新版人畜共患傳染病名錄病種檢測技術淺析

呂偉軍,沈紅霞,池麗娟,楊 磊,孫思琪,周 煒

(1.浙江省動物疫病預防控制中心,浙江 杭州 311119;2.中國動物疫病預防控制中心)

習近平總書記在中共中央政治局第三十三次集體學習時強調“要實行積極防御、主動治理,堅持人病獸防、關口前移,從源頭前端阻斷人獸共患病的傳播路徑”。目前,有記載的人獸共患病有200余種,有些病種尚無有效檢測標準,有些病種檢測方法林林總總,有些病種已有檢測用試劑盒但尚未標準化或尚未在較大范圍內試用、驗證。如何切實有效開展針對性防控、嚴守生物安全底線,是每一個畜牧獸醫工作者需要面對的問題。

2023年6月,農業農村部針對全國現在主要人畜共患病流行情況,發布了新修訂的人畜共患傳染病名錄,共收錄24種人畜共患傳染病,包括4種病毒病、8種細菌病、8種寄生蟲病和4種其他疫病(朊病毒、立克次氏體、螺旋體和衣原體),為開展針對性的防控指明了方向。因而,對于這些病種的檢測所采用的權威檢測標準、確診方法以及檢測過程中需要處于何種生物安全級別成為疫病檢測實驗室的重中之重。本文旨在梳理新版人畜共患傳染病名錄中24個病種的現行有效的檢測標準(國際標準、國家標準和行業標準)和開展相應實驗室檢測活動所需生物安全級別,以期為相應檢測的開展提供更為明析的參考。以下各病種情況具體見表1。

表1 相關疾病實驗室檢測規范

1 病毒病

1.1高致病性禽流感 高致病性禽流感的病原為禽流感病毒,按照中華人民共和國農業部令 第53號《動物病原微生物分類名錄》和《農業部關于進一步規范高致病性動物病原微生物實驗活動審批工作的通知》(農醫發[2008]27號)的規定(后續病種同此依據),屬第一類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗需在生物安全第三級實驗室(以下簡稱三級實驗室,其他級別同)條件下開展;未經培養的感染性材料實驗(感染性材料處理需在Ⅱ級生物安全柜中進行)、滅活材料實驗需在二級實驗室條件下開展。按照世界動物衛生組織(WOAH;原為OIE)《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,禽流感為A類疾病。

我國主要現行檢測標準見表1,《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法,指定的替代診斷方法為瓊脂凝膠免疫擴散試驗和血凝試驗。

現在《GB/T 18936 高致病性禽流感診斷技術》所涉及的試劑均有商品化試劑盒,所需雞紅細胞也相對易于獲取與制備,因而該標準使用較為廣泛。除該標準所述方法以外,還有乳膠凝集試驗、瓊脂凝膠擴散試驗、神經氨酸酶抑制試驗、ELISA、H5亞型AIV膠體金診斷試驗、免疫熒光技術、PCR-ELISA技術、核酸依賴的擴增技術和基因芯片技術等方法。

1.2狂犬病 狂犬病的病原為狂犬病病毒,屬第二類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗和未經培養的感染性材料實驗需在三級實驗室條件下開展,滅活材料實驗需在二級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,狂犬病為B類多種動物共患病。

我國主要現行檢測標準見表1,《國際動物衛生法典》尚未指定其替代診斷方法,指定的診斷方法為病毒中和試驗。

除表內列入方法外,還有關于競爭ELISA、雙抗夾心ELISA、間接免疫熒光、快速熒光灶抑制試驗和膠體金免疫層析技術等抗體檢測技術,乳膠凝集試驗、熒光抗體試驗、原位雜交、基因芯片和核酸環介導等溫擴增技術(loop mediated isothermal amplification, LAMP)等抗原檢測技術。目前,已有狂犬病抗體ELISA檢測的商品化試劑盒,適用于可疑病犬的初步診斷或狂犬病疫苗免疫合格率的監測,該方法更簡便易行。

1.3日本腦炎(流行性乙型腦炎) 日本腦炎的病原為日本腦炎病毒,屬第三類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗需在二級實驗室條件下開展,滅活材料實驗則僅需在一級實驗室條件下開展。與我國將其歸類為豬病病原微生物不同,《OIE 陸生動物衛生法典》將日本腦炎歸為B類馬病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和替代診斷方法。

除表內列入方法外,還有免疫熒光試驗、乳膠凝集試驗、SPA協同凝集試驗、HRP-SPA ELISA、Dot-ELISA、膠體金、免疫層析試紙法和斑點金免疫滲透法等血清學方法,RT-PCR、套式RT-PCR、LAMP技術、TaqMan熒光探針、SYBR熒光染料法和基因芯片技術等分子生物學方法。

1.4尼帕病毒性腦炎 尼帕病毒性腦炎的病原為尼帕病毒,該病為外來病種,《動物病原微生物分類名錄》尚未收錄,《OIE 陸生動物衛生法典》中將其歸為生物安全第四級病原體,屬B類國際貿易中的其他重要疾病(尼帕病毒)。

我國主要現行檢測標準見表1《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和指定替代診斷方法。

目前,我國對尼帕病毒的研究報道相對較少。樊歡等基于多重PCR結合核酸侵入反應及納米金顯色技術,建立了一種包括尼帕病毒在內的5種腦炎腦膜炎病毒檢測技術。

2 細菌病

2.1炭疽 炭疽的病原為炭疽芽孢桿菌,屬第二類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗和未經培養的感染性材料實驗需在三級實驗室條件下開展,滅活材料實驗需在二級實驗室條件下開展。炭疽未收錄進《OIE 陸生動物衛生法典》。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和替代診斷方法。

除表內列入方法外,更高層次的方法還有基于芽孢、細菌繁殖體、基因、毒素蛋白的檢測方法。王素華等基于炭疽桿菌2個不同位點的基因片段建立了雙重熒光PCR檢測技術,以提高其分子生物學檢測的敏感性和準確度。目前,已有炭疽病菌核酸檢測的商品化試劑盒,適用范圍包括可疑病料及可疑病畜接觸過環境的初步判定檢測。

2.2布魯氏菌病 布魯氏菌病的病原為布氏桿菌,屬第二類動物病原微生物,病原分離培養和動物感染實驗需在三級實驗室條件下開展,未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗需在二級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,布魯氏菌病為B類牛病、綿羊和山羊病、豬病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》中指定牛布病的診斷方法為緩沖布氏桿菌抗原試驗(BBAT)、補體結合試驗(CF)和ELISA,替代診斷方法為熒光偏振試驗(FPA);山羊和綿羊布病的診斷方法為BBAT和CF,替代診斷方法為布魯氏菌素試驗;豬布病的診斷方法為ELISA,替代診斷方法為BBAT和FPA。

近年來,膠體金快速檢測技術也得到了快速發展與應用,部分產品的靈敏度與ELISA方法相當、準確性略優于ELISA方法,但多數品牌的產品同樣不適用于粗糙型布魯氏菌的檢測。此外,由中國獸醫學會頒布的團體標準《T/CVMA 20動物布魯氏菌實時熒光PCR檢測方法》中規定了適用于動物脾臟、肝臟、淋巴結、血液、奶樣、精液、陰道分泌物、流產胎兒內容物和被布魯氏菌污染的環境樣品中布魯氏菌實時熒光PCR檢測方法,為環境樣品的布病檢測提供了新的解決方案。

2.3沙門氏菌病 沙門氏菌病的病原為沙門氏菌,屬第三類動物病原微生物,病原分離培養和動物感染實驗需在二級實驗室條件下開展,未經培養的感染性材料和滅活材料實驗則僅需在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,沙門氏菌病為B類國際貿易中的其他重要疾病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法,指定替代診斷方法為病原鑒定。

目前,除表內列入方法外,關于ELISA(雙抗體夾心、直接、間接)、免疫磁珠分離、免疫熒光檢測等免疫分析檢測技術,RT-PCR、LAMP、基因芯片等分子生物學檢測方法,生物傳感器檢測技術、納米技術等新型檢測技術被運用于沙門氏菌病檢測。

2.4牛結核病 牛結核病的病原為結核分枝桿菌(以牛分枝桿菌為主),屬第三類動物病原微生物,病原分離培養和動物感染實驗需在三級實驗室條件下開展,未經培養的感染性材料需在二級實驗室條件下開展(感染性材料處理需在Ⅱ級生物安全柜中進行),滅活材料實驗僅需在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,牛結核病為B類牛病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其替代診斷方法,指定診斷方法為結核菌素試驗。

除表內列入的方法外,針對牛結核病的實驗室檢測還有ELISA、免疫斑點測定法、熒光偏振檢測法、斑點金免疫滲濾試驗、免疫印跡法、固相抗體競爭試驗、固相抗體競爭夾心酶聯法、膠體金等血清學檢測方法,DNA探針、指紋、圖譜技術等分子生物學方法。

2.5豬鏈球菌Ⅱ型感染 豬鏈球菌Ⅱ型感染的病原為豬鏈球菌Ⅱ型,致病性鏈球菌屬第三類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗需在二級實驗室條件下開展,滅活材料實驗則僅需在一級實驗室條件下開展。豬鏈球菌Ⅱ型感染未收錄進《OIE 陸生動物衛生法典》。

我國主要現行檢測標準見表1。豬鏈球菌Ⅱ型感染未收錄進《國際動物衛生法典》。

目前,關于豬鏈球菌的檢測技術研究包括病原學、分子生物學、分子分型和免疫學方法。病原學集中在優化細菌的選擇性分離培養方向,分子生物學檢測方法主要有PCR、多重PCR、熒光定量PCR、LAMP和基因芯片技術,分子分型已有多位點序列分型、隨機擴增多態性DNA、核糖體分型、脈沖場凝膠電泳等方法的研究報道,免疫學方法則有ELISA法、膠體金法和電化學免疫傳感器技術等。

2.6馬鼻疽 馬鼻疽的病原為鼻疽伯克霍爾德氏菌(原名為鼻疽假單胞菌),屬第三類動物病原微生物,馬鼻疽在我國為已消滅病種。病原分離培養、動物感染實驗和未經培養的感染性材料實驗需在二級實驗室條件下開展,滅活材料實驗可在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,馬鼻疽為B類馬病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其替代診斷方法,其指定診斷方法為馬來因試驗(即鼻疽菌素點眼試驗)。

2.7李氏桿菌病 李氏桿菌病的病原為李氏桿菌(現行標準中用名還涉及:李斯特菌、李斯特氏菌、單核細胞增多性李斯特桿菌),屬第三類動物病原微生物,病原分離培養和動物感染實驗需在二級實驗室條件下開展,未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗可在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,李氏桿菌病為B類國際貿易中的其他重要疾病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和替代診斷方法。

2.8類鼻疽 類鼻疽的病原為類鼻疽伯克霍爾德菌,屬第三類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗和未經培養的感染性材料實驗需在二級實驗室條件下開展,滅活材料實驗可在一級實驗室條件下開展。類鼻疽未收錄進《OIE 陸生動物衛生法典》。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和替代診斷方法。

此外,類鼻疽病原的檢測方法還包括LF-RPA法、LAMP-納米生物傳感器快速檢測法。

3 寄生蟲病

3.1弓形蟲病 弓形蟲病的病原為龔地弓形體,屬第四類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗均可在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,弓形蟲病為B類國際貿易中的其他重要疾病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和替代診斷方法。

3.2棘球蚴病 棘球蚴病又稱包蟲病,病原為棘球絳蟲(棘球絳蟲的幼蟲稱棘球蚴),屬第四類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗均可在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,棘球蚴病為B類多種動物共患病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和替代診斷方法。

3.3日本血吸蟲病 日本血吸蟲病的病原為日本血吸蟲病,屬第三類動物病原微生物,病原分離培養和動物感染實驗需在二級實驗室條件下開展,未經培養的感染性材料和滅活材料實驗僅需在一級實驗室條件下開展。日本血吸蟲病未收錄進《OIE 陸生動物衛生法典》。

我國主要現行檢測標準見表1。日本血吸蟲病未收錄進《國際動物衛生法典》。

3.4旋毛蟲病 旋毛蟲病的病原為旋毛蟲,屬第四類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗均可在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,旋毛蟲病為B類多種動物共患病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》指定其診斷方法為病原鑒定,指定替代診斷方法為ELISA法。

3.5囊尾蚴病 囊尾蚴病的病原為豬帶絳蟲的幼蟲,屬第四類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗均可在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,囊尾蚴病為B類牛病、豬病和國際貿易中的其他重要疾病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其替代診斷方法,其指定診斷方法為病原鑒定法。

3.6片形吸蟲病 片形吸蟲病的病原為片形吸蟲(復殖目片形科片形屬,主要為:肝片吸蟲和大片形吸蟲),屬第四類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗均可在一級實驗室條件下開展。片形吸蟲病未收錄進《OIE 陸生動物衛生法典》。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和替代診斷方法。

3.7利什曼原蟲病 利什曼原蟲病的病原為利什曼原蟲屬原蟲,屬第四類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗均可在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,利什曼原蟲病為B類多種動物共患病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法,指定替代診斷方法為病原鑒定。

3.8華支睪吸蟲病 華支睪吸蟲病的病原為華支睪吸蟲(復殖目后睪科支睪屬),屬第四類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗均可在一級實驗室條件下開展。華支睪吸蟲病未收錄進《OIE 陸生動物衛生法典》。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和指定替代診斷方法。

除表內經典的病原學診斷外,主要還有分子生物學診斷方法(包括:PCR法、LAMP、熒光PCR法和數字PCR法等)、免疫學診斷(包括:染色試驗、間接血凝試驗、凝集試驗、間接熒光抗體試驗、ELISA法、膠體金法等)。由于這些方法原理基本相同,特定基因、蛋白的改變,且很多尚未標準化、商品化,本文不作一一贅敘。

4 其他疫病

4.1牛海綿狀腦病 牛海綿狀腦病的病原為朊病毒,屬第一類動物病原微生物,其相關實驗活動(病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗)均需在三級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,牛海綿狀腦病為B類牛病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和替代診斷方法。

牛海綿狀腦病為外來疫病,其檢測主要集中于出入境檢疫環節。何儉和彭鈺欣等的論文顯示,除表內方法外,還有小鼠接種試驗、電鏡檢查和ELISA等方法。兩研究均認為因存在300 d的潛伏期,小鼠試驗實用性差;腦切片HE染色鏡檢法對檢驗人員經驗要求較高;電鏡法僅適用于新鮮或僅經冷凍處理過的腦組織樣本;而免疫組化法和免疫轉印法有相對較高的準確性。

4.2Q熱 Q熱的病原為伯納特柯克斯體(一種專性細胞內寄生菌),屬第四類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗、未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗均可在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,Q熱為B類多種動物共患病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法,指定替代診斷方法為補體結合試驗。

目前,鮮有Q熱病的新的血清學檢測技術研究報道,基于分子生物學的病原學檢測中PCR、LAMP、重組酶聚合酶擴增、基因芯片等檢測技術則不斷被引入。

4.3鉤端螺旋體病 鉤端螺旋體病的病原為致病性鉤端螺旋體,屬第三類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗需在二級實驗室條件下開展,未經培養的感染性材料實驗和滅活材料實驗則可在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,鉤端螺旋體病為B類多種動物共患病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法,指定替代診斷方法為顯微凝集試驗。

現有文獻顯示,除病原學和血清學診斷方法外,PCR、熒光PCR、基因芯片等分子生物學技術也被應用于鉤端螺旋體的診斷和分型。

4.4鸚鵡熱 鸚鵡熱(現行標準用名還涉及:禽衣原體病)的病原為鸚鵡熱衣原體,屬第三類動物病原微生物,病原分離培養、動物感染實驗和未經培養的感染性材料實驗需在二級實驗室條件下開展,滅活材料實驗可在一級實驗室條件下開展。按照《OIE 陸生動物衛生法典》的分類,鸚鵡熱(禽衣原體病)為B類禽病。

我國主要現行檢測標準見表1。《國際動物衛生法典》尚未指定其診斷方法和替代診斷方法。

根據韓娥等的綜述,鸚鵡熱基因檢測方法中新出現了DNA微陣列技術,乳膠凝集、原生小體凝集、間接血凝、膠體金等血清學檢測方法也先后被引入,且膠體金技術已獲新獸藥證書。

5 展望

隨著全球人流和物流不斷加深,加之動物的跨地域遷徙、病毒的不斷變異,人畜共患傳染病的防控壓力也不斷加大。在新形勢下,防疫基層一線、養殖主體合理科學地根據實際情況選擇相應的檢測技術勢在必行,復核確診單位則需選擇相對權威的符合生物安全防控要求的檢測方法和確診標準,使更大范圍內對疫情的處置措施更加科學、合理和嚴謹。在新的檢測技術研究、檢測標準制訂、試劑盒研發工作者的共同努力和不懈奮斗下,我國人畜共患傳染病的防控工作必將走上更高的臺階。