4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮的生物與非生物的合成途徑研究進展

俞兆斌,朱麗霞,2*

1(塔里木大學 食品科學與工程學院,新疆 阿拉爾,843300);2(南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室,新疆 阿拉爾,843300)

4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone,HDMF),又名菠蘿酮,稀溶液呈草莓味,濃溶液則是焦糖香味[1]。HDMF及其甲氧基衍生物、乙氧基衍生物、β-吡喃葡萄糖苷及其丙二酰化衍生物均已在水果中鑒定[2]。在加熱、非加熱、發酵的食品中均可以檢測出HDMF[3]。HDMF在水中的閾值是0.03 mg/L、空氣中閾值是0.1 mg/L、在pH值為3.2的10%水醇溶液中閾值是5 μg/L[4],較低的閾值及宜人的風味特征,被用作調味劑[5]。環狀二羰基衍生物的平面烯醇氧基的結構特征,使得HDMF與其類似物具有焦糖風味[6](圖1)。

1-呋喃酮;2-麥芽酚;3-甲基環戊烯稀酮;4-五元環氫鍵環狀化合物圖1 含有α-二酮體稀醇結構的物質[6]

呋喃酮類化合物以其官能團分為3(2H)-呋喃酮和2-(5H)-呋喃酮兩大類,其中3(2H)-呋喃酮中包括：5-甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮[5-methy-4-hydroxy-3(2H)-furanone,HMF]、2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)、2,5-二甲基-4-甲氧基-3(2H)-呋喃酮[2,5-dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanone,DMMF]、5-(或2)-乙基-2-(或5)-甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮[5-(or 2)ethyl-2-(or 5)-methy-4-hudroxy,3(2H)-furanone,EMHF]、2,5-二甲基-2,4-二羥基-3(2H)-呋喃酮,2-(5H)-呋喃酮包括蘆巴內酯、乙氧基呋喃酮、抗壞血酸、紅細胞抗壞血酸等[7]。HDMF依據氧存在的形式,表現出氧化或促氧化特性[8],是食品中已知的促氧化劑,通過銅離子還原為亞銅離子產生超氧自由基轉化為過氧化氫和羥基自由基,是DNA鏈斷裂和8-羥基-2′-脫氧鳥苷形成的原因[8],具有與抗壞血酸相當的抗氧化活性[7]。HDMF可保護人類紅細胞膜和低密度脂蛋白免受鐵誘導的氧化修飾,抑制色素沉著,具有抗感染活性[8];抑制人血漿脂質氧化,對眼睛晶狀體組織中超氧化物有抗氧化作用,抑制白內障[9];對革蘭氏菌、真菌具有抗菌活性,誘導細胞內海藻糖積累,破壞血清誘導的菌絲形態[10]。HMF、HDMF、DMMF是良好的抗致癌劑,HDMF可降低由苯并[α]芘誘導的大鼠前胃腫瘤發生率和數量[11]。據最新研究,大鼠吸入HDMF可降低收縮壓、心率及血漿氧化應激標志物水平[12]。人體吸入HDMF可以降低憤怒-敵意、緊張-焦慮、疲勞-慣性情緒;降低額葉皮層閃爍頻率和氧合血紅蛋白,具有鎮靜、生理放松作用[13]。

綜上,HDMF為廣泛存在于自然界的天然活性功能物質,重要的工業香料。通過對其生物與非生物合成途徑的國內外研究報道進行綜述,為HDMF健康、綠色的工業生產、食品加工中的風味調控等提供綜合性知識。

1 化學法合成HDMF

HDMF化學合成底物有糖,羧酸和羧酸酯、呋喃、不飽和醇類、醛酮的衍生物等(表1),其中常見的有鼠李糖、酒石酸、乳酸乙酯和丙酮醛等。

表1 呋喃酮化學合成主要原料[6]Table 1 Main raw materials for the chemical synthesis of furanone[6]

表2 合成HDMF的微生物Table 2 Microorganisms that synthesise HDMF

化學合成在工業中應用還需克服原料成本高、不同合成工藝差異較大等技術難題。在國內,化學合成HDMF的方法為：乳酸乙酯與α-溴代丙酸乙酯在強堿性溶液中發生烷氧基化反應,中間產物在含有金屬鈉的甲苯溶劑發生偶聯反應,再催化氧化得到HDMF,具有原料廉價、易得的優點,但烷基化以及縮合反應,反應條件嚴苛[14]。在國外合成HDMF主要是由瑞士芬美意公司(FIRMENICH)提供,丙酮醛在乙酸水溶液中,由鋅粉提供還原電子,經過Pinacol偶聯反應得到3,4-二羥基-2,5-己二酮,再用Na2HPO4調節反應體系pH進行環化反應得到HDMF,反應體系中含有多羰基,很難控制Witting反應制備相應的烯烴[15]。

2 美拉德反應形成呋喃酮

美拉德反應可以形成HDMF(圖2)。在含有糖的溶液中,己糖、6-脫氧糖和戊糖通過2,3-烯醇化、β-消去反應、形成3-脫氧酮糖、再進行分子內環化和脫水反應降解為HDMF[16](藍色標注)。在含有己糖和氨基酸的食品中,HDMF通過美拉德反應形成,葡萄糖經過阿姆德分子重排、2,3-烯醇化形成脫氧酮,裂解為羥基丙酮和乳醛,再通過羥醛縮合反應、環化形成乙酰福爾馬林,再被還原成HDMF,其中乙酰福爾馬林、雙乙酰福爾馬林和二氫二乙酰福爾馬林為重要中間體[17](紅色標注)。3-脫氧酮糖裂解形成甲基乙二醛,再經過Cannrizzaro反應形成羥基丙酮,異構為端羥基醇,通過與2-氧代丙醇反應生成2,5-二氧代-3,4-二羥基己烷,繼而環化、β-消除水形成HDMF[17]。在面包中,HDMF前驅物質是酵母細胞內水溶性的1,6-二磷酸-D-果糖(D-fructose-1,6-diphosphate,FDP)在烘培中生成,其推測是C6的磷酸根離子移除之后,2,3-烯醇化形成乙酰福爾馬林,繼而形成HDMF,磷酸根離子、維生素C可以促進其轉化[18]。環境溫度為30 ℃時合成HDMF的效率最高,緩沖液的pH、化學性質對酶活性影響較小。在含有FDP和NADPH的溶液中,NADPH向碳水化合物非酶氫化轉移,可化學轉化形成HDMF,重要的中間體為乙酰福爾馬林[19](綠色標注)。

圖2 美拉德反應形成呋喃酮物質轉化路線圖

3 酶催化形成呋喃酮

在工業中以FDP為底物,利用三步酶法生產HDMF(圖3)[20]。醛縮酶和磷酸三酯異構酶處理含有D- 1,6-二磷酸果糖和D-乳醛的溶液時,形成6-脫氧果糖-1-磷酸(圖5),D-1,6-二磷酸果糖在1,6-二磷果糖-酸醛縮酶(兔肌肉醛縮酶)的作用下裂解為磷酸二羥丙酮和D-磷酸甘油醛,而磷酸丙糖異構酶可以促進D-磷酸甘油醛與磷酸二羥丙酮相互轉化,磷酸二羥丙酮在含有乳醛的堿性溶液中經醛縮酶作用發生羥醛縮合反應形成6-脫氧-D-果糖(D-乳醛)或6-脫氧-L-山梨糖(L-乳酸醛)與哌啶在80 ℃條件下加熱20 h形成HDMF[21]。

圖3 酶法合成呋喃酮物質轉化路線圖[20]

4 植物中酶促反應生成游離與結合態的呋喃酮

最早發現HDMF是草莓的特征香氣物質之一。尚未發現HDMF在草莓果實中較為完整的植物代謝合成途徑[22],但已取得了實質性進展(圖4)：草莓果實中HDMF及其糖苷衍生物是由D-果糖和6-磷酸-D-果糖形成HDMF的甲氧化合物,醌氧化還原酶(FaQR)和烯酮氧化還原酶(FaEO)將其轉化為HDMF,通過葡萄糖基轉移酶和丙二酰轉移酶生成HDMF葡萄糖苷衍生物[23]。其中,HDMF的碳架直接來源于D-果糖、FDP通過生物美拉德反應生成的1-脫氧果糖或6-脫氧果糖,而非醛縮酶切割成2個C3單元[24]。草莓果實基因和菠蘿、番茄中發現的是同源基因,與高等植物生長素誘導型蛋白編碼基因高度相似[23]。在草莓中合成HDMF的基因只在果實細胞中表達,在后熟期大量積累[24]。草莓中存有呋喃酮葡萄糖醛酸和呋喃酮丙二酸葡糖苷,兩者未在葡萄中鑒定,但葡萄中含有HDMF苷元,Muscat Bailey A、V.labrusca(Bailey) xV.vinifera(Muscat Hamburg)的雜交葡萄,HDMF前驅物質與草莓中呋喃酮前驅物質相似,主要為mesifuran及其吡喃葡萄糖苷,在基因水平上UGT85K14葡萄糖基轉移酶基因調控呋喃酮的糖基化[25]。

圖4 植物合成呋喃酮的路線圖[22]

5 微生物合成呋喃酮的可能途徑

5.1 微生物發酵釋放結合態HDMF

在發酵果汁中,微生物可釋放結合態HDMF(圖4)。不同葡萄品種的葡萄酒中HDMF從微量到3.5 mg/L不等,結合態香氣的釋放是其重要來源之一,葡萄酒中通過β-葡萄糖苷的果膠水解酶提高HDMF濃度。結合態HDMF有葡萄糖苷、呋喃酮-丙二酰化-葡萄糖苷等[26],研究表明磷酸己糖異構酶參與D-果糖轉化釋放結合態HDMF,參與的微生物有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、貝氏絲孢酵母(Trichosporonbaileyi)[22];HDMF-葡萄糖醛酸存在于草莓果實中,β-葡萄糖苷酶可能是參與反應的生物酶[27]。

5.2 微生物以美拉德反應中間產物為底物合成HDMF

20世紀90年代已經證明美拉德反應的產物可以促進微生物生成HDMF。在單獨加熱后的L-鼠李糖溶液、濕熱滅菌的D-葡萄糖、酵母膏、蛋白胨培養基(YPG)中接種莢膜畢赤酵母(Pichiacapsulata)生長4 d,均沒HDMF;而將單獨加熱的L-鼠李糖加入濕熱滅菌的YPG中,接種莢膜畢赤酵母(P.capsulata)生長4 d后,檢測出HDMF,L-鼠李糖濃度增加HDMF生成量也增加,推測添加L-鼠李糖的YPG加熱后可以形成酵母菌合成HDMF的底物[28]。深色麥芽汁中檢測到HDMF,而淡色麥芽汁中未檢出,釀酒酵母(S.cerevisiae)發酵淺色和深色麥芽汁均生成HDMF[29]。shoyu-koji糖化汁(mugi-miso)中添加還原糖后加熱均產生HDMF,再接入魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)發酵,HDMF含量均有不同程度增加,其中D-鼠李糖可促進美拉德反應產生HDMF(125.5 mg/L)和酵母菌(T.dermatis)發酵生成HDMF(131.2 mg/L),高于其他糖類誘導生成HDMF(美拉德反應≤6 mg/L,酵母菌發酵≤8 mg/L);通過監測發酵過程中各還原糖濃度、HDMF濃度、褐變度,作者推測酵母菌可將美拉德反應的產物(C6-1-脫氧核糖)轉化為HDMF(圖5),到目前僅是推測,缺乏直接證據。將單一氨基酸和單一糖(核糖和半乳糖)混合液加熱(121 ℃,15 min)后,再添加至高壓蒸汽滅菌后的YPG中,魯氏酵母(Z.rouxii)發酵生成HDMF約1 mg/L[30]。在YPG中添加5%的D-果糖生成HDMF含量為1.8 mg/L,6-脫氧-L-甘露糖和6-脫氧核糖,經濕熱滅菌后,接入魯氏接合酵母進行發酵,分別生成5 mg/L和18 mg/L[31]。在慕薩萊思發酵過程中,通過果實的酶解和酸解釋放結合態呋喃酮,HDMF含量不斷增加。模擬葡萄汁滅菌后接入本土釀酒酵母(S.cerevisiae)發酵,均可產生HDMF,證明在慕薩萊思發酵過程中,微生物既降解葡萄汁中結合態呋喃酮,同時又代謝葡萄汁濃縮過程中美拉德反應的產物生產HDMF[32]。

圖5 微生物合成呋喃酮的可能代謝途徑

乳酸菌可以利用美拉德產物而生成HDMF,但無明確的代謝途徑報道。在含酵母膏和蛋白胨的培養基中,添加半乳糖和谷氨酸鈉、核糖和谷氨酸,培養基經過濕熱滅菌和0.22 μm膜過濾除菌,再乳酸乳球菌亞種(Lactococcuslactissubsp.Cremoris)發酵,均生成HDMF,濕熱滅菌培養基中HDMF的生成量分別是膜過濾除菌的9倍與3.3倍,說明乳酸菌可以將美拉德反應的產物轉化為HDMF[33]。瑞士乳桿菌(L.helveficu)和德氏乳桿菌(L.delbrueckii)在乳清粉水懸浮液上培養7 d后,HDMF濃度分別為0.60 mg/L和0.45 mg/L,佛氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)產生量為0.08 mg/L[34]。利用植物乳桿菌(L.amylolyticus)發酵麥芽汁飲品,HDMF為其關鍵風味化合物之一。在濃縮葡萄汁中接入拜耳結合酵母(Z.bailii)、畢赤克魯維酵母(P.kluyveri)和釀酒酵母(S.cerevisiae)混菌發酵,30 d后檢測到發酵液中HDMF含量為172.30 mg/L[35]。在濃縮葡萄汁中接入野生型釀酒酵母發酵,14 d后HDMF含量為54.055 mg/L[36]。

5.3 微生物利用FDP代謝合成HDMF途徑

微生物在添加不同糖類的培養基中生成HDMF的含量存在差異。在YPG中添加單磷酸糖(6-磷酸-D-葡萄糖、1-磷酸-D-果糖和6-磷酸-D-果糖),魯氏接合酵母生成少量HDMF(1.9～3.8 mg/L),而添加FDP,生成HDMF含量為52 mg/L[31]。在13°Bé麥汁中添加不同糖類均可生成HDMF,其中添加FDP生成HDMF含量為45.6 mg/L,其他含量為14～17 mg/L[39],當添加FDP濃度為100 g/L時,HDMF的產量最高達到98 mg/L[43]。FDP作為唯一碳源并不能直接生成HDMF,而是酵母菌以FDP為底物的次級代謝產物產生,其完整代謝途徑不清楚,但已明確FDP先經化學途徑轉化為1-脫氧-2,3-己二酮糖-6-磷酸,再由魯氏接合酵母細胞壁中生物酶合成HDMF[44]。

魯氏接合酵母在高濃度NaCl的YPG中加入D-果糖進行發酵,發現D-果糖可提高魯氏接合酵母在糖酵解途徑(EMP)和磷酸戊糖(PPP)途徑中初級代謝產物及相關基因表達,包括調節磷酸二羥丙酮的FBA基因,對應酶活性與HDMF濃度相關[45]。作者沒有將可能的關鍵底物進行驗證實驗,關鍵底物可能是D-果糖的加熱(包括濕熱滅菌)非酶褐變或生物非酶褐變反。目前報道D-果糖轉化為HDMF的生物途徑主要有2種：一種是D-果糖在培養基中一起加熱,再微生物發酵形成HDMF,底物可能是D-果糖加熱過程中形成的美拉德反應產物,但尚無清晰的代謝途徑[31];另一種是在草莓成熟過程中作為HDMF的碳骨架來源,D-果糖通過生物美拉德反應生成1-脫氧果糖或6-脫氧果糖[24]。

綜上表明,莢膜畢赤酵母,魯氏接合酵母,釀酒酵母,乳酸菌可以在不同糖類培養基中發酵產生HDMF,其生成量依據微生物、糖、氮源、美拉德反應程度(色度)、厭氧與好氧、滲透壓等產生差異。目前微生物生成HDMF,初步明確微生物可釋放植物中結合態呋喃酮,或通過代謝美拉德中間產物生成途徑,轉化生產HDMF,或可能有其他代謝途徑(細菌代謝未加熱處理的培養物)可生成HDMF。不論哪種代謝途徑,均無完整而清晰的代謝途徑,極大限制了微生物合成HDMF的深入研究。

6 結論與展望

本文對HDMF的生物與非生物合成途徑進行了全面綜述。目前,化學合成已成為工業合成主要途徑;植物合成代謝和美拉德反應生成途徑較為清晰,揭示農產品和食品加工形成HDMF的途徑,但目前沒有開發應用的報道;微生物合成HDMF具有綠色、低成本等優勢,但微生物合成HDMF的研究滯后,初步表現為釋放結合態HDMF較為清晰,酵母菌、乳酸菌等多種菌株發現可以利用FDP、美拉德反應中間產物等為其可能的代謝底物,但代謝途徑不清晰。

隨著食品風味科學的興起,關鍵香氣鑒定技術廣泛應用,對食品風味的形成實施精準控制。對于傳統加熱后再發酵生成HDMF的食品,可以通過熱加工賦予該食品焦糖類風味,但由于美拉德反應的復雜性,難以實現食品風味的精細化控制。隨著我國綠色經濟的發展,HDMF市場需求的不斷增加,化學合成的HDMF難以滿足價廉、低污染、安全、高效的需求,也無法滿足人們對天然食材消費增長的需求。在植物中可以通過代謝途徑及關鍵酶調控生成HDMF,草莓植株進行分子育種與栽培控制,可將HDMF的代謝通路進行基因編輯等技術手段進行改良,提高產量[];在富含HDMF植物中運用現代分離提純技術提取HDMF;通過生物轉化法生產高效價的HDMF,但合成周期長、成本高、操作難度大,應用范圍窄。微生物發酵法生產的HDMF香韻較好、品質較高,具有不受環境限制等優點,是合成HDMF的新趨勢,但需要對微生物合成HDMF的底物、代謝途徑、關鍵酶系、調控基因及優良菌株等基礎性工作做深入研究。