變更強。相比于SPI和SPI+OKGM共混物,SPI與OKGM在不同質量比下形成的美拉德反應產物的乳化性能和抗氧化性能明顯提升。其中,當SPI與OKGM質量比為1∶1時,SPI-OKGM 59.66的乳化活性和乳化穩定性分別為113.25 m2/g和41.81 min,DPPH自由基清除率和還原力分別為68.57%和0.68,表現最佳的乳化性能和抗氧化性能。本結果為OKGM應用于SPI的美拉德反應改性提供了理論依據,為拓展SPI-OKGM美拉德反應產物在食品領域應用提供一定技術積累。