基于低場核磁共振技術進行黃酒發酵進程監測及品牌的分析

王欣,鄭思宇,馮龍斐,劉敏,劉寶林

(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海,200093)

黃酒,是以稻米、黍米、小米等淀粉含量高、蛋白質含量較低的谷物為主要原料,經加曲或部分酶制劑、酵母等糖化發酵劑釀造而成的發酵酒(GB/T 13662—2018《黃酒》),其發酵過程中產生的香氣主要是由酒曲和釀酒環境中的各種微生物產生的[1]。黃酒發酵過程中會產生不同數量的高級醇、脂肪酸、醛、脂類等[2],并且伴隨著水自締合、與醇締合及與其他代謝產物的交叉締合的復雜氫鍵締合作用[3]。其中在發酵過程中醇、水氫鍵締合的團簇結構變化與酒的刺激和醇厚感緊密相關,對發酵酒的最終風味有重要影響[4]。因此,黃酒釀造中發酵過程的監測顯得尤為重要。

在對黃酒發酵過程監測研究方面,PENG等[5]采用GC-MS技術比較了黃酒在后發酵過程中代謝產物的差異,發現不同發酵工藝過程對黃酒風味有重要影響。陳青柳等[6]應用HPLC和GC-MS聯用對黃酒中的風味物質進行了動態監測。孫樂平等[7]通過頂空固相微萃取和氣相色譜質譜法定量分析了燕麥黃酒發酵過程中高等醇類的變化,并與發酵過程中微生物群落變化進行了關聯。這些方法具有高通量、高精度等優勢,然而往往需要復雜的分析步驟,抑或是成本較高,在實際生產監測中的應用受到一定的限制。

作為一種快速分析和非破壞性的技術,低場核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)在研究復雜基質中的水和脂類方面有一定優勢,可以根據氫質子在基質中的流動性來區分和描述質子群。目前LF-NMR技術已在部分發酵食品的品質分析中有一定應用[8],如糯米[9]、發酵香腸[10]、納豆[11]等食品的監測。雖然已有對葡萄酒T2弛豫特性的研究報道[12],但應用低場核磁共振技術對黃酒的研究還相對較少。因此,本文對黃酒釀造過程中5個關鍵工藝階段的樣品進行了分析,在比較了不同酒精度、陳釀時間和品牌的黃酒的LF-NMR弛豫特性的基礎上進行了主成分分析,以探究LF-NMR在監測黃酒發酵過程和辨別不同黃酒類別的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同發酵階段(浸米、第一次發酵、第二次發酵、煎酒及3年陳釀)的黃酒樣品由黃酒生產企業提供;18個市售黃酒樣品(A～I)均為經檢驗后的市場抽樣產品,樣品真實有效;去離子水由實驗室自制。

1.2 儀器與設備

LF-NMR核磁共振分析儀(PQ001,磁場強度(0.5±0.08) T,共振頻率21.3 MHz,配套T-Invfit反演擬合軟件和Φ15 mm核磁試管),上海紐邁電子科技有限公司;HH·S21恒溫水浴鍋,上海博訊實業有限公司。

1.3 實驗方法

以去離子水為對照,對經過浸米、第一次發酵(發酵1)、第二次發酵(發酵2)、煎酒的樣品和3年陳釀的黃酒進行LF-NMR弛豫特性分析;以B品牌酒精度分別12%vol、13%vol和14%vol的8年陳釀黃酒為對象,比較酒精度對LF-NMR弛豫特性的影響;選取品牌B及H(酒精度14%vol,陳釀時間5、8年),品牌F(酒精度15%vol,陳釀時間6、8年)的黃酒,研究陳釀時間對LF-NMR弛豫特性的影響;對品牌C和I(3年陳,13%vol)、品牌B和H(5年陳,14%vol;8年陳,13%vol;8年陳,14%vol)的黃酒LF-NMR弛豫特性進行比較。最后對9個品牌18個黃酒樣品進行主成分分析,黃酒樣品信息見表1。

表1 黃酒樣品信息Table 1 Information of Huangjiu samples

取3 mL樣品于核磁管中,32 ℃水浴10 min后置于核磁探頭中穩定1 min,選擇CPMG序列,檢測參數為：采樣頻率(sampling frequency,SW)為250.0 kHz、重復采樣等待時間(time of repetition,TR)為20 000 ms、重復掃描次數(number of repeat scans,NS)為4次、半回波時間(τ)為500 μs、回波個數(echo count,EC)為16 000個、采樣點數(sampling number,TD)為4 000 126個(當SW、τ、EC三者確定后,此值可自動確定)。檢測時室溫：23.7 ℃、濕度：50%。應用T-invfit軟件進行單/多組分反演擬合,可得到樣品的單組分弛豫時間(T2W),多組分弛豫時間T2i(i=1,2…)、信號幅值及峰面積比例S2i(i=1,2…)等核磁信息。

樣品設置3個平行及3次重復,以確保結果的可靠性。

1.4 數據分析處理

應用SPSS 23.0軟件對反演擬合獲得的5個變量(T2 W、T21、T22、S21、S22)數據進行數據處理和主成分分析(principal component analysis,PCA)。使用ANOVA方差分析和Duncan事后檢驗,P<0.05時為顯著性差異。應用Origin 9.0軟件對數據進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同釀造階段樣品的LF-NMR弛豫特性

2.1.1 單組分弛豫(T2W)特性

T2W可以反映樣品在發酵過程中弛豫特性的整體變化,不同釀造階段黃酒樣品的單組分弛豫時間(T2W)結果如圖1所示。

圖1 不同釀造階段樣品的單組分弛豫時間(T2W)

圖1表明,與去離子水的T2W(2 825 ms)相比,浸米階段樣品的T2W顯著降低1 176 ms(P<0.05),這是由于浸入米料后,體系中含有了豐富的氨基酸和其他有機物質,增加了體系中氨基酸態氮、酯類物質與有機酸的含量[13]。第一次發酵后樣品的T2W進一步從1 649 ms顯著縮短至273 ms,說明發酵過程中產生的醇、氨基酸等物質使樣品中氫質子的束縛力相對增強[14]。經過第二次發酵及煎酒后的樣品的T2W無顯著變化,而經過3年陳釀后樣品的T2W又顯著長于煎酒后的樣品,說明新釀制黃酒體系不夠穩定,陳釀過程中隨酸與醇酯化反應的進行,黃酒的酒精度降低,而揮發酯含量增加,總體表現為體系中氫質子的束縛力相對減弱。根據LI等[15]對黃酒發酵過程的研究,陳釀可賦予黃酒和諧宜人的香味,在此過程中體系中的氫鍵締合作用也發生了改變。

2.1.2 多組分弛豫(T2)特性

不同釀造階段的黃酒樣品的多組分弛豫(T2)圖譜如圖2所示。將位于100～1 000 ms的弛豫峰命名為T21峰,大于1 000 ms的弛豫峰命名為T22峰,將其多組分弛豫時間(T21,T22)及峰面積比例(S21,S22)的變化情況列于表2。

a-各階段的總體情況;b-去離子水和浸米的樣品;c-浸米和發酵1的樣品;d-發酵1和發酵2的樣品;e-發酵2和煎酒的樣品;f-煎酒和3年陳黃酒的樣品圖2 不同釀造階段樣品的多組分弛豫圖譜(T2)

表2 黃酒發酵過程中的多組分弛豫信息Table 2 The multi-component relaxation characteristics of Huangjiu

由圖2-a可知,發酵過程中樣品的T2多組分弛豫圖譜變化明顯。為了更清晰地分析,對相鄰2個發酵階段的T2多組分弛豫圖譜進行對比,結果如圖2-b～圖2-f所示。

圖2-b表明,雖然浸米后樣品與去離子水的多組分弛豫圖譜都表現為一個弛豫峰,且峰形類似,但浸米后樣品的弛豫時間更短,由2 009 ms縮短到1 221 ms(表2)。這是由于加米浸泡后體系中含有豐富的營養物質[16],如有機酸、氨基酸、蛋白質、淀粉、糖和維生素等,這些都會增強對樣品中水分子的束縛作用,影響到水的氫鍵締合[17],體系的布朗運動相對減弱,氫質子的弛豫加快,使其弛豫時間縮短。

由圖2-c可知,與浸米階段的樣品相比,經過第一次發酵后的樣品的T2多組分弛豫特性發生了顯著改變,表現為峰數量的增加和信號幅值的相對降低,該階段樣品呈現2個弛豫峰,其中,新增的弛豫峰位于132 ms處(表2),且所占峰面積比例達到了86.2%,說明該部分氫質子是體系中主要的組成部分,T22峰的弛豫時間也縮短至1 386 ms,S22僅為13.8%。YANG等[18]的研究表明,經過第一次發酵后體系中會形成多種醇類、醛類、酸類、酯類等物質,體系變得更加復雜且會對體系中氫鍵的締合產生影響,這與弛豫峰的增加密切相關。

由圖2-d可知,與第一次發酵的樣品相比,經第二次發酵后的樣品也表現為兩個弛豫峰,峰形類似,信號幅值略有降低;但弛豫峰相對左移,弛豫時間從132 ms縮短至126 ms(表2),但該峰面積比例幾乎無變化(86.3%),T22峰進一步縮短至1 317 ms。經第二次發酵后體系中的醇、酸、酚、酯等物質的種類和含量均相對增加[19],從而使樣品中氫質子所受束縛作用增強、弛豫加快。

圖2-e中,與第二次發酵相比,煎酒后的樣品亦呈現兩個弛豫峰,但其分布進一步左移,弛豫時間分別縮短至114 ms和1 232 ms,S21略有減小(85.1%)。這可能是由于煎酒的溫度為(90±1) ℃,相對高的溫度促進體系中物質的溶解和轉變,使物質間的氫鍵締合作用進一步增強[16],體系中氫質子所受束縛作用進一步增強,表現為弛豫時間的縮短。

由圖2-f可知,與煎酒后的樣品相比,經過3年陳釀的黃酒的多組分弛豫仍為2個弛豫峰,但其分布相對右移,弛豫時間相對延長至242 ms和1 908 ms,S21有明顯增加(92.4%)。這是由于陳釀貯存期間,微生物作用和化學反應仍在緩慢進行,醇類、酸類、酚類、酯類等物質的含量會發生變化,風味特征得到增強,這也會導致陳釀時的氫鍵締合不同于釀造過程中的氫鍵締合[20]。隨陳釀時間的延長,醇類及易揮發的一些物質的含量相對減少。這使樣品中氫質子所受束縛作用相對減弱,弛豫時間延長。

2.2 不同酒精度黃酒的LF-NMR弛豫特性

同一品牌不同酒精度的黃酒樣品的LF-NMR弛豫特性如圖4所示。

由圖3-a可知,隨酒精度從12%vol增加至14%vol,黃酒的T2W從376 ms縮短至307 ms(P<0.05)。圖3-b中,隨酒精度的增加,樣品的弛豫分布左移,T21和T22均相對縮短。酒精度的增加意味著體系中乙醇分子的增多,這會使氫質子在溶液中的運動受限[21]。劉敏等[22]的研究亦發現,水-乙醇體系中乙醇濃度的增加會加快氫質子的弛豫。KIRSCHNER等[23]的研究發現,乙醇摩爾分數的增加會使體系中分子的表面密度增加,氫鍵締合更加緊密。因此,同一品牌和陳釀時間下,隨酒精度的增加,樣品的T2 W、T21和T22均相對縮短。

a-單組分弛豫時間;b-多組分弛豫分布圖3 不同酒精度黃酒的單組分弛豫時間和多組分弛豫分布

2.3 不同陳釀時間黃酒的LF-NMR弛豫特性

同一品牌不同陳釀時間的黃酒樣品的LF-NMR弛豫特性比較如表3所示。

表3 不同陳釀時間黃酒的LF-NMR弛豫特性Table 3 LF-NMR relaxation characteristics of Huangjiu after different aging years

由表3可知,陳釀時間對黃酒的T2弛豫特性的影響較小。同一品牌的黃酒,當酒精度相同時,陳釀年份較長的黃酒表現出較大的T21,而T22、S21和S22的變化不大。這可能是由于,隨著陳釀時間的增加,黃酒中發生了包括氧化、酯化、水解和揮發等物理化學反應,使酒的陳香增加[15],但由于乙醇濃度對體系中醇水締合作用的影響更為明顯,本部分中酒精度相同,故整體上表現為對體系中氫質子的自由度影響較小,僅T21相對延長。

2.4 不同品牌黃酒的LF-NMR弛豫特性

4組不同品牌,同一酒精度、陳釀時間的黃酒樣品的LF-NMR弛豫特性比較結果如圖4所示。

a-3年陳,13%vol;b-5年陳,14%vol;c-8年陳,13%vol;d-8年陳,14%vol圖4 不同品牌黃酒的多組分弛豫分布(T2)

由圖4-a～圖4-d可知,黃酒的多組分弛豫分布峰形相似,但不同品牌間有所區分。在同一酒精度和陳釀時間下,如圖4-a,品牌I和C均為加飯酒,但產地不同,品牌I的弛豫分布較品牌C右移。而圖4-b～圖4-d中,品牌B和H的黃酒類型及產地均不同,即使酒精度和陳釀時間相同,品牌B的弛豫分布均較H左移。這一對比說明,對于同一酒精度和陳釀時間的黃酒,不同品牌黃酒釀造工藝的區別也會使其LF-NMR弛豫特性有所差異。

2.5 不同品牌黃酒的主成分分析

對9個品牌18個黃酒樣品共54個樣本的LF-NMR弛豫信息進行標準化及主成分分析,提取主成分1(PC1)和主成分2(PC2),主成分表達式分別如下,累計貢獻值達到96%,即2個主成分保留了96%的原始數據信息,能很好的反映所有變量的原有信息[24],主成分分析結果如圖5所示。

圖5 不同品牌黃酒的PC1和PC2得分圖

F1=0.39T21+0.56S21- 0.48T22-0.55S22

F2=0.60T21-0.43S21+0.51T22+0.44S22

由圖5可知,不同品牌黃酒的分布有明顯區別。這是由于不同品牌黃酒所選用的原料、釀造工藝和黃酒類型有一定的區別[2],這都會對樣品的弛豫特性產生影響,從而反映為在主成分分布圖的區別。A、C、D、E、G品牌的黃酒樣品具有相同的酒精度及陳釀時間,故分布相對集中,而B品牌中,酒精度及陳釀時間都有一定變化,故PCA分布上也有一定區分,8年陳12%vol的黃酒分布于第四象限,其余樣品均分布于第三象限,但總體與其他品牌可區分;F品牌的2個陳釀時間的黃酒則位于第二象限,陳釀時間上亦可區分;類似的,H品牌則均分布于圖第一象限;I品牌的分布位于圖的右上方,其中8年陳14%vol的黃酒由于和H品牌酒精度相同,產地均為上海且兩者陳釀時間相近,因此分布較為接近。這說明基于黃酒的LF-NMR弛豫特性和PCA分析可以區分來源于不同生產企業的黃酒產品,且酒精度及陳釀時間也會影響其分布。

3 結論

本文重點探索了基于低場核磁共振技術進行黃酒發酵進程監測及品牌區分的可行性。研究發現,黃酒釀造過程中樣品的LF-NMR特性有明顯改變。發酵使黃酒的單組分弛豫時間(T2W)顯著縮短,而陳釀則會使T2W稍有延長。發酵后樣品的T2圖譜均呈典型雙峰特征,且在發酵過程中弛豫時間相對縮短,陳釀過程會使弛豫時間相對延長。同一品牌及陳釀時間的黃酒,酒精度越高,體系的單組分及多組分時間均越小;陳釀時間對弛豫特性影響較小,同一品牌及酒精度下,陳釀時間僅對T21有一定影響。不同品牌黃酒因釀造工藝的區別而使弛豫分布有一定特點。通過主成分分析可以挖掘黃酒的LF-NMR弛豫信息,實現對不同工藝生產的各品牌黃酒的快速辨別。研究也為后期LF-NMR技術在食品發酵領域的應用提供了一定參考。