基于普魯士藍納米粒子的免疫層析法檢測小麥中的嘔吐毒素

章銅,沈央紅,張雯,朱軍莉*,陸海霞*,劉興泉

1(浙江工商大學 食品與生物工程學院,浙江省食品安全重點實驗室,浙江 杭州,310018) 2(浙江農林大學 食品與健康學院,浙江 杭州,311300)

嘔吐毒素(deoxynivalenol,DON),即脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物,人和動物誤食被該毒素污染的糧谷類后會產生各種急慢性中毒反應[1]。近年來發現嘔吐毒素可能與人類食管癌和腎病有關,已被國際癌癥研究機構列為第三類致癌物[2],引起了各國的普遍重視,世界上超過37個國家和組織制定了谷物中DON的限量標準,我國GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌霉素限量》規定谷物及其制品(玉米、小麥、小麥制品)中嘔吐毒素含量不超過1 000 μg/kg[3]。盡管已有高靈敏度檢測DON的方法,如高效液相色譜法[4]和氣相色譜法[5],但是這些方法存在儀器昂貴、操作繁瑣、耗時長且要求專業人員操作等限制,因此開發一種高靈敏度、低成本的DON快速、現場檢測方法具有重大意義。

側向流免疫檢測法(lateral flow immunoassay,LFIA)又稱免疫層析檢測法(immunochromatographic assay,ICA)[6],具有成本低、檢測快、分析過程簡便等獨特優勢,已作為一種有效的現場分析方法廣泛應用于不同領域。LFIA的靈敏度受到多方面的影響,其中抗體標記量以及信號標簽的影響最為顯著[7-10]。因此,抗體標記量優化后提高檢測性能最有效的方法是尋找理想的標記材料,不僅可以用較少數量的標記抗體顯示出強信號,同時也不需要復雜的合成過程。

普魯士藍納米粒子(Prussian blue nanoparticles,PBNPs),通式為Fe4[Fe(CN)6]3nH2O,由于其尺寸可控、環境友好、成本低和易于合成等特性而日益受到關注[11-12]。其具有優異的物理化學功能,用于電化學免疫傳感器[13]和催化比色檢測[14]等食品分析方法中。并且,PBNPs具有獨特的立方體結構,尺寸從幾納米到幾百納米不等,由于大尺寸PBNPs的參與,即使只有少數抗體分子被標記在每個PBNP上,在LFIA中也會看到明顯的色帶,成為硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC)上的明亮信號標記物。ZHAO等[15]將PBNPs作為信號標簽應用于免疫層析試紙條中檢測鹽酸克倫特羅,發現比膠體金所需要的抗體標記量更少,靈敏度更高。LU等[16]在磁性納米顆粒上原位生成PBNPs結合納米酶聯免疫吸附試驗檢測黃曲霉毒素B1,實現超靈敏熒光檢測,比光熱分析和比色分析的靈敏度分別提高6 333倍和28倍。聚多巴胺(polydopamine,PDA)是一種新興的仿生黏附聚合物,具有制備工藝簡單、生物相容性好、黏附性強、易功能化等特性而受到廣泛關注。利用PDA結構中的類兒茶酚胺基團,PDA可以很容易地通過靜電相互作用或共價鍵附著在納米粒子表面,常被用于表面修飾。YE等[17]和XU等[18]用PDA包裹AuNPs形成AuNP@PDA,均提高了對檢測物的靈敏度。

目前谷物和飼料中嘔吐毒素等真菌毒素污染仍較嚴重,有效控制DON危害的前提是能快速、準確地檢測該毒素。鑒于此,本研究通過合成PBNPs和聚多巴胺包裹普魯士藍納米粒子(polydopamine coated Prussian blue nanoparticles,PB@PDA),并以其作為信號標簽建立了一種信號放大的免疫層析模型,優化和比較2種標記物的檢測結果,評價了PBNPs和PB@PDA標記的LFIA對小麥樣品中嘔吐毒素的快速檢測性能。

1 材料與方法

1.1 試劑

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP K30,優級純)、鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6,純度99.0%]、鹽酸多巴胺(dopamine hydrochloride,純度98.0%),上海麥克林生化有限公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,優級純)、吐溫20(Tween-20,純度99.0%),上海國藥集團化學試劑有限公司;DON-BSA抗原、DON單克隆抗體(DON-mAb)、羊抗鼠IgG,北京厚生正德科技有限公司;黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)、黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)、DON、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、赭曲霉毒素(ochratoxinA,OTA)、T-2標準品,青島普瑞邦生物工程有限公司;嘔吐毒素膠體金試紙條,深圳芬德生物技術有限公司。本實驗所用試劑未經說明者均為優級純,所用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

TGL-15B高速冷凍離心機,上海安亭科學儀器公司;Mastersizer 3000激光粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司;KQ3200超聲波清洗機,昆山市超聲儀器有限公司;RO-MB-T臺式超純水器,杭州永杰達凈化科技有限公司;HGS510臺式劃膜噴金標機,杭州峰航科技有限公司;ZNCL-GS磁力攪拌器,河南愛博特科技發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PBNPs和PB@PDA的制備

PBNPs合成方法參考文獻[15],在磁力攪拌下將PVP K30 (6 g)和K3[Fe(CN)6] (264 mg)加到80 mL HCl溶液(0.01 mol/L)中。攪拌溶解后,將混合物放入80 ℃真空干燥箱中加熱20 h。室溫冷卻后離心收集沉淀物,并用乙醇和超純水洗滌數次。最后在60 ℃烘箱中干燥24 h后獲得PBNPs,4 ℃保存備用。

參照文獻[19]方法合成PB@PDA,取10 mL (1 mg/mL)普魯士藍溶液添加到含有1 mg/mL的鹽酸多巴胺(pH 8.5)的Tris溶液中,超聲反應20 min,邊攪拌邊用碳酸鉀調節pH,反應6 h后所得溶液在10 000 r/min離心25 min,沉淀物重懸在2 mL超純水中,所得溶液即為PB@PDA溶液。

1.3.2 PB-mAb和PB@PDA-mAb的制備

兩者都是采用經典的靜電吸附方法將嘔吐毒素單克隆抗體連接在顆粒表面。以PB@PDA為例：取1 mL制備的PB@PDA置于蒸餾水中,超聲并渦旋后加入DON的抗體溶液,渦旋混合;在室溫下孵育1 h后,加入200 μL BSA(0.1 g/mL)溶液并再反應1 h以封閉顆粒表面多余的結合位點;將該混合物置于10 000 r/min離心25 min以除去未結合的抗體和 BSA,重復一次后,將PB@PDA-mAb 探針沉淀物重懸在100 μL PBS中,在 4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3 表征方法

為觀察PBNPs和PB@PDA形貌特征,采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)進行觀察。通過X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)表征來獲得PBNPs和PB@PDA的相對純度,結果與標準卡片進行比較。為驗證抗體是否成功結合到材料上,通過Zeta電位分析儀和紫外掃描光譜進行表征,來觀察材料和探針之間的電勢和吸收峰是否有變化。

1.3.4 免疫層析試紙條的組裝及封閉液的選擇

試紙條由吸收墊、NC膜、結合墊和樣品墊四部分組成(圖1-a)。將質量濃度總共1 mg/mL的DON Ag (DON-BSA生物綴合物)和0.5 mg/mL的山羊抗小鼠IgG沉積在NC膜上,分別以0.8 μL/cm的分配速率形成T線和C線(約4 mm距離)。然后,將處理過的膜在室溫下干燥2 h。樣品結合墊浸泡在封閉緩沖液(含2%(體積分數)BSA的0.01 mol/L PBS)中,37 ℃干燥過夜后,吸收墊按原樣使用。將樣品墊、NC膜、吸水墊依次搭粘到襯板上進行組裝。最后,用切條機切成3 mm寬的試紙條,并貯存在干燥器中備用。

a-聚多巴胺包裹普魯士藍形成原理;b-免疫層析試紙條的檢測原理圖1 基于PB@PDA免疫層析試紙條競爭檢測DON

以DON-BSA偶聯物和PBNPs探針分別作為捕獲試劑和檢測試劑。樣品墊用不同的封閉緩沖液處理,37 ℃干燥過夜后,組裝試紙條。將試紙條插入到含有等量PBNPs探針的100 μL PBS 溶液中,15 min 后觀察顯色結果,確定最優封閉液組成。

1.3.5 待測和加標樣品的制備

DON標準溶液用0.01 mol/L PBS (pH 7.4)緩沖液中稀釋至一系列不同濃度。將100 μL指定濃度的DON標準溶液與2 μL PB-mAb和2 μL PB@PDA-mAb探針滴加到試紙條上用于檢測。同時,選擇PBS (pH 7.4)作為空白對照。反應15 min后觀察T線和C線測試結果(圖1-b)。當存在較高濃度的DON 時,形成 PB@PDA-mAb-DON,T 線無色,C 線有色;在沒有DON的情況下,T線和C線都顯色。DON的濃度可用Image J判斷,T 線的顏色強度隨著DON的濃度升高而減弱。

為驗證試紙條實用性,購買了市售小麥樣本,所選小麥樣本均為DON陰性。稱取5.0 g碾碎的小麥樣品,向其中加入 DON 標準品分別獲得 0.25～100 ng/g和0.1～100 ng/g的最終濃度,根據文獻[20]進行預處理,具體步驟如下：取上述加標樣品1 g置于10 mL離心管中,用3 mL 60%(體積分數)的甲醇水溶液進行提取。然后將混合物振蕩混勻5 min,于8 000 r/min離心10 min。收集上清液用0.01 mol/L PBS稀釋5倍后,用制備的試紙條進行樣品分析,重復3遍,結果與市場上現有的膠體金試紙條相比較。

1.4 數據處理

每組樣品均設置3個平行,采用 Adobe Illustrator作圖并分析,通過 SPSS Statistics 26進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 表征結果

用TEM觀察合成的PBNPs和PB@PDA形貌(圖2),如圖2-a和圖2-e所示,PBNPs和PB@PDA粒徑均一,PBNPs的平均粒徑在100 nm左右,而PB@PDA的平均粒徑穩定在130 nm左右,且分散性良好。如圖2-b和圖2-f所示,對比普魯士藍標準卡片(JCPDS No.73—0687)可以看出2種納米材料的 XRD 吸收峰位置和強度與標準卡片一致,可以得出納米材料為純度較高的普魯士藍納米顆粒,而聚多巴胺包裹的普魯士藍納米粒子雖然吸收峰與普魯士藍一致,其吸收峰強度明顯比普魯士藍高,與其包裹一層多巴胺有關。進一步比較2種離子PBNPs、PB@PDA以及連接抗體PB-mAb、PB@PDA-mAb后的 Zeta電位(圖2-c和圖2-g),PBNPs溶液的電位值為-24.9 mV,而連接抗體后的電位值為-19.8 mV,表明添加帶有正電的嘔吐毒素單克隆抗體后,抗體與帶有負電荷的 PBNPs發生靜電吸附,使其電位值發生變化,提示抗體與PBNPs成功結合, PB@PDA表現相似的現象。如圖2-d和圖2-h所示,PBNPs和PB-mAb在400～800 nm波長的紫外掃描光譜中均出現了強烈吸收峰,在標記完抗體后都發生了吸收峰的偏移,而PB@PDA和PB@PDA-mAb紫外峰完全不一樣,這可能是因為包裹在普魯士藍表面的聚多巴胺外殼改變了吸收波長和吸光強度導致的。

a-PBNPs TEM表征圖;b-PBNPS的XRD圖;c-PBNPs Zeta電位;d-PBNPs紫外掃描光譜;e-PB@PDA TEM電鏡圖;f-PB@PDA的XRD圖;g-PB@PDA Zeta電位;h-PB@PDA紫外掃描光譜圖2 PBNPs和PB@PDA的表征圖

2.2 樣品墊封閉液組成的優化

用5種不同的封閉液對樣品墊浸泡處理,其中稀釋液均為 PBS 溶液(0.01 mol/L,pH 7.4),之后組裝試紙條并進行空白樣品檢測,結果如表1所示?？梢钥吹綐悠穳|封閉液2% BSA+0.05%吐溫+1% PVP可以使試紙條的T線和C線顯色效果最好。

表1 樣品墊的最佳封閉液選擇Table 1 Selection of the best sealing solution for the sample pad

2.3 反應條件的優化

2.3.1 抗體標記量的影響

如圖3-a所示,兩者都會隨著抗體標記量的增加顏色發生改變,當PBNPs-mAb在抗體標記量達到12 μg時T線強度最佳,PB@PDA在抗體標記量為9 μg時T線強度最佳。在基于競爭檢測原理的免疫層析試紙條中,當 T 線與 C 線明顯時,抗體的用量越少,T 線上包被的抗原與待檢測物質競爭越激烈,試紙條的檢測靈敏度就越高。此外,抗體的用量減少還可以大大降低免疫層析檢測成本。因此,選用 12 μg 嘔吐毒素單克隆抗體作為 1 mL PBNPs-mAb中抗體的最終標記量,選用9 μg嘔吐毒素單克隆抗體作為 1 mL PB@PDA的最終標記量。

a-2種試紙條抗體標記量的優化;b-2種試紙條探針用量的優化;c-2種試紙條pH的優化圖3 兩種試紙條帶的3種參數優化結果

2.3.2 探針用量的影響

在測試溶液中添加2種探針量也影響試紙條的靈敏度和信號強度。如圖3-b所示,當PBNP-mAb和 PB@PDA-mAb 探針體積從 1 μL 增加至 2 μL時,試紙條 T 線與 C 線的顏色強度逐漸加深,當探針濃度為 2、2.5、3 μL時,T 線與 C 線的顏色強度幾乎保持一致。基于最少探針量獲得最佳信號響應的原則,選用2 μL PBNPs和PB@PDA-mAb 作為該試紙條中最優探針添加量。

2.3.3 pH的影響

試紙條的檢測線和質控線強度在一定程度上取決于探針溶液中pH的大小,如圖3-c所示,當探針溶液的pH從酸性變為中性時試紙條T 線與 C 線的顏色強度逐漸增高,而當pH由中性逐漸變為酸性時T線與 C 線的顏色強度會逐漸降低。當pH值達到7時2種條帶顏色都達到最高強度。這可能是因為在酸性條件下探針粒子聚集成團塊導致在結合墊前造成了太多滯留使得聚集在檢測區的探針數量變少,從而導致顏色強度變低[21]。而在堿性條件下普魯士藍納米粒子的分解導致顏色褪色,從而降低 T線與 C線的顏色強度。

2.4 試紙條的靈敏度分析

在最優檢測條件下,通過檢測不同濃度的DON標準溶液來確定2種免疫層析試紙條對DON的檢測靈敏度。如圖4所示,隨著檢測樣品中DON的濃度逐漸增加,PBNPs免疫層析試紙條T線上顏色條帶也逐漸減弱。當DON質量濃度達到1 ng/mL時,T線上顏色明顯淺于陰性對照的T線顏色,而DON質量濃度達到7 ng/mL時,T線顏色完全消失。而PB@PDA的試紙條在DON質量濃度達到0.2 ng/mL時T線上顏色明顯淺于陰性對照的T線顏色,當DON質量濃度達到1 ng/mL時,T線顏色完全消失。因此,基于PBNPs的免疫層析試紙條對DON的可視化檢出限和消線質量濃度分別為1 ng/mL和7 ng/mL。PB@PDA免疫層析試紙條對DON的可視化檢出限和消線質量濃度分別為0.2 ng/mL和1 ng/mL。

a-PB-LFIA檢測嘔吐毒素靈敏度結果;b-PB-LFIA對嘔吐毒素的線性方程分析;c-PB@PDA-LFIA檢測嘔吐毒素靈敏度結果;d-PB@PDA-LFIA對嘔吐毒素的線性方程分析圖4 PBNPs和PB@PDA的檢測靈敏度評估結果

此外,采用Image J軟件分析計算T線條帶的強度值,并分析其與DON濃度的關系。由圖4-b顯示,T線強度值與DON濃度呈負相關,并且DON質量濃度為0.5～3.0 ng/mL時,T線強度值與DON質量濃度呈現出良好的線性關系,相關系數R2為0.992。而PB@PDA的試紙條的檢出限和消線質量濃度分別為0.2 ng/mL和1 ng/mL(圖4-d),比PBNPs試紙條靈敏度提高了5倍,此外,PB@PDA在DON質量濃度為0.1～0.5 ng/mL時呈現出良好的線性關系,相關系數R2為0.990。

2.5 試紙條的特異性

選取 FB1、AFB1、OTA、T-2和 ZEN 5 種常見的真菌毒素進行特異性實驗,質量濃度均為 10 ng/mL。肉眼觀察后結合 Image J 軟件分析檢測線的強度值。如圖5所示,含有FB1、AFB1、OTA、T-2、ZEN的檢測試紙條均在T線上顯示清晰的顏色,只有樣品中含有DON時,在試紙條T線處觀察不到明顯的顏色,表明2種方法的特異性良好,不受其他真菌毒素干擾。

a-2種試紙條檢測特異性結果;b-2種試紙條特異性結果分析圖圖5 基于PBNPs和PB@PDA的免疫層析試紙條的特異性檢測結果

2.6 實際樣品中的應用

為驗證該方法的實用性,將不同濃度DON添加到小麥中進行檢測。如圖6-a所示,PB-LFIA對小麥DON的視覺檢出限和消線濃度分別為20、60 ng/g,而PB@PDA-LFIA對小麥DON的視覺檢測限和消線濃度分別為5 ng/g和20 ng/g(圖6-b)。進一步與商品化膠體金檢測試紙條比較,如圖6-c可以發現膠體金的視覺檢測限和消線濃度分別為10 ng/g和50 ng/g,略高于PBNPs的靈敏度,但低于PB@PDA的靈敏度,3種試紙條的檢測限均低于我國對小麥中DON殘留限量1 000 μg/kg。PB@PDA-LDFIA與膠體金免疫層析法相比優點有：a)普魯士藍和鹽酸多巴胺等材料價格低廉,合成只需簡單的離心便可獲得,制備過程省時省力;b)PBNPs穩定性良好,具有更好的應用前景;c)PBNPs能夠實現量產化,能夠減少工藝損耗和生產時間。

a-PB-LFIA對小麥樣品中嘔吐毒素的檢測;b-PB@PDA-LFIA對小麥樣品中嘔吐毒素的檢測;c-膠體金對小麥樣品中嘔吐毒素的檢測圖6 三種免疫層析法對小麥樣品中嘔吐毒素的檢測

3 結論

本文以 PB@PDA為標記物,通過競爭抑制模式建立了一種新型的 PB@PDA -LFIA,實現了對小麥中DON 的快速靈敏檢測。與傳統的PBNPs相比,合成的 PB@PDA 顏色亮度更強,消線效果更好,顯著提高免疫層析的靈敏度。在最優參數下,對 DON 檢測的定性裸眼判斷閾值為 1.0 ng/mL,定量檢測限為 0.2 ng/mL。對小麥樣品的定量檢測限為5 ng/g。相比于商品化的膠體金和PB-LFIA,PB@PDA檢測靈敏度更高,對食品基質有良好的抗干擾性,為快速、靈敏地檢測農產品和食品中的真菌毒素提供了良好的應用前景。