酵母表面展示技術(shù)在食品發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展

李悅,姬翔,李顏,井蕾,牛明福,李陽,2*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽,471000) 2(食品微生物河南省工程技術(shù)研究中心,河南 洛陽,471000)

微生物細(xì)胞表面不僅是胞內(nèi)物質(zhì)與胞外環(huán)境之間的邊界,也是胞內(nèi)與胞外通信、分子識別及交換場所[1]。因此,細(xì)胞表面工程是微生物學(xué)研究與應(yīng)用中最具吸引力的領(lǐng)域之一。1985年,SMITH最先報(bào)道將外源DNA片段插入到絲狀噬菌體基因Ⅲ中,表達(dá)的融合蛋白被展示在病毒顆粒表面,而不影響噬菌體的感染能力,由此開啟了表面展示技術(shù)的發(fā)展[2]。表面展示技術(shù)可以將靶蛋白直接或間接地定向表達(dá)于微生物表面,展示的靶蛋白仍具備相對獨(dú)立的生物活性和空間構(gòu)型,被廣泛用于疫苗和抗體開發(fā)、蛋白定向進(jìn)化、生物傳感器、生物吸附、生物轉(zhuǎn)化、全細(xì)胞催化劑制備等方面[3]。

目前,病毒、細(xì)菌、酵母菌以及絲狀真菌等微生物表面展示系統(tǒng)相繼建立和發(fā)展。由于病毒和原核細(xì)胞展示系統(tǒng)缺乏蛋白質(zhì)翻譯后的加工機(jī)制,部分細(xì)菌和絲狀真菌會產(chǎn)生內(nèi)毒素等[4],限制了以上種類的表面展示技術(shù)在其食品和藥品等領(lǐng)域中的應(yīng)用。酵母菌作為單細(xì)胞真核宿主,易于進(jìn)行遺傳學(xué)操作,能夠?qū)崿F(xiàn)重組蛋白正確折疊和糖基化等翻譯后修飾,可以利用廉價(jià)底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化和高密度培養(yǎng)。通過酵母表面展示技術(shù)能將功能酶錨定表達(dá)在酵母細(xì)胞表面制備全細(xì)胞催化劑,無需額外的純化和固定化操作,且與游離酶相比具有更好的溫度、pH值和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性,可以重復(fù)循環(huán)利用[5]。因此,與其他微生物表面展示系統(tǒng)相比,酵母展示系統(tǒng)更適合在食品領(lǐng)域應(yīng)用。

本文對酵母表面展示技術(shù)的原理及其應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了概述,包括改善傳統(tǒng)發(fā)酵食品品質(zhì)、改進(jìn)發(fā)酵生產(chǎn)過程、發(fā)酵生產(chǎn)功能食品等方面;并展望了酵母表面展示技術(shù)的未來發(fā)展方向,以期為食品發(fā)酵技術(shù)革新和工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 酵母表面展示技術(shù)原理

酵母菌的細(xì)胞壁主要由甘露糖蛋白和β-葡聚糖組成,還含有少量幾丁質(zhì)。以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為例,細(xì)胞壁分為內(nèi)外2層(圖1)。內(nèi)層是由β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)構(gòu)成的骨架,提供細(xì)胞壁的強(qiáng)度,骨架的側(cè)鏈成分為β-1,6-葡聚糖。外層是刷狀的甘露糖蛋白層,甘露糖蛋白與大多數(shù)的細(xì)胞表面特性相關(guān)聯(lián)。甘露糖蛋白被高度糖基化,直接或間接與β-1,3-葡聚糖骨架相連[6](圖1)。

圖1 酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)示意圖

酵母表面展示系統(tǒng)的三要素是宿主、錨定蛋白和靶蛋白。位于酵母細(xì)胞表面的細(xì)胞壁蛋白或細(xì)胞膜蛋白是酵母表面展示系統(tǒng)的備選錨定蛋白。錨定蛋白通常含有信號肽和錨定結(jié)構(gòu)域,靶蛋白與錨定蛋白“融合”表達(dá)后,信號肽將引導(dǎo)融合蛋白向細(xì)胞表面運(yùn)輸,錨定結(jié)構(gòu)域使融合蛋白固定在宿主細(xì)胞表面[7]。錨定蛋白的選擇對靶蛋白展示的成功率和效率起到關(guān)鍵作用。目前已被廣泛應(yīng)用的酵母表面展示錨定蛋白主要是三類細(xì)胞壁蛋白(圖2)。第一類錨定蛋白以非共價(jià)鍵與細(xì)胞壁結(jié)合,通過簡單的SDS抽提即可獲得,如具有絮凝功能的Flo1p等。由于Flo1p的錨定結(jié)構(gòu)域位于N端,靶蛋白的融合方式為C端融合。第二類錨定蛋白是通過糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)錨與細(xì)胞壁結(jié)合的GPI型蛋白,如Cwp1p、Cwp2p、Tip1p、Sed1p、α-凝集素等[8]。GPI型蛋白與β-1,6-葡聚糖側(cè)鏈連接,間接連接到β-1,3-葡聚糖骨架上,需經(jīng)過β-葡聚糖酶的消化才可獲得。GPI型蛋白的錨定結(jié)構(gòu)域在C端,靶蛋白的融合方式為N端融合。其中,由Aga1p和Aga2p組成的a-凝集素錨定系統(tǒng)比較特殊,Aga1p的C端具有GPI錨定結(jié)構(gòu)與細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合,Aga2p與Aga1p通過二硫鍵連接,靶蛋白與Aga2p的C端或N端融合展示在酵母細(xì)胞表面。第三類錨定蛋白為內(nèi)部重復(fù)蛋白(protein with internal repeats,PIR型蛋白),如Pir1p～Pir4p等。該類型蛋白與前2種錨定模式不同,其通過N端重復(fù)序列可以與細(xì)胞壁中的β-1,3-葡萄糖形成酯鍵連接,也可以利用C端半胱氨酸殘基通過二硫鍵附著在細(xì)胞壁的特定組分上,還可以同時(shí)利用2種錨定結(jié)構(gòu)域進(jìn)行插入型融合[9]。

圖2 常用錨定蛋白和錨定方式

2 酵母表面展示技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展

2.1 改善傳統(tǒng)發(fā)酵食品品質(zhì)

2.1.1 在葡萄酒釀造領(lǐng)域的應(yīng)用

葡萄酒的風(fēng)味前體物質(zhì)大多數(shù)以無氣味的糖苷形式存在,可被β-D-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)等糖苷酶水解后釋放香氣。在葡萄酒釀造過程中添加以上商業(yè)酶制劑或固定化酶可以對增進(jìn)葡萄酒的風(fēng)味,但成本較高,且穩(wěn)定性較差[10]。ZHANG等[11]將來源于黑曲霉(Aspergillusniger)的β-D-葡萄糖苷酶展示在釀酒酵母細(xì)胞表面,通過優(yōu)化載體、啟動子、錨定蛋白以及轉(zhuǎn)錄融合伴侶等策略實(shí)現(xiàn)了β-D-葡萄糖苷酶的高效穩(wěn)定展示。采用了3種錨定蛋白(Sag1p、Sed1p、Cwp2p)。其中Sag1p的錨定能力最強(qiáng),全細(xì)胞酶活力最高達(dá)到(74.58±5.88) U/g。重組全細(xì)胞酶對香氣糖苷的水解能力是商業(yè)酶制劑AR2000的2.1倍。同時(shí)探索了葡萄酒發(fā)酵環(huán)境因素對全細(xì)胞酶活力的影響。

葡萄酒中的有機(jī)酸會顯著影響口感,蘋果酸和酒石酸占葡萄酒總酸的70%～90%,降低蘋果酸的含量十分必要[12]。釀酒酵母缺乏轉(zhuǎn)化蘋果酸的酶系,需由乳酸菌主導(dǎo)進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程,將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸和二氧化碳[13]。ZHANG等[14]將來源于酒酒球菌(Oenococcusoeni)的蘋果酸乳酸酶(malolactic enzyme,MLE)在釀酒酵母細(xì)胞表面展示。錨定蛋白為α-凝集素的C端結(jié)構(gòu)域。所構(gòu)建的全細(xì)胞酶與蘋果酸反應(yīng)12 h后,可將21.11%的蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸,可用于在葡萄酒發(fā)酵過程中同時(shí)進(jìn)行乙醇發(fā)酵和蘋果酸轉(zhuǎn)化過程。

過量的銅離子會導(dǎo)致葡萄酒氧化褐變,也會影響釀酒酵母的活性。目前主要解決銅過量的方法是添加“下膠劑”去除。黃蓉等[15]將內(nèi)源金屬硫蛋白在釀酒酵母細(xì)胞表面展示,錨定蛋白選用C末端結(jié)合的絮凝蛋白Flo1p。構(gòu)建的二倍體展示菌株重金屬耐受性得到提高,可以作為吸附葡萄酒中銅離子的全細(xì)胞催化劑。

白葡萄酒中的非穩(wěn)定蛋白質(zhì)會發(fā)生沉淀現(xiàn)象,會影響其風(fēng)味和感官特性。黃蓉等[16]將來源于宇佐美曲霉(Aspergillususamii)的酸性蛋白酶展示在釀酒酵母細(xì)胞表面,選用Sed1p為錨定蛋白。分別構(gòu)建了單倍體和二倍體的重組菌株,最高酶活力達(dá)到495.24 U/mL。可作為改善白葡萄酒介質(zhì)低pH值條件下蛋白穩(wěn)定性的全細(xì)胞催化劑。

2.1.2 在啤酒發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用

在啤酒釀造過程中,異亮氨酸-纈氨酸途徑的中間體α-乙酰乳酸會被轉(zhuǎn)化成雙乙酰,當(dāng)雙乙酰含量超過0.15 mg/L時(shí),就會有類似餿飯的氣味,影響啤酒的風(fēng)味。所以,雙乙酰含量高低成為衡量啤酒質(zhì)量的重要標(biāo)志之一。研究發(fā)現(xiàn),在啤酒生產(chǎn)中添加α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactate decarboxylase,ALDC)可以將α-乙酰乳酸分解成3-羥基-2-丁酮和二氧化碳,有效地降低雙乙酰含量,縮短釀造周期進(jìn)而大幅降低生產(chǎn)成本[17]。然而,使用商業(yè)ALDC制劑將使該過程成本更高,且異源酶將留在啤酒中。CEJNAR等[18]選用α-凝集素的C末端結(jié)構(gòu)域作為錨定蛋白,將有紋膜醋酸菌(Acetobeαcerαceti)的ALDC展示到釀酒酵母表面,構(gòu)建了全細(xì)胞催化劑,能夠消除發(fā)酵麥芽汁中雙乙酰的積累,發(fā)酵7 d后,麥芽汁中幾乎不存在雙乙酰。

β-葡聚糖是啤酒發(fā)酵原料大麥和燕麥等的細(xì)胞壁主要成分之一。在釀造過程中,高濃度的β-葡聚糖會導(dǎo)致啤酒粘度高,形成凝膠狀沉淀,降低麥芽汁產(chǎn)量,影響啤酒的品質(zhì)。啤酒中與β-葡聚糖相關(guān)的問題可以通過在麥芽生產(chǎn)、發(fā)酵中添加商用β-1,3-1,4-葡聚糖酶來緩解[19]。GUO等[20]構(gòu)建了具有雙向啟動子的食品級表面展示系統(tǒng),將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因與α-凝集素錨定基因融合,在半乳糖激酶1(GAL1)啟動子的調(diào)控下表達(dá)融合基因。磷酸甘油酸激酶1(PGK1)啟動子誘導(dǎo)α-半乳糖苷酶表達(dá)作為食品級選擇標(biāo)記。在含有蜜二糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)32 h后重組菌株YGMPNA-PM的全細(xì)胞酶酶活力達(dá)到45.1 U/mL。與游離酶相比,重組全細(xì)胞酶的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。這些結(jié)果表明,利用構(gòu)建的食品級β-1,3-1,4-葡聚糖酶表面展示酵母重組菌株進(jìn)行啤酒發(fā)酵具有改善啤酒釀造過程的潛力。

綜上,在葡萄酒和啤酒釀造領(lǐng)域,酵母表面展示系統(tǒng)的宿主細(xì)胞大多是釀造菌株釀酒酵母,展示載體選用食品級的篩選標(biāo)記,靶蛋白是能夠提升酒品品質(zhì)的關(guān)鍵功能酶,如增進(jìn)風(fēng)味的糖苷酶、提高酒品澄清度的沉淀分解酶等。單一功能的全細(xì)胞酶應(yīng)用較為廣泛,應(yīng)用時(shí)需要確定在釀造脅迫因子(高濃度糖、乙醇以及低pH值)存在下的全細(xì)胞酶穩(wěn)定性。

2.2 簡化發(fā)酵生產(chǎn)過程

低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)一種優(yōu)良的水溶性膳食纖維。已被用于治療人類遺傳性肥胖和單純性肥胖[21]。FOS的大規(guī)模生產(chǎn)涉及利用游離或固定化的果糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化蔗糖,副產(chǎn)物為葡萄糖、果糖和殘余蔗糖,方法昂貴且耗時(shí)。ZHANG等[22]將來源于米曲霉(Aspergillusoryzae)的果糖基轉(zhuǎn)移酶展示在可產(chǎn)赤蘚糖醇的解脂亞羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)細(xì)胞表面,以PIR型細(xì)胞壁蛋白Pir1p作為錨定蛋白。全細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化蔗糖制造低聚果糖的生產(chǎn)強(qiáng)度為160 g/(L·h),可重復(fù)使用10次以上。高濃度、低附加值的FOS副產(chǎn)物(葡萄糖和果糖)可同時(shí)被全細(xì)胞酶利用生產(chǎn)赤蘚糖醇,這種大規(guī)模生產(chǎn)FOS的高效方法極具應(yīng)用價(jià)值。

低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)與人乳中的乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)在結(jié)構(gòu)和功能上具備一定的相似性[23],可以促進(jìn)腸道有益細(xì)菌增殖、預(yù)防感染和提高免疫力等[24]。目前,工業(yè)上使用具有半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的β-半乳糖苷酶以乳糖為原料生產(chǎn)GOS。通常是四階段的過程,即酶的生產(chǎn)、純化、固定化和轉(zhuǎn)化,既耗時(shí)又昂貴。因此,有必要開發(fā)易于操作的GOS生產(chǎn)工藝。在赤蘚糖醇發(fā)酵行業(yè)中,副產(chǎn)物廢棄酵母泥由于處理不當(dāng)而引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境問題。AN等[25]將來源于米曲霉的β-半乳糖苷酶展示到生產(chǎn)赤蘚糖醇的解脂亞羅維亞酵母細(xì)胞表面,錨定蛋白為Pir1p。將表面展示β-半乳糖苷酶的廢酵母泥作為全細(xì)胞催化劑以乳糖為原料二次發(fā)酵生產(chǎn)低聚半乳糖。在pH值為5.5和60 ℃條件下,以起始細(xì)胞濃度為5 g/L CDW時(shí),6 h內(nèi)將500 g/L乳糖轉(zhuǎn)化為160 g/L GOS,轉(zhuǎn)化率為51%,酵母泥可以循環(huán)使用10次以上。全細(xì)胞酶的最佳反應(yīng)溫度比游離酶高約20 ℃,轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)高于游離酶,與其他方式的固定化酶效率相近。

低聚異麥芽糖(isomalto-oligosaccharides,IMOs)是聚合度為2～10的多聚葡萄糖混合物,是一種性質(zhì)優(yōu)良的益生元。由酶轉(zhuǎn)化的IMOs聚合度通常為2～4,包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖和異麥芽四糖等[26]。目前工業(yè)上采用多酶協(xié)同法由淀粉經(jīng)過液化(耐熱α-淀粉酶)→糖化(真菌α-淀粉酶或β-淀粉酶)→轉(zhuǎn)苷(α-葡萄糖苷酶)三步法合成低聚異麥芽糖,步驟繁瑣、成本較高。因此開發(fā)更加經(jīng)濟(jì)簡便的方法生產(chǎn)IMOs具有重要的應(yīng)用價(jià)值[27]。劉大文等[28]將來源于熱硫嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)的耐熱β-淀粉酶和來源于黑曲酶的耐熱α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶進(jìn)行順序連接,共同展示在解脂亞羅維亞酵母細(xì)胞表面,錨定蛋白選用Pir1p。50 ℃條件下,全細(xì)胞酶利用液化的淀粉可一步法轉(zhuǎn)化合成純度為75.3%的IMOs。錢玲等[29]將來源于褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)的麥芽三糖生成酶展示到畢赤酵母GS115細(xì)胞表面,錨定蛋白選用GPI型細(xì)胞壁蛋白Gcw61p。全細(xì)胞酶活力可達(dá)到260 U/g,且熱穩(wěn)定性較好,重復(fù)利用3次后仍有80%的活性,可將30%麥芽糊精酶解為麥芽三糖,轉(zhuǎn)化率為60.13%。將展示麥芽三糖生成酶的全細(xì)胞酶加入到利用淀粉制備IMOs的糖化反應(yīng)中,可為黑曲霉α-葡萄糖苷酶提供更多的麥芽三糖底物,有利于IMOs總產(chǎn)量的提高,且低聚異麥芽糖組分更加豐富。

異麥芽酮糖是蔗糖的一種結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。作為替代蔗糖的替代品,異麥芽酮糖無毒性,是公認(rèn)安全的甜味劑,具有較低的升糖指數(shù),且不能被口腔中的致齲細(xì)菌利用,適合用于各種食品和飲料的添加。由于其化學(xué)合成的復(fù)雜性,酶生物轉(zhuǎn)化法是生產(chǎn)異麥芽酮糖的首選方法[30]。蔗糖異構(gòu)酶(sucrose isomerase,EC 5.4.99.11)可將蔗糖生物轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖。LEE等[31]將來源于腸桿菌屬(Enterobactersp.)FMB-1菌株的蔗糖異構(gòu)酶展示在釀酒酵母EBY100菌株的細(xì)胞表面,使用Aga2p作為錨定蛋白。與在大腸桿菌中表達(dá)的重組游離酶相比,展示的全細(xì)胞酶熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。在不同底物濃度范圍(50～250 mmol/L)下,蔗糖轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率為6.4%～7.4%。

海藻糖可以防止蛋白質(zhì)或氨基酸產(chǎn)生美拉德反應(yīng),是最為常用的食品添加劑[32]。海藻糖合成酶可以通過從低成本底物麥芽糖一步轉(zhuǎn)化合成海藻糖[33]。LI等[34]將嗜熱古菌(Pictrophilustorridus)的海藻糖合酶基因展示到解脂亞羅維亞酵母細(xì)胞表面,錨定蛋白選用Pir1p。在最佳的發(fā)酵條件下,海藻糖的產(chǎn)率達(dá)到73%,與從重組大腸桿菌中純化的游離酶相比,展示的全細(xì)胞酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性得到了改善。YANG等[35]將來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的海藻糖合成酶基因與錨定蛋白Pir1p融合展示在巴斯德畢赤酵母GS115細(xì)胞表面。在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵150 h,重組全細(xì)胞酶活力達(dá)到1 109 U/g,展示細(xì)胞以麥芽糖漿作為底物生產(chǎn)海藻糖轉(zhuǎn)化率超過60%,在循環(huán)使用3次后仍具有較高的催化活性。研究結(jié)果表明,采用全細(xì)胞催化劑一步法發(fā)酵麥芽糖生產(chǎn)海藻糖是經(jīng)濟(jì)、有效的途徑,適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

綜上,利用微生物發(fā)酵和酶法工藝進(jìn)行低聚糖的生產(chǎn)是該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢。表面展示功能酶的全細(xì)胞催化劑在活性和穩(wěn)定性方面顯著高于游離酶和固定化酶,可多次重復(fù)利用,在大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用潛力。

2.3 生產(chǎn)高值和增值食品

長鏈多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)對大腦和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是功能脂肪酸中的主要活性成分。從魚油、海藻油和漁業(yè)副產(chǎn)品等含有PUFA的原料中富集DHA或EPA成為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。采用化學(xué)方法提取和濃縮PUFA對脂肪酸沒有選擇性,并且消耗大量能量[36]。利用脂肪酶(三酰甘油酰基水解酶,EC 3.1.1.3)催化的選擇性水解是生產(chǎn)PUFA濃縮物的一種簡單高效的方法。PAN等[37]將來源于地霉屬(Geotrichumsp.)的脂肪酶在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示,錨定蛋白選用釀酒酵母的a-凝集素的N端結(jié)構(gòu)域。在30 ℃下培養(yǎng)96 h后,全細(xì)胞酶水解橄欖油的活性達(dá)到(273±2.4) U/g。在選擇性水解的基礎(chǔ)上進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化富集,EPA和DHA從原始魚油中的1.53%和24.1%增加到1.85%和30.86%,分別增加了1.21和1.29倍。EPA和DHA的總收率達(dá)到46.62%。XU等[38]使用源自釀酒酵母的a-凝集素作為錨定蛋白,將皺紋假絲酵母脂肪酶展示在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面。展示的全細(xì)胞酶與游離酶相比,熱穩(wěn)定性更高,對橄欖油的水解活性最高達(dá)到(380±2.8) U/g。從海藻油中富集DHA,在最佳條件下發(fā)酵96 h后,DHA的含量從原始藻油中的40.61%提高到50.44%,產(chǎn)量增加了1.24倍。該研究是從海藻油中提取DHA的首次報(bào)道。

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)是一種具有改善記憶、預(yù)防阿爾茨海默癥、緩解抑郁和減少壓力的功能性食品添加劑。PS可以從動物器官、大豆、蛋黃、植物油等生物質(zhì)中提取,但其獲得效率較低,限制了工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)[39]。磷脂酶D(phospholipase D,EC.3.1.4.4)可以催化磷脂酰膽堿與L-絲氨酸的轉(zhuǎn)磷酰化反應(yīng)制備PS,其催化具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。LIU等[40]將來源于褐色鏈霉菌(Streptomyceschromofuscus)磷脂酶D基因pldsh進(jìn)行密碼子優(yōu)化后在巴斯德畢赤酵母GS115細(xì)胞表面進(jìn)行過表達(dá)展示,錨定蛋白選用細(xì)胞壁蛋白Flo1p。與游離酶比,展示的全細(xì)胞酶的熱穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性顯著增強(qiáng)。在最佳條件下使用水相體系,全細(xì)胞酶可將67.5%的磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化為PS,經(jīng)過7次分批循環(huán)后,PS的轉(zhuǎn)化率仍保持在50%以上。LIU等[41]將來源于色粘鏈霉菌(Streptomyceshalstedii)的磷脂酶D與錨定蛋白Flo1p絮凝功能結(jié)構(gòu)域融合表達(dá),展示在巴斯德畢赤酵母GS115細(xì)胞表面,制備利用磷脂酰膽堿和L-絲氨酸合成PS的全細(xì)胞生物催化劑。全細(xì)胞酶在較寬的溫度(20～60 ℃)和pH值(4.0～8.0)范圍內(nèi)穩(wěn)定。在最佳工藝條件下,PS的轉(zhuǎn)化率為53%,全細(xì)胞酶在水相體系中催化4次后產(chǎn)率仍保持在40%以上。

表1 酵母表面展示技術(shù)在食品發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用Table 1 Application of yeast surface display technology in food fermentation

木糖醇是一種由D-木糖衍生的甜味劑,廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。以木質(zhì)纖維素廢料生產(chǎn)木糖醇是一種可以顯著降低其生產(chǎn)成本的方法。GUIRIMAND等[42]將木糖還原酶(XR)、β-葡萄糖苷酶(BGL)、木糖苷酶(XYL)和木聚糖酶(XYN)等展示在釀酒酵母YPH499菌株表面。使用全細(xì)胞酶以稻草水解液直接生產(chǎn)木糖醇,發(fā)酵過程不需要添加任何商業(yè)酶。稻草水解液中所含的木糖中以79.5%的理論產(chǎn)率轉(zhuǎn)化為5.8 g/L的木糖醇。此外,稻草水解物發(fā)酵過程中同時(shí)進(jìn)行納濾分離以去除其中的發(fā)酵抑制劑,促進(jìn)了高濃度木糖醇的生產(chǎn)(37.9 g/L)。此項(xiàng)研究是酵母細(xì)胞表面技術(shù)和膜分離技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)木糖醇的首次報(bào)道,可進(jìn)一步的擴(kuò)展到工業(yè)應(yīng)用中去。

綜上,酵母菌的底物利用范圍大、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)。酵母全細(xì)胞催化劑能將可以利用的天然廉價(jià)底物轉(zhuǎn)化為高值產(chǎn)品。單獨(dú)催化元件的表面展示可能具有一定局限性,對全細(xì)胞催化劑進(jìn)行多基因、多組分的網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)分析具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

3 結(jié)論與展望

酵母表面展示技術(shù)對于食品發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)生了多方面的影響。在發(fā)酵產(chǎn)物方面,酵母表面展示技術(shù)可以通過重新設(shè)計(jì)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品生產(chǎn)過程,從而生產(chǎn)新穎的產(chǎn)品或避免合成副產(chǎn)品提高產(chǎn)品品質(zhì)。在發(fā)酵過程方面,酵母表面展示技術(shù)可以傳統(tǒng)的發(fā)酵食品生產(chǎn)方式,集成多步催化過程,構(gòu)建“細(xì)胞工廠”提高資源轉(zhuǎn)化效率。在發(fā)酵原料方面,酵母表面展示技術(shù)可以擴(kuò)大食品發(fā)酵的反應(yīng)底物范圍,將廉價(jià)的原料轉(zhuǎn)化為更有價(jià)值的目標(biāo)產(chǎn)品,可以實(shí)現(xiàn)可再生原料或低值原料的高值利用[43]。

然而,酵母表面展示技術(shù)在食品發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用仍有許多問題需要解決。在宿主選擇方面,目前已廣泛應(yīng)用的展示宿主僅為釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、解脂亞羅維亞酵母等有限的種類。作為公認(rèn)安全的乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母、布拉氏酵母等其他酵母表面展示系統(tǒng)的建立已見報(bào)道,但仍未被進(jìn)一步開發(fā)及利用,食品級宿主資源還需進(jìn)一步挖掘。在靶蛋白選擇方面,選用展示單酶進(jìn)行簡單催化反應(yīng)的實(shí)際應(yīng)用場景較多,從單酶到多酶共展示協(xié)同發(fā)酵技術(shù)是今后的研究和開發(fā)方向。在錨定蛋白選擇方面,選用單一錨定蛋白進(jìn)行直接展示是一種比較簡潔方便的方法,有利于工業(yè)的生產(chǎn)。然而對于分子質(zhì)量較大結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以直接展示的蛋白,可能需要通過間接展示的方式來實(shí)現(xiàn)[44]。深入研究酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu),開發(fā)新的錨定方式將有利于酵母表面展示技術(shù)的發(fā)展。盡管存在問題,但是隨著酵母展示技術(shù)的不斷完善和改進(jìn),能科學(xué)地指導(dǎo)傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的升級,在食品領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。