改進和優化黑果枸杞及其制品中花青素測定的pH示差法

譚亮,杲秀珍,王環,趙靜,李玉林

(中國科學院西北高原生物研究所/青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室,青海 西寧,810008)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)系茄科(Solanceae)枸杞屬(LyciumL.)植物[1],是西北干旱地區一種特有的多年生灌木野生植物,在我國寧夏賀蘭山、青海東西部、新疆北部等地皆有分布,其中尤其以柴達木和塔里木盆地分布最廣。黑果枸杞耐干旱,多喜生于鹽漬化生境土壤中,可作為水土保持的灌木植物[2]。黑果枸杞富含花青素,被人們稱為“花青素之王”。花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,屬于黃酮類化合物,多以糖苷的形式存在而成為花色苷[3]。花青素作為一種天然食用色素,安全、無毒、資源豐富,是迄今為止所發現的最強效的自由基清除劑,近年來越來越備受人們的關注[4-5]。

目前,有研究者進行黑果枸杞花青素的提取條件優化[6-7],但考察優化條件中未涉及到提取溶劑中溶劑種類和體系、溶劑中鹽酸體積占比,另pH示差法檢測顯色過程中緩沖溶液稀釋倍數的考察也未見文獻報道。通常采用液質聯用法、高效液相色譜法和pH示差法檢測黑果枸杞中花青素含量[8-9],其中采用pH示差法檢測花青素時,有研究者用矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素、兒茶素、平均花青素等計算,然而黑果枸杞中不含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷,飛燕草素也僅占1.34%,兒茶素多用于原花青素測定,以平均花青素計只能得到大概含量,實際上黑果枸杞中主要含矮牽牛素類花青素[10]。此外,有研究采用pH示差法檢測野生黑果枸杞飲料中花青素的含量[11],但以矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷作為標準物質通過外標法定量,而該成分并非是矮牽牛素類花青素的主要組成成分。針對以上問題,本文以青海特有的植物源性食品黑果枸杞及其制品為研究對象,對《AOAC官方方法 2005.02果汁、飲料、天然著色劑及酒中總花色苷含量的測定 pH示差法》(AOAC：Association of Official Analytical Chemists,美國官方分析化學師協會)中提取溶劑、提取過程、檢測顯色過程和數據處理分別進行了改進,通過液質聯用法鑒別出黑果枸杞中花青素的具體化學結構,并計算出混合花青素的平均摩爾質量。通過分光光度法測得混合花青素的平均摩爾消光系數,并對改進后的pH示差法進行方法學驗證和青海境內不同產地黑果枸杞及其制品中花青素的含量測定,該法能真實地反映黑果枸杞及其制品中花青素的含量,從而為青海特色植物源性食品黑果枸杞的質量控制提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞采自青海省境內6個產區21個不同地點,每個地點均采集3批,共63批,詳見表1。樣品預處理：將采集的黑果枸杞鮮果樣品陰干,用四分法取適量或取全部,除去果、柄以外肉眼可見的黑果枸杞枝、葉、碎果、小石子、土顆粒等雜質后,取有代表性試樣50 g,臨用前用食物粉碎機粉碎后,過40目篩,裝入黑色密封袋中密封,混勻后立即用于檢測。若暫存時間不超過1 h,并置于干燥器中避光保存備用。

表1 采自青海省境內6個產區21個不同地點的黑果枸杞樣品(n=3)Table 1 The samples of Lycium ruthenicum Murr.collected from twenty-one different locations of six different producing areas in Qinghai (n=3)

黑果枸杞制品：黑果枸杞片、提取物、凍干粉、膠囊、飲料、酒等6種黑果枸杞制品均為西寧市售產品,各購買3批,共18批,詳見表2。黑果枸杞片、提取物、凍干粉、膠囊均在室溫避光條件下置于干燥器中保存,其中,黑果枸杞片用四分法取適量或取全部,取有代表性試樣25 g,臨用前用玻璃研缽粉碎研磨混勻后,裝入黑色密封袋中密封立即用于檢測;黑果枸杞飲料、酒在室溫避光條件下保存,臨用前再開封。

表2 西寧市售的6種黑果枸杞制品(n=3)Table 2 Six types of Lycium ruthenicum Murr.products sold in Xining (n=3)

氯化矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷(反-對香豆酰)-5-O-葡萄糖苷(純度≥98%),武漢科斯坦生物科技有限公司;氯化矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷(純度≥95%),成都瑞芬思德丹生物科技有限公司;氯化鉀、結晶乙酸鈉、無水乙醇(均為分析純),天津百世化工有限公司;濃鹽酸(分析純),甘肅白銀瑞斯物資貿易有限公司;甲酸、乙腈、無水乙醇、甲醇(均為色譜純),山東禹王實業有限公司化工分公司;實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 Infinity Ⅱ- 6470 液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀,美國安捷倫科技公司;UV-1780紫外-可見分光光度儀,日本島津公司;KQ5200B超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;pHS-3E pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;PL203、MS205DU電子天平,瑞士Mettler Toledo公司;TGL-16C高速臺式離心機,上海安亭科學儀器廠;TYSP-100高速多功能粉碎機,浙江永康市紅太陽機電有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 pH示差法最佳提取和檢測條件的考察

在《AOAC 官方方法2005.02果汁、飲料、天然著色劑及酒中總花色苷含量的測定 pH示差法》基礎上做了改進,考察了提取溶劑(溶劑種類和體系、溶劑體積分數、溶劑中鹽酸體積占比)、料液比、超聲提取溫度、超聲提取時間、緩沖溶液的稀釋倍數、靜置平衡時間幾個因素。以都蘭縣宗加鎮諾木洪鄉產黑果枸杞為例,稱取已處理黑果枸杞干果粉末0.5 g,置于150 mL具塞磨口錐形瓶中,按料液比(g∶mL)為1∶25、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200準確加入提取溶劑[a)鹽酸-水(3∶97, 體積比,下同)、鹽酸-體積分數分別為100%、75%、50%、25%的甲醇溶液(3∶97)、鹽酸-體積分數分別為100%、75%、50%、25%的乙醇溶液(3∶97);b)鹽酸-體積分數分別為100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、60%的乙醇溶液(3∶97);c)鹽酸-80%乙醇溶液(0.05∶99.95, 0.1∶99.9, 0.5∶99.5, 1∶99, 2∶98, 3∶97, 4∶96, 5∶95)],于30、40、50、60、70、80 ℃超聲提取5、10、20、30、40 min。離心取上層花青素提取母液繼續加入原提取溶劑稀釋4倍后,再用緩沖溶液稀釋2、3、4、5、6倍,制備2份供試品檢測溶液,其中1份用氯化鉀緩沖溶液(0.025 mol/L, pH 1.0)稀釋,另1份用乙酸鈉緩沖溶液(0.4 mol/L, pH 4.5)稀釋。靜置平衡5、7、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80 min后,用1 cm厚比色皿在528 nm處分別測定用pH 1.0緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液和用pH 4.5緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液的吸光度值各一次,同理在700 nm處各測定一次,按公式(1)計算花青素的含量：

(1)

在初步單因素實驗的基礎上,進行單因素循環時試樣以料液比(g∶mL)1∶100加入提取溶劑鹽酸-80%乙醇溶液(3∶97),在50 ℃條件下提取30 min后制得提取母液。用原提取溶劑將提物母液稀釋4倍后,再用緩沖溶液稀釋5倍,靜置平衡20 min作為最初擬定的最佳實驗操作步驟,即在考察其中一個實驗條件時,嚴格遵照該擬定的其他最佳實驗操作步驟。在實際操作中,各單因素相互之間并非無關聯,而是相互交叉影響的。為全面考察影響因素,選取對花青素含量影響大的關鍵因素,在單因素試驗的基礎上設計了正交試驗,以確定最佳的黑果枸杞中花青素提取、檢測條件。

1.3.2 黑果枸杞中花青素化學結構鑒別

采用液相色譜-三重四級桿串聯質譜法,根據紫外-可見最大吸收波長、水解前后母離子峰(M-/M+)和子離子峰碎片(MS/MS)的質荷比值(m/z),鑒別出黑果枸杞中各花青素的具體化學結構。

1.3.2.1 液相色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18Rapid Resolution HD柱(1.8 μm, 50 × 2.1 mm),流動相：A：1%甲酸-乙腈溶液,B：1%甲酸-水溶液(0～15 min,5% A～20% A;15～20 min,維持20% A不變;20～30 min,20% A～60% A;30～35 min,維持60% A不變;35～40 min,60% A～5% A;40～58 min,維持5% A不變),流速：0.20 mL/min,檢測波長：530 nm,柱溫：35 ℃,進樣量：1 μL。

1.3.2.2 質譜條件

電噴霧電離源,正、負離子方式檢測;離子源溫度：450 ℃,碰撞氣：氮氣,流量：0.2 mL/min;霧化氣：氮氣,噴霧壓力：20 p.s.i;干燥氣：氮氣,溫度：325 ℃,流量：10.0 L/min;鞘氣：氮氣,溫度：400 ℃,流量：11.0 L/min;質荷比掃描范圍：100 ～ 1 500m/z;毛細管電壓：4 000 V(正離子)、2 500 V(負離子);掃描方式：MS2。

1.3.3 黑果枸杞混合花青素平均摩爾質量的確定

采用液相色譜-三重四級桿串聯質譜法,根據試樣中各花青素在總花青素中物質的量占比(Nx%)和各自摩爾質量(Mx),按照公式(2)求得黑果枸杞中混合花青素的平均摩爾質量(M混)：

M混/(g/mol)=Ma×Na%+Mb×Nb%+Mc×Nc%+…+Mn×Nn%

(2)

1.3.4 黑果枸杞混合花青素平均摩爾消光系數的確定

按黑果枸杞中主要含有的花青素標準物質在總花青素中的物質的量占比配制成濃度為1 mol/L的混合花青素標準儲備溶液。各取2份3 mL該標準儲備溶液用鹽酸-80%乙醇溶液(3∶97)稀釋定容至50 mL后分別加氯化鉀緩沖溶液(0.025 mol/L, pH 1.0)和乙酸鈉緩沖溶液(0.4 mol/L, pH 4.5)再次稀釋5倍后分別配制成pH 1.0和pH 4.5的花青素檢測溶液,用1 cm厚比色皿分別在λmax(nm)和700 nm處均測定2個不同pH值的花青素檢測溶液,測得4個吸光度值依據公式(3)求得黑果枸杞中混合花青素的平均摩爾消光系數：

(3)

1.3.5 方法學驗證實驗

為保證方法改進后檢測結果準確、可靠,對該法的準確性、科學性和可行性進行驗證,以證明分析方法符合花青素檢測的目的和要求。考察了改進pH示差法的專屬性、線性關系、精密度、穩定性、重復性、加樣回收率、定量限、檢出限并選取黑果枸杞干果及其制品黑果枸杞片、黑果枸杞凍干粉、黑果枸杞酒共4種樣品,同時送檢至其他3家實驗室進行實驗室間比對驗證實驗,以驗證方法再現性。將不同實驗室之間的檢測結果進行比較,以證明改進后pH示差法測定黑果枸杞及其制品中花青素的準確性。

1.3.6 黑果枸杞及其制品中花青素的含量測定

稱取一定量已處理試樣(干果、凍干粉、片劑、膠囊內容物粉末0.5 g,鮮果勻漿5.0 g,準確至±0.001 g;提取物粉末0.1 g,準確至±0.000 1 g),置于150 mL具塞磨口錐形瓶中,準確加入50 mL鹽酸-80%乙醇溶液(3∶97)于50 ℃超聲提取30 min,每隔10 min振搖1次,保持固相完全分散。冷卻至室溫后用提取溶劑補足減失的質量,以8 000 r/min離心3 min,取上清液即得花青素提取母液。將花青素提取母液繼續加入原提取溶劑稀釋4倍,再用緩沖溶液稀釋5倍,制備2份供試品檢測溶液,其中一份用氯化鉀緩沖溶液(0.025 mol/L, pH 1.0)稀釋(1 mL供試品溶液+4 mL氯化鉀緩沖溶液),另一份用乙酸鈉緩沖溶液(0.4 mol/L, pH 4.5)稀釋(1 mL供試品溶液+4 mL醋酸鈉緩沖溶液)。靜置平衡20 min后,用1 cm厚比色皿在(530±2) nm[不同樣品的花青素最大檢測波長參考值如下：黑果枸杞干果、飲料(528 nm)、黑果枸杞鮮果(529 nm)、黑果枸杞提取物、膠囊、酒(530 nm)、黑果枸杞凍干粉(531 nm)、黑果枸杞片(532 nm)]波長處分別測定用pH 1.0緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液和用pH 4.5緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液的吸光度值各一次,同理在700 nm處各測定一次,按1.3.1節公式(1)計算花青素的含量。

2 結果與分析

2.1 最佳提取和檢測條件的考察結果

2.1.1 單因素循環實驗

2.1.1.1 提取溶劑研究

花青素的化學結構中含有多個羥基,用常用大極性試劑水、甲醇、乙醇進行提取。從圖1-a可以看出花青素提取能力：乙醇>甲醇>水。從圖1-b可知,在不同體積分數的乙醇溶液中,80%乙醇提取花青素效果更佳。從圖1-c可知,鹽酸-80%乙醇體積比為4∶96時花青素含量最高、其次體積比為5∶95,但在這2個體積比時比色溶液均不澄清,呈微混濁狀態,還需進一步離心除去懸浮物使溶液澄清,增加了實驗操作步驟,費時費力,而鹽酸-80%乙醇體積比為3∶97時比色溶液澄清無混濁現象,花青素含量雖然并非最高,但與體積比為4∶96和5∶95結果之間無顯著性差異(P>0.05),故選擇提取溶劑為鹽酸-80%乙醇體積比為3∶97。

a-鹽酸-不同溶劑相同體積比;b-鹽酸-不同體積分數乙醇溶液相同體積比;c-鹽酸-80%乙醇溶液不同體積比;d-料液比;e-提取溫度;f-提取時間;g-緩沖溶液稀釋倍數;h-靜置平衡時間圖1 不同因素對黑果枸杞花青素含量的影響

2.1.1.2 提取過程研究

從圖1-d可知,花青素含量隨著料液比的增加先逐漸增加后趨于平穩但略有下降,在料液比(g∶mL)為1∶150時花青素含量高。料液比(g∶mL)為1∶100時花青素含量雖然并非最高,但與料液比(g∶mL)1∶150和1∶200結果之間無顯著性差異(P>0.05),同時從經濟效益考慮,為節省更多的化學溶劑故選擇料液比(g∶mL)為1∶100。從圖1-e可知,花青素含量隨著提取溫度的增加先逐漸增加,在提取溫度為50 ℃時花青素含量高;至60 ℃時花青素含量趨于相對平穩但開始下降,超過60 ℃時花青素含量下降明顯,至80 ℃時花青素含量急劇下降,與50 ℃時相比存在顯著性差異(P<0.05),可見黑果枸杞花青素在提取溫度超過60 ℃時由于受到較高溫度的影響而降解,故選擇提取溫度為50 ℃。從圖1-f可知,花青素含量隨著提取時間的延長逐漸增加,至提取時間為30 min時達到最高,此后隨著提取時間的進一步延長,黑果枸杞中花青素逐漸減少,傳質阻力逐漸下降,提取率增長緩慢不明顯,故選擇提取時間為30 min。

2.1.1.3 檢測顯色過程研究

從圖1-g可知,花青素含量隨著緩沖溶液稀釋倍數的增加急劇增加,在稀釋2～3倍時由于緩沖溶液體積占比不夠,不足以起到穩定提取溶液pH的作用,花青素在不穩定的pH條件下容易從穩定的紅色(花烊正離子)轉變為無色(甲醇假堿和查爾酮)。至稀釋倍數為4～5倍時緩沖溶液體積占比足以使提取溶液pH穩定在pH 1.0,而在pH 1.0時花青素花烊正離子最穩定,在稀釋倍數為5倍時,花青素含量達到最高,故選擇緩沖溶液稀釋倍數為5倍。從圖1-h可知,花青素含量隨著緩沖溶液的靜置平衡時間的延長有一定的波動,靜置平衡時間在20 min以內時花青素含量在3.48～3.49 g/100 g內波動,隨著靜置平衡時間的進一步延長,20 min以后至80 min時花青素含量在3.49～3.50 g/100 g內波動,花青素含量有一定增加,但波動穩定無明顯增長。溶液pH不同,花青素的4種化學結構形式便會在某一個pH下處于動態平衡,當加入不同pH緩沖溶液改變pH值時,動態平衡被打破發生轉移,結果表明靜置平衡20 min后達到一個新的動態平衡,這時可穩定測定吸光度,故選擇靜置平衡時間為20 min。

2.1.2 正交實驗

為全面考察影響因素,選取單因素循環實驗中對花青素含量影響大的關鍵因素,以V(鹽酸)∶V(80%乙醇溶液)(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)和靜置平衡時間(E)作為考察對象,在單因素試驗的基礎上設計了5因素3水平正交試驗,以確定黑果枸杞中花青素含量最高的最佳提取和檢測條件。考察的各因素及具體水平見表3,選用L27(35)正交表,正交實驗結果見表4。

表3 正交實驗因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal design

表4 正交實驗結果表Table 4 Results of orthogonal test

由表4可知,影響黑果枸杞中花青素含量的各因素主次順序為：料液比(B)>提取時間(D)>V(鹽酸)∶V(80%乙醇溶液)(A)>靜置平衡時間(E)>提取溫度(C)。從k值分析,使花青素含量最高的最佳提取和檢測條件為A3B2C2D2E3,而正交實驗所得結果是A3B2C2D2E1。該正交設計無重復實驗,采用SPSS 19.0軟件進行方差分析,分析可知ss(提取溫度C)= 0.072最小,它對整個實驗結果影響最小,因而將它作為誤差估計,用以檢驗其他因素作用的顯著性。結果表明,將提取溫度(C)作為誤差時,V(鹽酸)∶V(80%乙醇溶液)(A)、料液比(B)、提取時間(D)對花青素含量有顯著性影響(P<0.05),靜置平衡時間(E)對花青素含量無顯著性影響(P=0.858>0.05)。由此可知,直觀分析與方差分析結果一致。綜合各種因素,確定黑果枸杞花青素最佳提取和檢測條件為A3B2C2D2E3,即提取溶劑為鹽酸-80%乙醇溶液(3∶97),料液比(g∶mL)為1∶100,提取溫度為50 ℃,提取時間為30 min,緩沖溶液稀釋5倍后靜置平衡20 min。

同理對于黑果枸杞制品同樣按1.3.1節下內容進行條件考察,結果表明,a)黑果枸杞凍干粉、片劑、膠囊料液比(g∶mL)為1∶100,黑果枸杞提取物料液比(g∶mL)為1∶500,其余實驗條件同上述黑果枸杞。b)黑果枸杞飲料和酒按實際含有的花青素含量其料液比(g∶mL)為1∶5～1∶50不等,提取時間為10 min,其余實驗條件同上述黑果枸杞。

2.2 液相色譜-三重四級桿串聯質譜法鑒別黑果枸杞中花青素的具體化學結構

液質聯用分析黑果枸杞花青素檢測溶液的高效液相色譜圖見圖2,其保留時間(tR)、紫外-可見最大吸收波長(λmax)、母離子峰(M+)和子離子峰碎片(MS/MS)等化學結構鑒別信息見表5。結果鑒別出黑果枸杞中含有三類(矮牽牛素類、飛燕草素類、錦葵色素類)共9種花青素,其中有6種為矮牽牛素類花青素,分別是矮牽牛素-3-O-半乳糖苷-5-O-葡萄糖苷(峰1)、矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷(峰3)、矮牽牛素-3-O-(6-O-咖啡酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(峰5)、矮牽牛素-3-O-(6-O-對香豆酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(峰6)、矮牽牛素-3-O-(6-O-丙二酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(峰7)、矮牽牛素-3-O-(6-O-阿魏酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(峰8)。另外3種分別為飛燕草素-3-O-(6-O-順式對香豆酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(峰2)、飛燕草素-3-O-(6-O-反式對香豆酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(峰4)、錦葵色素-3-O-(6-O-對香豆酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(峰9)。其中矮牽牛素類、飛燕草素類、錦葵色素類花青素的物質的量占比分別為97.96%、1.34%、0.62%,可見黑果枸杞中的花青素主要為矮牽牛素類花青素,并且以矮牽牛素-3-O-(6-O-對香豆酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷為主,其在總花青素中的物質的量占比為89.98%,在矮牽牛素類花青素中的物質的量占比為91.86%。

圖2 黑果枸杞花青素的高效液相色譜圖

表5 黑果枸杞花青素的化學結構鑒別信息Table 5 Identification information of anthocyanins chemical structure in Lycium ruthenicum Murr.

2.3 黑果枸杞混合花青素平均摩爾質量的確定

2.4 黑果枸杞混合花青素平均摩爾消光系數的確定

2.4.1 標準物質的使用

黑果枸杞中的花青素有97.96%為矮牽牛素類花青素,其中矮牽牛素-3-O-半乳糖苷-5-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-(6-O-咖啡酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-(6-O-丙二酰)葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷和矮牽牛素-3-O-(6-O-阿魏酰)葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷這4種矮牽牛素類花青素均沒有可購買的標準物質,其物質的量總和僅占總花青素的1.22%,對整個實驗影響不大,因此用市售可以購買到的氯化矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷和氯化矮牽牛素-3-O-(6-O-對香豆酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷2種標準物質(占總花青素物質的量的96.73%)進行實驗。

2.4.2 平均摩爾消光系數的測定

按氯化矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷和氯化矮牽牛素-3-O-(6-O-對香豆酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷在總花青素物質的量占比的比例7∶93配制成濃度為0.912 mg/mL的標準儲備溶液,準確移取3 mL并用鹽酸-80%乙醇溶液(3∶97)稀釋定容至50 mL后,加pH 1.0和pH 4.5緩沖溶液再稀釋5倍分別配制成pH 1.0和pH 4.5的供試品檢測溶液(濃度為0.011 mg/mL),用上述2種矮牽牛素類花青素標準物質的平均摩爾質量換算為平均摩爾濃度為1.211 5×10-5mol/L。用1 cm厚比色皿分別在528、700 nm處均測定2個不同pH值的花青素檢測溶液,測得4個吸光度值,計算A=(A528nm-A700nm)pH 1.0條件下-(A528nm-A700nm)pH 4.5條件下=0.346 8(n=3),按照1.3.4節下公式(3),并按2種矮牽牛素類花青素物質的量在總花青素所占比例96.73%折算后,求得ε=29 591 L/(mol·cm)。

2.5 改進后方法學驗證結果

以都蘭縣宗加鎮諾木洪鄉產黑果枸杞為例,考察改進pH示差法的專屬性、線性關系、精密度、穩定性、重復性、加樣回收率、定量限和檢出限。

2.5.1 專屬性實驗

精密移取1份提取溶劑1.0 mL和1份花青素提取母液1.0 mL,先分別用原提取溶劑稀釋4倍后,再分別用氯化鉀緩沖溶液(0.025 mol/L, pH=1.0)稀釋5倍,分別得到對照溶液和氯化鉀-花青素檢測溶液。室溫靜置20 min后,用1 cm厚比色皿在400～700 nm可見波段進行掃描,以確定最大檢測波長。結果表明,黑果枸杞及其制品的氯化鉀-花青素檢測溶液在(530±2) nm處有最大吸收峰：黑果枸杞干果、飲料(528 nm)、黑果枸杞鮮果(529 nm)、黑果枸杞提取物、膠囊、酒(530 nm)、黑果枸杞凍干粉(531 nm)、黑果枸杞片(532 nm),而顯色后對照溶液在(530±2) nm處無吸收,說明不存在空白干擾,實驗方法專屬性良好,故選擇(530±2) nm作為最大檢測波長。

2.5.2 線性關系

準確移取0.011 mg/mL氯化矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷和氯化矮牽牛素-3-O-(6-O-對香豆酰)蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷混合標準溶液0.10、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25 mL,依次補加80%乙醇溶液0.40、0.25、0.00、0.25、0.00、0.25 mL,然后分別用氯化鉀緩沖溶液(0.025 mol/L, pH=1.0)和乙酸鈉緩沖溶液(0.4 mol/L, pH=4.5)稀釋10倍(依次加入緩沖溶液4.5、4.5、4.5、9.0、9.0、13.5 mL),分別得到氯化鉀-花青素檢測溶液和乙酸鈉-花青素檢測溶液。靜置20 min后,用1 cm厚比色皿分別在528 nm和700 nm 2個波長處均測定氯化鉀-花青素檢測溶液和乙酸鈉-花青素檢測溶液共4個吸光度值(總體積超過5 mL的檢測溶液最終均統一換算為濃縮至5 mL時的吸光度值),繪制混合矮牽牛素類花青素的標準曲線。以吸光度值為縱坐標,混合矮牽牛素類花青素質量為橫坐標,繪制標準曲線。結果混合矮牽牛素類花青素質量在0.011～0.138 mg內呈良好的線性關系,回歸方程為y=6.166 1x+0.011 2,R2=0.999 1。

2.5.3 精密度實驗

將已制備好的花青素供試品檢測溶液,室溫靜置20 min后,用1 cm厚比色皿分別在528 nm和700 nm波長處均測定用pH 1.0緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液和用pH 4.5緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液共4個吸光度值,早、中、晚各測定2次,一共測定6次,計算花青素含量的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)以考察日內精密度;連續測定3 d,每天均早、中、晚各測定2次,3 d一共測定18次,計算花青素含量的RSD值以考察日間精密度。結果計算得黑果枸杞中花青素含量的日內精密度RSD值為0.53%,日間精密度RSD值為0.94%,表明精密度良好。

2.5.4 穩定性實驗

將已制備好的花青素供試品檢測溶液,室溫避光條件下放置,在第1、2、6、8、10、12、15、20、24 h時分別于528 nm和700 nm波長處均測定用pH 1.0緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液和用pH 4.5緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液共4個吸光度值,計算花青素含量的RSD值。結果計算得黑果枸杞中花青素含量的RSD值為1.11%,表明黑果枸杞花青素檢測溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.5 重復性實驗

準確稱取5份黑果枸杞粉末,每份0.5 g,分別制備5份花青素供試品檢測溶液,每一份均在室溫靜置20 min后,用1 cm厚比色皿分別在528 nm和700 nm波長處均測定用pH 1.0緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液和用pH 4.5緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液共4個吸光度值,計算花青素含量的RSD值。結果計算得黑果枸杞中花青素含量的RSD值為1.68%,表明重復性良好。

2.5.6 回收率實驗

采用加樣回收法,準確稱取9份已知花青素含量的黑果枸杞粉末,每份0.25 g,分別按低、中、高3個水平精密加入2.10 mg/mL 2種混合矮牽牛素類花青素標準溶液2.5、5.0、7.5 mL,每一水平3份,并按2種矮牽牛素類花青素物質的量在總花青素所占比例96.73%折算后,計算花青素含量的平均回收率和RSD值。結果計算得黑果枸杞中花青素含量低、中、高3個水平的平均回收率分別為95.37%(RSD=1.12%)、96.57%(RSD=0.49%)、94.87%(RSD=0.70%),表明方法準確性良好。

2.5.7 定量限和檢出限實驗

依據ICH 指導原則中 Q2(R1)分析方法的驗證,準確移取11份1.0 mL鹽酸-80%乙醇溶液(3∶97)提取溶劑作為空白對照溶液,分別用氯化鉀緩沖溶液(0.025 mol/L, pH=1.0)和乙酸鈉緩沖溶液(0.4 mol/L, pH=4.5)稀釋一定倍數后,靜置20 min后,分別在(530±2) nm和700 nm兩個波長處均測定氯化鉀-花青素檢測溶液和乙酸鈉-花青素檢測溶液共4個吸光度值,求出這11份空白對照溶液響應值的標準偏差σ。然后再根據繪制的標準曲線斜率S,分別求出前處理之后的定量限(QL=10×σ/S)和檢出限(DL=3.3×σ/S),最終將稱樣量、稀釋倍數和定容體積一并用于計算黑果枸杞及其制品處理之前的定量限和檢出限(表6)。結果固體樣品和液體樣品最低檢出限分別為28.2 mg/100 g、0.282 mg/100 mL。

表6 黑果枸杞及其制品中花青素含量測定的檢出限和定量限Table 6 The detection limits and quantitative limits for the determination of anthocyanidins content in Lycium ruthenicum Murr.and products

2.5.8 實驗室間比對實驗

每個實驗室內部數據的精密度(以相對相差%計)和其他3家實驗室之間的精密度結果表明,實驗室內最大精密度為4.81%,室間最大精密度為8.97%,均滿足一般國家標準對食品中各種成分檢測的精密度要求(相對相差<10%),表明改進后的pH示差法再現性良好,可以準確測定黑果枸杞及其制品中花青素含量。

2.6 黑果枸杞及其制品中花青素的含量測定結果

結果表明,青海境內不同產區黑果枸杞中花青素含量為2.81～3.77 g/100 g,平均含量為3.38 g/100 g。其中,來自天峻縣龍門鄉的黑果枸杞中花青素含量最高為3.77 g/100 g,來自烏蘭縣希里溝鎮西莊村的黑果枸杞中花青素含量最低為2.81 g/100 g。各產區之間比較,大柴旦和天峻縣的黑果枸杞中花青素含量較高為3.61 g/100 g,其次是都蘭縣、德令哈市和格爾木市,黑果枸杞中花青素含量依次為3.51、3.36、3.34 g/100 g,烏蘭縣的黑果枸杞中花青素含量較低為3.00 g/100 g,但各產區之間黑果枸杞中花青素含量差異不顯著(P>0.05)。黑果枸杞制品中,黑果枸杞提取物中花青素含量可高達67.5 g/100 g,片劑、凍干粉和膠囊中花青素含量依次為1.32、2.55、1.40 g/100 g,黑果枸杞飲料和酒中花青素含量相當,分別為32.5、31.6 mg/100 mL(表7)。

表7 青海境內不同產地黑果枸杞及其制品中花青素的含量Table 7 The anthocyanidins content in Lycium ruthenicum Murr. samples collected from Qinghai different producing areas and its products n=3)

3 討論

3.1 pH示差法改進前后花青素檢測結果的比較

改進前后黑果枸杞及其制品中花青素的含量結果見表8。結果表明,在最佳提取和檢測條件下,黑果枸杞及其制品的花青素提取增長率均大于20%,其中,黑果枸杞的花青素提取增長率可高達50.0%,其余黑果枸杞制品的花青素提取增長率在22.1%～33.3%范圍內不等,優化提取和檢測條件能夠極大地提高花青素提取率。采用液相色譜-三重四級桿串聯質譜法鑒別出黑果枸杞中花青素主要為矮牽牛素類花青素,計算出混合花青素的平均摩爾質量為912.7 g/mol,平均摩爾消光系數為29 591 L/(mol·cm),分別以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計和以矮牽牛素類花青素計算黑果枸杞及其制品中花青素含量,結果以后者計算比以前者計算花青素含量增加了2.26～2.77倍不等,平均增加了2.41倍,說明對于完全不含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的黑果枸杞及其制品,若以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計算花青素含量必然造成很大誤差,檢測結果偏低,以矮牽牛素類花青素計算能夠真實地反映黑果枸杞及其制品中花青素的含量。

表8 pH示差法改進前后花青素含量檢測結果的比較Table 8 Comparison of detection results of anthocyanidins content between before and after improvement of pH differential method n=3)

3.2 pH示差法改進后花青素單次檢測結果的精密度分析

緩沖溶液稀釋5倍時可以使提取溶液pH穩定在pH 1.0,此時花青素花烊正離子最穩定,并且花青素含量達到最高。以都蘭縣宗加鎮諾木洪鄉產黑果枸杞為例,在最佳提取和檢測條件下其花青素含量為3.50 g/100 g。花青素檢測緩沖溶液靜置平衡時間在20 min以內時花青素含量在3.48～3.49 g/100 g內波動,在20 min以后至80 min時花青素含量在3.49～3.50 g/100 g內波動,20 min以后與20 min內相比略有增加,20 min內單次檢測結果精密度為0.57%(以最大相對相差%計),20 min以后單次檢測結果精密度為0.29%,可見在最佳檢測條件下花青素含量單次檢測結果精密度可穩定在0.3%以內,檢測結果更準確。

3.3 不同方法檢測花青素的結果分析

花青素常用的檢測方法主要有高效液相色譜法和pH示差法。高效液相色譜法前處理過程中在沸水浴條件下將花色苷水解成花青素時,由于加入了鹽酸,并且又在沸水浴的高溫條件下水解,劇烈的水解條件使部分花青素的化學結構被不可逆破壞,結果造成花青素大量損失。其次在多次使用同一根色譜柱后發現存在柱平衡時間長、色譜柱易污染、保留時間不穩定、變化大等問題。另處理好的試樣溶液即使存放在4 ℃冷藏條件下,其超過2 d后檢測結果也會比在24 h內檢測偏低,分析其原因可能是由于水解后單一花青素受甲基化程度的內在因素和溫度、pH值、光、金屬離子、氧、酶、抗壞血酸、糖及降解產物等外在因素的影響而發生不同程度的降解[12],與連接具有空間保護作用糖苷鍵的花色苷相比其穩定性更差。pH示差法檢測花青素采用超聲波提取法,實驗時間短、耗能少、提取率高、能有效保護花青素活性、操作簡單、檢測過程污染少,不涉及高效液相色譜法上述缺點以及還需要購買多種價格昂貴的進口花青素標準物質。以來自烏蘭縣希里溝鎮西莊村的黑果枸杞為例,采用上述2種方法分別檢測黑果枸杞中花青素的含量,高效液相色譜法檢測結果為1 101.6 mg/100 g,pH示差法檢測結果為2 810.4 mg/100 g,2個結果之間相差2.55倍。高效液相色譜法檢測花青素含量是以不含有糖苷鍵的飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥色素和錦葵色素6種花青素含量之和計算,而pH示差法檢測花青素含量是以連有糖苷鍵的矮牽牛素類花色苷計算,二者用于計算的花青素化學結構完全不同,所以不能說pH示差法檢測花青素含量高于高效液相色譜法,二者之間完全沒有可比性,這里需要注意的是在采用不同的檢測方法時,務必標示清楚用于計算的具體花青素名稱,以防誤用產生錯誤的結論。

4 結論

pH示差法不涉及高效液相色譜法存在的柱平衡時間長、色譜柱易污染、保留時間不穩定、試樣溶液易變質發生降解、需要購買多種昂貴的花青素標準物質等缺點,其方法簡單、快速、易操作。改進后的pH示差法在最佳提取條件下能夠最大限度地提取出黑果枸杞及其制品中的花青素,在最佳檢測條件下能夠提高單次檢測結果的精密度。以黑果枸杞中特有的矮牽牛素類花青素的平均摩爾質量和平均摩爾消光系數代替其不含有的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷進行計算,能真實地反映黑果枸杞及其制品中花青素的含量。該法的廣泛應用能夠不斷帶動青海省境內黑果枸杞花青素品質的提高,加強野生黑果枸杞資源的保護利用,有效地減少野生黑果枸杞的盲目破壞性采摘,防止對當地生態環境的嚴重破壞,大力發展人工種植技術,有效保護環境、恢復脆弱生態、維持黑果枸杞種質的多樣性,對于青海省黑果枸杞產業的健康可持續發展,食品的合理加工和利用等均具有重要意義。