重組大腸桿菌發酵條件優化提高D-阿洛酮糖3-差向異構酶活性的研究

劉微微,常楚婷,馮敬杰,張家赫,李飛勝,丁文濤,王昌祿

(天津科技大學 食品科學與工程學院,天津,300457)

D-阿洛酮糖(D-allulose)是D-果糖C3位置的差向異構體[1],具有與蔗糖相似的口感,但代謝產生的能量只有蔗糖的0.3%,還具有改善胰島素抵抗和預防糖尿病的功能[2-3],還可以提升嚙齒動物的抗肥胖作用,防止2型糖尿病的發展,并改善大鼠血脂異常[4-5]。糖尿病和肥胖癥是全球日益嚴重的健康問題,具有低熱量和預防糖尿病等功能的天然甜味劑D-阿洛酮糖受到廣泛關注[6],作為蔗糖的替代品具有重要的研究和應用價值[7]。

D-阿洛酮糖在自然界中的含量很低,提取成本極高,直接提取法很難滿足市場需求;此外,化學合成法反應條件苛刻,污染環境,副產物分離困難,難以實現產業化[8]。生物合成法則有周期短、成本低、對環境影響較小等優勢,目前,已成為生產D-阿洛酮糖的主要方法。GU等[9]在培養大腸桿菌中進行了培養基優化并對誘導條件進行研究,還研究了搖瓶培養中提高大腸桿菌分泌DAE的策略,使活性達3.5 U/mL。李秋鳳等[10]對大腸桿菌的培養條件進行了優化,優化后DAE的酶活可達10.11 U/g,以120 g/L的D-果糖為底物全細胞催化0.5 h后,D-阿洛酮糖產量為11.47 g/L。

本文以實驗室構建表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶(D-allulose 3-epimerase, DAE)的重組大腸桿菌為發酵菌株,研究發酵培養基及發酵條件對重組菌株生長和酶活的影響。通過優化重組大腸桿菌培養基碳源、氮源以及金屬離子的組成和濃度,提高了菌體密度和單位體積酶活;在此基礎上,對接種量、裝液量、誘導時間等培養條件進行優化,使得單位體積酶活進一步提高;最終在5 L發酵罐中進行批式發酵,實現了重組大腸桿菌的高密度培養,大大提高了DAE酶活,對D-阿洛酮糖3-差向異構酶的發酵生產具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實驗菌株為本研究室構建的大腸桿菌BL21-pET22b-CbDAE菌株,所表達DAE來自Clostridiumbolteae,Genbank登錄號：EDP19602.1。

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸粉5、氯化鈉10,pH自然。

LBA培養基：在LB培養基的基礎上加入氨芐青霉素,終質量濃度為100 mg/L。

初始發酵培養基(g/L)：基于SUN等[11]方法改進,葡萄糖30、酵母浸粉8、蛋白胨4、(NH4)2SO43、KH2PO43、MgSO40.5,pH 7。

以上培養基滅菌條件為121 ℃,20 min。

1.2 儀器與設備

Agilent 8453紫外分光光度計、Agilent 1200高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;5 L自動控制發酵罐,上海百倫生物科技有限公司;Sugar-Pak I Column色譜柱,Waters;LS-B50 L立式蒸汽壓力鍋,上海華線醫用核子儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養方法

1.3.1.1 活化

將保藏于-80 ℃的重組大腸桿菌劃線接種于LBA液體培養基中,37 ℃培養12 h后轉接于LBA固體平板,37 ℃靜置培養12 h。

1.3.1.2 種子培養

將平板活化后的重組大腸桿菌挑取單菌落,接種于LBA培養基中,37 ℃、200 r/min過夜培養。

1.3.1.3 蛋白表達

將種子液以5%(體積分數)的接種量接種于發酵培養基中,37 ℃、200 r/min培養至OD600=0.6～0.8時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導重組大腸桿菌合成目的蛋白,30 ℃、200 r/min培養8 h后結束發酵。

1.3.2 實驗方法

1.3.2.1 培養基優化

(1)通過單因素試驗進行碳源選擇及添加量優化：以初始發酵培養基為對照,在初始發酵培養基的基礎上,使用不同碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘油)替換初始發酵培養基中的碳源,確定最佳碳源。在最佳碳源種類的基礎上,進行碳源添加量(5、10、15、20、25、30、35 g/L)的優化。

(2)通過單因素試驗進行氮源選擇及添加量優化：以初始發酵培養基為對照,使用不同氮源及不同配比(酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、酵母浸粉+胰蛋白胨、酵母浸粉+牛肉膏、酵母浸粉+大豆蛋白胨)替換初始發酵培養基中的氮源。在最佳氮源種類的基礎上進行氮源添加量(5、10、15、20、25、30 g/L)的優化。

(3)通過單因素試驗進行金屬離子選擇及添加量優化：以初始發酵培養基為基礎,考察不同金屬離子(Fe2+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Zn2+)對發酵酶活性的影響。在最佳金屬離子種類的基礎上進行金屬離子添加量(0.01、0.025、0.05、0.075、0.1 mmol/L)的優化。

1.3.2.2 搖瓶水平發酵條件優化

(1)接種量：利用優化后的發酵培養基,分別按1%、3%、5%、7%、10%(體積分數)的種子液接入發酵培養基,37 ℃、200 r/min培養至OD600=0.6～0.8時加入IPTG誘導大腸桿菌合成目的蛋白,30 ℃、200 r/min培養8 h后結束發酵。

(2)裝液量：利用優化后的發酵培養基,在250 mL錐形瓶培養大腸桿菌,將種子液以5%接入量接到發酵培養基中,裝液量分別為10%、20%、30%、40%、50%(體積分數),培養及誘導條件同上。

(3)發酵時間：利用優化后的發酵培養基,將種子液以5%的接種量進行接種,培養條件同上,30 ℃、200 r/min分別培養8、10、12、14、16 h。

(4)IPTG添加量：將種子液以5%的接種量進行接種,當OD600在0.6～0.8時加入IPTG進行誘導,IPTG添加量分別為0.1、0.2、0.4、0.7、1 mmol/L,培養及誘導條件同上。發酵結束收集菌體,離心并用PBS緩沖液洗滌2次,將定容后的菌液進行果糖催化反應。

1.3.2.3 5 L發酵罐放大驗證

利用5 L發酵罐進行發酵,裝液量為3 L,pH控制為7,溶氧控制為30%,在誘導發酵過程中,每隔2 h取樣一次,收集菌體,離心,用PBS緩沖液進行洗滌2次,將定容后的菌液進行果糖催化反應。

1.3.2.4 不同細胞添加量對酶促反應的影響

在催化體系中分別加入不同量的細胞,分別為0.014、0.007、0.002 8、0.001 4 g DCW/L,反應20 min、40 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h,取樣測定。

1.3.3 指標檢測方法

菌體測量方法：發酵過程中取樣測定,稀釋一定倍數之后,在波長600 nm測定吸光度值。

酶活性測定：將發酵液進行離心(6 000 r/min,10 min,4 ℃),收集菌體,用PBS緩沖液(pH=7,50 mmol/L)洗滌2次。將收集的菌體利用PBS緩沖液重懸并定容后進行酶促反應。

酶促反應體系：果糖終質量濃度500 g/L,加入PBS(pH=7)緩沖液并加水稀釋至體系終濃度為50 mmol/L。50 ℃預熱反應體系,將適量的細胞加入到預熱后的酶促反應體系中,50 ℃反應20 min,沸水浴10 min終止反應。反應液低溫離心(4 ℃,10 000 r/min,10 min)后取上清液,稀釋20倍后進行HPLC檢測。

高效液相色譜測定條件：柱溫溫度80 ℃,流動相為超純水,流速0.6 mL/min;檢測器為示差折光檢測器。

1.3.4 酶活性的定義

酶活性定義：在50 ℃反應條件下,1 min內酶催化D-果糖產生1 μmol的D-阿洛酮糖所需要的酶量定義為1個酶活單位。

1.4 數據處理與統計分析

所有實驗均重復進行3次,數據以平均值±標準偏差(standard deviation,SD)表示。使用SPSS中Duncan方法,對數據進行方差分析和多重測試分析。在P<0.05時表示處理的結果存在差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基優化單因素試驗

2.1.1 碳源種類及添加量對酶活性和菌體量的影響

在初始培養基的基礎上,利用不同碳源(果糖、乳糖、蔗糖、甘油)替換初始發酵培養基中的葡萄糖,確定最佳碳源,結果如圖1-a所示。當碳源為蔗糖時,D-阿洛酮糖-3-差向異構酶的比酶活最高,為9.81 U/mL,是對照組的2.22倍;其次為甘油、乳糖和果糖。不同碳源不僅導致單位體積酶活的差異,同時也對菌體量有影響,在以甘油為唯一碳源時,菌體密度最高,OD600為5.69。當使用蔗糖作為碳源時,OD值增加了27.35%,但單位體積酶活性增加了112.4%,說明蔗糖為碳源有利于重組大腸桿菌對重組蛋白的合成。

a-不同碳源;b-蔗糖添加量圖1 不同碳源的添加以及蔗糖添加量對酶活性及OD600的影響

以蔗糖作為碳源,進行添加量(5、10、15、20、25、30、35 g/L)的優化,對菌體OD值和酶活性的影響如圖1-b所示。隨著蔗糖添加量的增加,DAE的酶活性呈現先增加后減少的趨勢。當蔗糖添加量為10 g/L時,單位體積的酶活性最高,為15.16 U/mL。蔗糖添加量過高不僅會導致DAE的酶活降低,也導致菌體量降低。說明過高濃度的蔗糖對微生物的生長有一定的抑制作用[12]。因此,確定最優蔗糖添加量為10 g/L。

2.1.2 氮源種類及添加量對酶活性和菌體量的影響

以初始發酵培養基為對照,使用不同氮源(酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、酵母浸粉+牛肉膏、酵母浸粉+大豆蛋白胨)替換初始發酵培養基中的酵母浸粉+胰蛋白胨,對菌株生長以及酶活性的影響如圖2-a所示。不同氮源對單位體積的酶活性有較大影響,當氮源為大豆蛋白胨時,DAE的酶活性最高,為11.16 U/mL,比對照組提高47.71%,且顯著高于其他氮源。當胰蛋白胨為唯一氮源時,OD600值最高,達到4.43,但酶活性卻僅為大豆蛋白胨為碳源時的51.05%,因此,確定最優氮源為大豆蛋白胨。對大豆蛋白胨進行氮源添加量(5、10、15、20、25、30 g/L)的優化,結果如圖2-b所示。大豆蛋白胨添加量對單位體積的酶活性影響顯著,隨著大豆蛋白胨添加量的升高,單位體積酶活性呈現先增加后減少的趨勢,當大豆蛋白胨添加量為15 g/L時,單位體積酶活性最高,為11.59 U/mL。因此,確定大豆蛋白胨最優添加量為15 g/L。

a-不同氮源;b-大豆蛋白胨添加量圖2 不同氮源的添加以及大豆蛋白胨添加量對酶活性及OD600的影響

2.1.3 金屬離子種類及添加量對酶活性和菌體量的影響

蛋白質的多肽鏈通常與金屬離子配位,具有官能團的側鏈可以作為金屬的附加結合位點,包括組氨酸的咪唑基團、天冬氨酸和谷氨酸的羧基、酪氨酸的酚環以及賴氨酸和精氨酸側鏈的氮[13]。氫鍵、靜電和疏水鍵以及范德華相互作用對金屬-蛋白質相互作用具有重要意義,對蛋白質結構的穩定有相當大的影響。影響金屬與蛋白質結合的因素包括金屬性質,例如價態、離子半徑、電荷接受能力和各自生物區室中的游離金屬濃度[14]。以初始發酵培養基為基礎,考察不同金屬離子(Fe2+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Zn2+)對DAE酶活性和菌體生長的的影響,結果如圖3-a所示。不同金屬離子對單位體積酶活性有較大影響,當金屬離子為錳離子時,酶活性最高,為13.19 U/mL,相比于對照組提高36.39%。添加不同離子對酶活性有很大影響,但對OD600值卻影響不大,說明金屬離子對菌體的生長影響不顯著。在此基礎上,研究了不同的Mn2+添加量(0.01、0.025、0.05、0.075、0.1 mmol/L)對菌體生長和酶活性的影響,結果如圖3-b所示。隨著Mn2+添加量的升高,單位體積酶活性呈現先增加后減少的趨勢。當錳離子添加量為0.025 mmol/L時,單位酶活性可高達14.25 U/mL。不同金屬離子濃度對OD600值的影響不大。

2.2 單因素發酵條件優化

2.2.1 接種量對DAE酶活性和菌體量的影響

除培養基外,接種量對微生物的發酵也有較大影響。提高接種量,可以促進微生物的生長,且有利于縮短菌體生長的延滯期;而接種量過大,代謝會向生物量轉變,減少酶的合成[15]。因此,合適的接種量對于發酵生產有著重要的意義。分別按1%、3%、5%、7%、10%(體積分數)的接種量研究其對微生物生長及酶活性的影響,結果如圖4所示。隨著接種量的增大,單位體積酶活性呈現先升高后降低的趨勢。當接種量為3%時,單位體積酶活性最高,為14.94 U/mL。雖然不同接種量對酶活性有較大影響,但對于發酵菌體的最終密度影響并不大。因此,確定了最佳接種量為3%。

圖4 接種量對酶活性及OD600的影響

2.2.2 培養基裝液量對DAE酶活性及菌體量的影響

由于大腸桿菌是一種兼性厭氧菌,發酵液中的溶氧量對大腸桿菌的生長起著重要作用,菌體生長快慢對重組蛋白的合成同樣產生影響。在搖瓶培養中,溶氧量的多少直接受到搖瓶裝液量的影響。因此,搖瓶內適量的培養基有利于菌種的生長和重組蛋白的表達。分別按10%、20%、30%、40%、50%的裝液量研究其對菌體生長與酶活性的影響,結果如圖5所示。隨著裝液量的增加,單位體積酶活性呈現先增加后減少的趨勢。當接種量為30%時,單位體積酶活性最高,為13.41 U/mL。不同裝液量對單位體積酶活性影響較大,但對菌體影響較小。因此,確定了最佳裝液量為30%。

圖5 裝液量對酶活性及OD600的影響

2.2.3 誘導時間對DAE酶活性和菌體量的影響

誘導時間與蛋白產量和酶活性密切相關,受到氮源、碳源等能源物質的限制和已表達蛋白的抑制作用的影響,重組蛋白產量不會一直持續增長。分別誘導8、10、12、14、16 h,研究不同誘導時間對菌體密度和單位體積酶活性的影響,結果如圖6所示。隨著發酵時間的延長,單位體積酶活性呈現先升高后降低的趨勢。當發酵10 h時,單位體積的酶活性最高,為20.23 U/mL。當誘導時間達到或超過12 h時,菌株OD持續增加,但酶活性顯著降低。因此,最佳誘導時間為10 h。

圖6 誘導時間對酶活性及OD600的影響

2.2.4 誘導劑添加量對DAE酶活性和菌體量的影響

本研究中使用的是重組大腸桿菌,其DAE啟動子為誘導型啟動子,只有加入誘導劑(IPTG)才會開始表達蛋白。誘導劑濃度是影響誘導型啟動子表達重組蛋白的重要因素,濃度過低可能導致誘導劑的量不足以與阻遏蛋白結合,從而降低表達水平;當誘導劑的濃度太高又可能會使菌體的生長受限,重組蛋白的表達太快會產生包涵體[16]。本研究中以不同的誘導劑濃度(0.1、0.2、0.4、0.7、1 mmol/L)誘導蛋白表達,結果如圖7所示。隨著誘導劑濃度的升高,單位體積酶活性不斷增大。當誘導劑添加量為1 mmol/L時,單位體積酶活性最高,為14.22 U/mL,是誘導劑添加量0.1 mmol/L時單位體積酶活性的1.85倍。隨著IPTG濃度的增加,菌體密度逐漸降低,說明高濃度IPTG對菌株的生長不利?？紤]到IPTG對酶活性的影響及經濟問題,確定最佳誘導劑添加量為1 mmol/L。

圖7 IPTG添加量對酶活性及OD600的影響

2.3 培養基及培養條件優化前后對酶活性和菌體量的對比

采用單因素對培養基及培養條件進行優化,重組大腸桿菌的菌體密度和單位體積酶活性變化如圖8所示。優化后,重組大腸桿菌單位體積酶活性有了大幅提升,達到優化前的2.57倍;菌體密度也有所提高,達到優化前的1.46倍,說明培養基以及培養條件優化在提高菌體密度的同時,大幅度提高了目的蛋白的活性表達。

圖8 優化前后酶活性及OD600的對比

2.4 發酵罐高密度發酵研究

相比于搖瓶培養,發酵罐培養不但能夠更好地控制發酵條件,從而有利于微生物的生長和目的蛋白的穩定表達,而且發酵罐也更接近實際生產條件,具有現實意義。

本研究在前期培養基和培養條件優化的基礎上,利用5 L發酵罐研究重組大腸桿菌的生長和目的蛋白表達特性,在誘導10 h后開始進行補充葡萄糖溶液,參考李瀾瀟等[17]補料方式,結果如圖9-a所示。隨著培養時間的延長,重組大腸桿菌菌體密度逐漸增加并逐漸趨于平衡,OD600最高可達51.8,菌體干重最高可達21.5 g/L;單位體積酶活性呈現先升高后降低的趨勢,當誘導時間為18 h時,單位體積酶活性最高為103.8 U/mL。

a-不同誘導時間對大腸桿菌的干重、OD600及酶活性的影響;b-不同細胞添加量、不同催化時間對轉化率的影響;c-產物液相檢測圖圖9 誘導時間對大腸桿菌的干重、OD600、酶活性不同影響以及不同細胞添加量對轉化率的影響

取不同誘導時間的重組大腸桿菌細胞進行D-果糖到D-阿洛酮糖的全細胞轉化反應,當誘導時間為18 h時,D-阿洛酮糖產量最高,達到90.47 g/L;轉化率達到18.26%?？紤]到不同細胞添加量對催化速率的影響,在反應體系中加入不同細胞量在不同反應時間取樣測定,結果如圖9-b所示。細胞添加量越多,在初始反應時催化速度越快,當細胞添加量為0.014 g DCW/L時,催化1 h即可達到最大反應平衡點28.76%,D-阿洛酮糖產量可達149.74 g/L。

3 結論與討論

在重組大腸桿菌發酵D-阿洛酮糖3-差向異構酶的研究中,獲得高水平的單位體積酶活性是實際生產中的本質要求,這與菌株的生長代謝關系密切。本實驗通過優化培養基與發酵條件,確定了重組大腸桿菌在發酵過程中的最適碳氮源以及金屬離子濃度,也確定了培養基的成分以及最佳培養條件。其中,最佳培養基的組成為：蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨15 g/L、(NH4)2SO43 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO40.5 g/L、MnSO40.025 mmol/L。通過發酵條件的單因素優化研究確定了大腸桿菌在發酵過程中的最佳誘導時間為10 h,接種量為3%,搖瓶裝液量為30%,IPTG添加濃度為1 mmol/L。通過本研究的優化,搖瓶單位體積酶活性達到優化前的2.57倍,菌體密度達到優化前的1.46倍。

周雪[15]在優化培養基以及培養條件后,以36 g/L果糖為底物,反應5 h生成D-阿洛酮糖為12.07 g/L。胡夢瑩[18]在45%D-果糖為底物,55 ℃,反應30 min時DAE的轉化率為12.5%左右。本實驗在優化培養基以及培養條件后,以500 g/L的D-果糖為底物,pH為7,50 ℃反應20 min轉化率為20.43%,D-阿洛酮糖生成量為102.33 g/L。在不同細胞添加量時,當細胞添加量為0.014 g DCW/L時反應1 h最高轉化率為28.76%,D-阿洛酮糖最高生成量可為149.74 g/L。最后,利用5 L發酵罐進行放大實驗,菌體密度(OD600)最高可達51.8,菌體干重最高可達21.5 g/L;誘導18 h時單位體積酶活性最高,可達103.8 U/mL。CHEN等[19]在7.5 L發酵罐中補料培養枯草芽孢桿菌產DAE,需要84 h獲得酶活性為95 U/mL。FU等[20]利用枯草芽孢桿菌在7.5 L發酵罐中發酵72 h酶活性為74 U/mL。因此,本研究對于D-阿洛酮糖3-差向異構酶的發酵生產具有重要的參考價值。