杜仲多糖的提取分離純化、結構特征及其藥理活性研究進展

王 瑞，王景媛，郭 敏，鄒俊波，王智超，欒 飛*，翟思程*

1. 陜西科技大學鎬京學院，醫藥工程學院，陜西 咸陽 712046

2. 陜西中醫藥大學藥學院，陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046

杜仲為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮和葉，是我國傳統藥材，具有2 000多年的藥用歷史，主產于陜西、甘肅和河南等地?！渡褶r本草經》中將其列為上品，性溫，味甘，歸肝、腎經，具有補肝腎、強筋骨、安胎等功效，臨床用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈目眩、妊娠漏血和胎動不安的治療[1-2]。杜仲是雌雄異株，其地上部分，包括樹皮、葉子和雄蕊花，均被用于醫療[3]?，F代藥理研究表明，杜仲粗提取物及其活性單體在體內、外實驗中具有廣泛的藥理活性，可用于預防和治療抑郁癥[4]、糖尿病腎病[5]、肌肉老化[6]、急性肝炎[7]、炎性疾病[8-10]、急性肺損傷[11-12]、高脂血癥[13]、高血壓[14]、骨質疏松癥[15]、骨關節炎[16]、阿爾茨海默病[17]、肥胖[18]和免疫功能低下[19]等多種疾病。其主要包括環烯醚萜類、多糖類、木脂素類、黃酮類、酚酸類、萜類和甾體類等多種化學成分[20]。近年來，杜仲多糖被認為是杜仲中最主要的生物活性成分之一，具有調節免疫、抗骨質疏松、降血糖、調血脂、抗炎鎮痛、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗肝纖維化和心血管保護活性等藥理活性。因此，本文聚焦近年來國內外對杜仲多糖的研究進行歸納與總結，綜述了杜仲多糖的提取分離純化方法、結構特征、藥理活性及其潛在機制，為杜仲多糖的深入研究與相關產品開發提供理論依據。

1 杜仲多糖的提取方法

多糖的提取方法多種多樣，可根據多糖性質選擇不同的提取方法。目前，常用提取杜仲多糖的方法有溶液提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等。提取過程的料液比、溫度、時間、萃取介質、超聲功率、微波功率等條件均會影響多糖得率，故通常采用單因素和響應面法進一步對提取工藝進行優化提高多糖得率。

1.1 熱水提取法

Hong 等[21]通過響應面法優化杜仲多糖的提取參數，得到的最佳提取條件為提取時間80 min、料液比1∶3（g∶mL）和提取3 次，此時多糖得率最高。閆芝茜等[22]通過單因素試驗結合響應面實驗考察液料比、提取時間、提取次數及乙醇體積分數對杜仲多糖得率的影響，得到杜仲多糖提取的最佳提取工藝為料液比1∶20（g∶mL）、提取3 h、提取3次、乙醇體積分數60%，杜仲多糖得率為4.79%。朱琳等[23]在單因素試驗的基礎上，將料液比、提取時間、乙醇濃度結合響應面法，進一步優化提取條件，得出最佳的提取參數為料液比1∶60（g∶mL）、提取時間40 min、乙醇濃度60%，杜仲多糖得率為44.53%，為最高提取率。戚曉淵等[24]采用均勻設計法和多元回歸分析法優化杜仲多糖的最佳提取工藝條件，得到優化后的提取參數為料液比 1∶5（g∶mL）、提取溫度100 ℃、提取時間7 h、此時杜仲多糖的最大得率為8.231%。曾橋等[25]采用單因素結合響應面法優化杜仲葉茯磚茶多糖提取工藝，得到其最佳提取工藝條件為料液比1∶25（g∶mL）、提取時間1.5 h、提取溫度51 ℃，在該最佳條件下，杜仲葉茯磚茶多糖的得率為8.48%。

1.2 超聲波輔助提取法

楊申明等[26]采用單因素和正交試驗對杜仲板皮多糖提取參數進行了優化，得到較佳的提取工藝參數為料液比1∶30（g∶mL），超聲溫度50 ℃，超聲功率400 W，超聲時間30 min，杜仲板皮多糖的平均提取率為2.16%。夏樹林等[27]采用正交試驗優化超聲波提取杜仲多糖的最佳條件，結果發現在超聲功率為250 W，提取溫度為80 ℃，提取時間40 min，料液比1∶35（g∶mL），提取次數2 次，杜仲多糖得率為4.892%。為了提高杜仲葉多糖的提取效率，陳雪花等[28]采用超聲波-協同酶法提取杜仲葉多糖并對其工藝條件進行優化，通過Plackett-Burman 實驗篩選發現pH 值、超聲波功率和復合酶添加量是影響多糖得率的主要因素。通過Box-Behnken 實驗結果顯示，超聲波-協同酶法提取杜仲葉多糖的最佳工藝條件為復合酶添加量3.7%、pH 4.0、超聲波功率100 W、提取時間15 min、提取溫度45 ℃和料液比1∶20（g∶mL），其多糖得率為4.79%，與理論得率4.87%接近。

1.3 微波輔助提取法

冀經倫等[29]報道采用單因素和正交試驗法優化微波輔助提取法提取杜仲籽殼中酸性多糖的工藝條件，得到最佳的提取條件為微波功率640 W、微波時間90 s，NaOH 體積分數3%和浸泡時間90 min，其酸性多糖提取率達到6.35%。該提取工藝極大縮短了提取時間，操作更加便捷，提高了杜仲籽殼的利用效率。Xu 等[30]采用微波誘導技術結合響應面法對杜仲葉多糖的提取工藝進行優化。結果發現，在74 ℃條件下，料液比1∶29（g∶mL），微波提取15 min，杜仲葉多糖得率最高，可達到12.31%，與預測值接近，比傳統熱回流提取法的多糖得率提高2.9 倍。陳艷萍等[31]通過研究超聲波結合微波輔助提取杜仲葉多糖的最優工藝條件。Plackett-Burman 試驗結果表明，料液比、提取時間和提取溫度為關鍵影響因素。Box-Behnken 試驗結果得到杜仲葉多糖最佳提取工藝為料液比1∶30（g∶mL）、超聲功率為130 W、提取溫度為49 ℃、微波功率為200 W 和提取時間為20 min，杜仲葉多糖的實際得率為4.02%，與理論得率4.08%接近。

1.4 其他方法

除上述幾種方法，也有研究者采用其他方法提取杜仲多糖。齊善厚等[32]采用閃式提取法提取杜仲葉中的多糖并對其提取工藝參數進行研究，發現提取次數、時間、電壓和料液比均對提取率有不同程度的影響，經優化后得到最佳提取工藝參數，即料液比1∶30（g∶mL）、提取電壓160 V、提取時間60 s 和提取次數2 次，其多糖得率可達3.36%。

對現有幾種提取方法的比較可以得出，不同的提取方法導致杜仲多糖的得率有所差異。與熱水提取法相比，采用超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和閃式提取法提取杜仲多糖的得率甚至低于熱水提取法。此外，目前報道的幾種提取方法對杜仲多糖的得率仍然相對較低，為適應杜仲多糖的工業化生產，需要進一步開發更高效的提取技術，加速杜仲多糖在功能性食品和醫藥領域的應用。如采用多種方法協同提取杜仲多糖值得研究者進一步深入研究。綜上，鑒于熱水提取法工藝簡便、易于操作、成本較低、提取率較高，在后續杜仲多糖的大生產上可考慮使用。

2 杜仲多糖的分離與純化方法

采用上述方法提取得到的杜仲粗多糖通常含有大量的色素、蛋白質和無機鹽等雜質，影響后續結構表征及活性研究，因此需要進一步脫脂、去除色素、脫蛋白及分離多個多糖組分。目前，杜仲多糖脫蛋白方法主要有Sevage 法、三氯乙酸法和鹽酸法，多糖脫色素方法主要有過氧化氫法和活性炭法。黃偉等[33]通過實驗測得鹽酸法、三氯乙酸法和Sevage 法脫蛋白率分別為 95.76%、93.23%和91.48%，而多糖保留率則分別為30.44%、40.29%和65.49%。從以上結果可知，鹽酸法脫蛋白率最高，但鹽酸可能導致多糖降解，使多糖保留率降低。而三氯乙酸法和Sevage 法脫蛋白率比較接近，但三氯乙酸法多糖保留率相比Sevage 法低很多，因此Sevage 法為杜仲葉多糖最佳脫蛋白方法。其次，采用過氧化氫方法對杜仲葉多糖脫色的效果顯著優于活性炭方法。閆芝茜等[22]采用Sevage 法（正丁醇-三氯甲烷4∶1）進行脫蛋白，再利用Sephadex G-200 凝膠柱進行洗脫，經純化后得到杜仲葉多糖的總糖質量分數為89.12%、蛋白質質量分數為2.03%、糖醛酸質量分數為9.45%。楊申明等[26]利用正交試驗優化活性炭對杜仲板皮多糖脫色，得到最佳的脫色條件為活性炭用量為0.6%、脫色溫度為60 ℃、脫色時間為50 min 和脫色溶液pH 5.0，平均脫色率為76.20%和多糖平均保留率為62.68%。大孔樹脂純化法是同時將蛋白和色素去除的方法，能較大程度上減少多糖損失。張濤濤[34]以該方法純化杜仲多糖，通過單因素與正交試驗得到最佳純化條件即采用質量濃度為0.6 mg/mL 和pH 值為6 的杜仲多糖提取液，再以1.0 mL/min 上樣至AB-8 型大孔樹脂吸附后，用65%乙醇溶液150 mL，以體積流量1.0 mL/min 洗脫，產物多糖質量分數由10.2%提高至35.8%，為純化前的3.5 倍，同時可顯著增強動物的抗運動性疲勞能力。然而，單靠一種方法純化多糖并不能達到后續結構表征和活性研究的要求，要想得到相對分子質量和極性均一的杜仲多糖對于其后續研究至關重要，需進一步經過離子交換柱色譜法和葡聚糖凝膠色譜法純化出多種杜仲多糖組分，最終得到純杜仲多糖。

3 杜仲多糖的結構特征

對多糖的結構特征解析極其重要，因為多糖結構的多樣性直接決定其生物活性[35]。多糖的結構特征解析包括單糖組成、相對分子質量、糖苷鍵類型、連接方式及高階結構構象等[36]。杜仲多糖的單糖組成呈多樣化，主要以葡萄糖（glucose，Glc）、果糖（fructose，Fru）、甘露糖（mannose，Man）、巖藻糖（fucose，Fuc）、半乳糖（galactose，Gal）和阿拉伯糖（arabinose，Ara）為主，此外還含有少量的木糖、鼠李糖（rhamnose，Rha）、核糖（ribose，Rib）和半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）等。Cui 等[37]從杜仲葉中分離得到一個具有免疫增強活性的多糖（E.ulmoidesleaf polysaccharide，ELP），采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析其組成，結果顯示ELP 主要由阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖和鼠李糖組成，并含有少量的葡萄糖。Song 等[38]從杜仲皮中分離得到一個酸性多糖（EuOCP3），采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化法和凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）解析其單糖組成和相對分子質量，發現EuOCP3 主要由阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖和巖藻糖8 種單糖組成，其相對分子量為3.81×104。進一步采用傅里葉變換紅外光譜（fourier transforminfrared spectroscopy，FT-IR）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術對EuOCP3 的基本結構進行測定。結果顯示EuOCP3 主鏈由→4)-α-GalpA-(1→4)-α-GalpA-(1→,→4)-α-GalpA-(1→5)-α-Araf-(1→,→4)-α-GalpA-(1→2)-α-Rhap-(1→,→4)-α-GalpA-(1→5)-α-Araf-(1→2)-α-Rhap-(1→重復片段組成。在→2,3,5)-α-Araf-(1→)的C-2 和C-5 位置取代的側鏈上，有T-β-Araf→和T-β-Araf→4)-GalpA-(1→ 的殘基。黃偉等[33]從杜仲葉中純化得到一個酸性雜多糖EOP-1，高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography ，HPGPC）結果顯示其相對分子質量為6.0×105。進一步采用部分酸水解和甲基化分析結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）技術，對EOP-1 的糖鏈結構進行表征。結果顯示EOP-1 糖殘基主要由D-GalpA、D-Glcp、D-Galp、L-Araf和L-Rhap組成，主鏈由1,4-D-GalpA 連接，為半乳糖醛酸聚糖，側鏈主要由1,4-D-Galp、1,6-DGalp、1,5-L-Araf、1,2-L-Rhap構成，其質量分數比為45.11∶35.90∶0.90∶10.50∶6.90。閆芝茜等[22]采用掃描電子顯微鏡和圓二色譜儀對杜仲葉多糖的形態和結構進行初步分析，并采用熱重分析儀和差示掃描量熱儀對杜仲葉多糖熱穩定性進行研究。結果發現杜仲葉多糖結構為致密、光滑、卷曲的網狀結構，表明該多糖是不含有3 股螺旋結構、純度較高的酸性多糖。在200 ℃以下的環境中具有良好的熱穩定性。綜上，當前從杜仲藥材分離純化出的多糖種類較少，且對其精確結構表征還不完善，有待進一步研究。杜仲多糖的提取、分離純化和結構特征見表1。

表1 杜仲多糖的結構特征信息Table 1 Structural characteristics of E. ulmoides polysaccharides

4 杜仲多糖的藥理活性及其相關機制研究

4.1 免疫調節活性

葉穎霞等[44]發現杜仲葉多糖（polysaccharides fromE.ulmoidesleaves，PsEUL）可增強小鼠腹腔巨噬細胞的清楚能力、吞噬速度及血清中溶血素含量，升高胸腺和脾臟系數，進而對環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠具有保護作用。Feng 等[41]發現杜仲皮多糖（polysaccharides fromE.ulmoidesbarks，PsEUB）處理后能增加樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）MHC I/II、CD80、CD40 和CD86 的表達，顯著增強淋巴細胞增殖和細胞因子白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）和γ 干擾素的產生，提示PsEUB 能夠誘導DCs 成熟。結果表明，PsEUB 可以顯著增強口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）特異性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、IgG1、IgG2a和IgG2b抗體滴度和T 細胞增殖，暗示PsEUB可能是一種強大的免疫刺激劑。為了提高PsEUL 誘導抗原卵清蛋白（ovalbumin，OVA）免疫應答的佐劑活性，Feng 等[45]采用N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸法將PsEUL 與OVA 偶聯，制備一種新型遞送系統（PsEUL-OVA）并探討其免疫調節作用。體外結果發現，PsEUL-OVA 200 μg/mL 能增加巨噬細胞增殖并提高其吞噬效率。體內研究發現，PsEUL-OVA 能顯著提高OVA 特異性抗體（IgG、IgG1、IgG2a 和IgG2b）的滴度和細胞因子（IL-2、IL-4、IL-6）的水平。此外，PsEUL-OVA 能激活T淋巴細胞并促進DCs 成熟。由于PsEUL-OVA 的釋放率和抗原呈遞效率相對較低，Feng 等[46]進一步采用植烷三醇和F127 將PsEUL-OVA 進行封裝，得到另1 種新型遞送系統PsEUL-OVA 立方體（PsEULOVA cubosomes，PsEUL-OVA/Cubs），探討其免疫調節活性。結果發現，PsEUL-OVA/Cubs 被巨噬細胞快速吞噬，上調巨噬細胞增殖，刺激細胞因子的產生。體內結果發現PsEUL-OVA/Cubs 能顯著增加IgG 等的滴度和細胞因子水平。PsEUL-OVA/Cubs 能促進脾臟CD8+和CD4+T 細胞分化和DCs 成熟，提示PsEUL-OVA/Cubs 通過增強DCs 和巨噬細胞的吞噬活性進而和提高抗原呈遞效率來刺激細胞和體液免疫反應，效應顯著優于PsEUL-OVA。提示PsEUL 能促進巨噬細胞和DCs 的吞噬活性來誘導體液和細胞免疫反應，具有改善免疫反應的潛力，并為新型遞送系統的設計提供了理論基礎。Cui 等[37]研究發現PsEUL 能顯著增加環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的脾臟指數和胸腺指數，升高白細胞和淋巴細胞的密度，增強巨噬細胞的吞噬能力和升高IL-2、IL-4、γ 干擾素和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，顯示出明顯的免疫增強活性，其機制可能與激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路有關。陳蕾[47]分別采用水熱法和微波輔助法提取杜仲葉和皮中的多糖，命名為EUSP1、EUSP2、EUOP1 和EUOP2，并探討其免疫活性。結果發現，微波輔助提取法較水熱提取法能明顯提高多糖產量，且葉中多糖EUOP1 和EUOP2 產量顯著高于皮中獲得的EUSP1 和EUSP2。4 種多糖均可提高健康男性血清中IL-2、IL-4、IgG 和IgM 含量，提高機體免疫應答能力，從而提高運動人體免疫機能。

此外，DEC-205 受體介導的樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）靶向納米脂質體是一種很有前景的遞送系統，可激發針對病原體的免疫反應。當該遞送系統同時攜帶抗原和免疫調節劑時，可有效調節DCs 功能及T 細胞的初始反應。Feng 等[48]將OVA 和杜仲多糖包封在長環納米脂質體中，并與抗DEC-205 受體抗體偶聯，獲得了針對DEC-205的納米脂質體（anti-DEC-205-EUPs-OVA-LPSM），并研究其免疫調節作用，評價其靶向效率。體外結果表明，anti-DEC-205-EUPs-OVA-LPSM 160 μg/mL能促進DCs 增殖，提高其吞噬效率。體內結果顯示，anti-DEC-205-EUPs-OVA-LPSM 顯著提高了OVA特異性IgG 和IgG 同型水平，增強脾細胞增殖，誘導自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）和細胞毒性淋巴細胞（cytotoxic lymphocytes，CTLs）的細胞毒性。anti-DEC-205-EUPs-OVA-LPSM 還能促進DCs 的成熟，提示DEC-205 受體抗體結合的杜仲多糖納米脂質體可以作為一種有效的抗原遞送系統，通過促進DCs 成熟來增強細胞和體液免疫反應，具有作為免疫增強劑和抗原遞送系統的巨大潛力。而且，Feng 等[49]將杜仲多糖包封至PLGA 納米顆粒（PLGA nanoparticles，NPs）中，與抗CD205 單克隆抗體偶聯，制備出靶向DEC-205 受體的PLGA 納米顆粒（anti-DEC-205-EUPs-PLGA NPs），研究其對手足口病毒的影響。結果發現，anti-DEC-205-EUPs-PLGA NPs 200 μg/mL 可顯著促進DCs 增殖和成熟，提高抗原攝取活性。在FMDV 誘導的免疫小鼠模型中，anti-DEC-205-EUPs-PLGA NPs 100 μg 能顯著控制藥物和抗原釋放、誘導持續免疫反應、改善輔助性T 細胞1（helper T cell 1，Th1）和Th2 型細胞因子的分泌、增加T 細胞亞上調FMDV 特異性IgG 抗體水平、促進CTLs 和NK 細胞的細胞毒活性，促進脾細胞增殖。提示anti-DEC-205-EUPs-PLGA NPs通過促進DCs 的成熟來誘導體液和細胞免疫活性，為疫苗佐劑研發提供新的思路。杜仲多糖發揮免疫調節活性的潛在機制見圖1。

圖1 杜仲多糖免疫調節活性的潛在機制示意圖Fig. 1 Schematic representation of underlying mechanism of immunoregulatory activity of E. ulmoides polysaccharides

4.2 骨保護活性

骨免疫環境在骨再生過程中發揮著不可或缺的作用，直接決定后續的骨生成和骨整合。為開發一種具有骨再生潛力的新型骨免疫調節生物材料，Deng 等[40]合成了鍶化杜仲多糖（srontiumE.ulmoidespolysaccharides，EUPs-Sr）并探討其骨免疫調節活性。結果發現EUPs-Sr 可以抑制炎癥因子和破骨細胞因子的生成，增強RAW264.7 細胞成骨因子的表達，提示EUPs-Sr 有望成為一種有前途的免疫調節骨修復候選物，具有為骨骼組織工程創造積極的促再生環境的能力。 聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）是一種有前景的骨植入聚合物材料，具有與天然皮質骨組織匹配的機械性能。為改善PEEK 生物活性，Zhang 等[50]通過聚多巴胺涂層將EUPs-Sr 引入PEEK 表面，形成具有生物活性的 DPEEK@EUPs-Sr，發現 DPEEK@EUPs-Sr 能有效促進鼠胚胎成骨細胞前體MC3T3-E1 細胞增殖并增強細胞黏附，下調炎癥相關基因IL-1β、IL-18和基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的表達及上調成骨基因如Runt 相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）和I 型膠原蛋白-α1（collagen type I-α1，Col1-α1）的表達，顯示出抗炎和骨形成等雙重活性，具有開發成為骨修復材料的潛力。最新研究發現EUPs-Sr 改性鈦種植體（Ti-EUP-Sr）能促進人牙槽骨成骨HABOBs 細胞增殖并上調成骨相關基因如RUNX2、堿性磷酸酶、骨橋蛋白、骨鈣素的表達水平，改善成骨性能，具有顯著的骨免疫調節活性，為未來的多糖修飾金屬/無機表面的研究提供有益的基礎[51]。

Sun 等[52]發現杜仲多糖在體內、外實驗均顯示良好的骨關節炎保護活性。杜仲多糖能促進巨噬細胞增殖，抑制炎癥相關基因IL-6、IL-18和IL-1β的表達，促進成骨和軟骨相關基因骨形態發生蛋白-6（bone morphogenetics protein-6，BMP-6）、精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的表達。杜仲多糖能顯著減輕兔關節軟骨的破壞程度、增加軟骨下松質骨密度及小梁骨的數量和厚度、降低國際骨關節炎研究學會評分和小梁骨的分離度。此外，杜仲多糖可減少M1極化的巨噬細胞，增加M2極化的巨噬細胞。以上結果提示杜仲多糖能促進關節軟骨修復和軟骨下骨重建，進而延緩骨關節炎進展，其機制可能與調節巨噬細胞的極化狀態有密切關系[52]。Song 等[38]發現在地塞米松誘導的骨質疏松癥小鼠模型中，EuOCP3 可顯著增加小鼠質骨厚度和礦化骨面積及成骨細胞的數量，并減少皮質骨表面破骨細胞的數目，改善腸道菌群結構，其機制與調控細胞外信號調節激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）/c-Jun 氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）/核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）信號通路，進而增強成骨功能和恢復骨代謝有關。李寧博等[53]研究表明，杜仲多糖預處理可顯著增加IL-1β 誘導的小鼠軟骨ATDC5 細胞增殖，抑制其凋亡、炎癥反應和基質降解，進而減輕ATDC5 細胞損傷，其機制可能與抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NFκB）通路的激活有關，具有開發為治療骨關節炎藥物的潛在價值。綜上，杜仲多糖發揮骨保護活性的潛在機制見圖2。

圖2 杜仲多糖骨保護活性的潛在機制示意圖Fig. 2 Schematic representation of underlying mechanism of bone protective activity of E. ulmoides polysaccharides

4.3 降血糖和調血脂活性

郎茜等[54]研究表明，PsEUL 能降低鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）致糖尿病大鼠模型的空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）和尿素氮，增加谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，減少丙二醛含量，并下調半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、p38 MAPK 和TGF-β1 等蛋白表達，具有一定的降血糖和抗氧化作用。許碧琪等[55]研究發現，杜仲多糖可顯著降低STZ 聯合高脂飲食誘導的糖尿病小鼠的FBG，其機制可能與增強機體抗氧化因子活性，減少氧化應激對胰腺的損傷，進而減輕胰腺組織損傷。陳小娟等[56]研究報道，杜仲多糖對自發性2 型糖尿病db/db 小鼠表現的肥胖、高血糖、高血脂和肝損傷均具有較好的改善作用，其機制可能與調控炎癥反應及氧化應激水平密相關。

蘇卓等[57]發現給予STZ 致糖尿病小鼠模型杜仲多糖后，小鼠體內FBG、總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterin，LDL-C）水平明顯降低，高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterin，HDL-C）水平、空腹胰島素和胰島素敏感指數明顯升高，血清IL-6、IL-8 和TNF-α 含量明顯減少，且胰腺組織中Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和NFκB 蛋白表達顯著下調，表明杜仲多糖具有降血糖和調血脂作用，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路介導的胰島細胞功能，改善胰島素水平有關。Tang 等[58]研究發現杜仲多糖可呈劑量相關性增加棕櫚酸誘導的人肝癌HepG2 細胞的糖攝取，促進肝糖原的合成，上調葡萄糖轉運蛋白2（glucose transporters 2，GLUT2）和GLUT4 的表達，進而改善胰島素抵抗，其機制可能與上調胰島素受體底物-1/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β 信號通路有關。雷燕妮等[59]研究表明，ig PsEUL 可顯著減少高脂血癥小鼠模型血清中總膽固醇、三酰甘油、LDL-C、脂蛋白a、載脂蛋白B 和糞便總膽汁酸的含量，增加HDL-C 和載脂蛋白A的含量，降低動脈硬化指數和冠心指數，肝臟組織中總膽固醇和三酰甘油含量亦顯著減少，提示PsEUL 可有效調節血脂水平和肝臟脂質代謝，較好地促進膽汁酸排泄，顯示出良好的調血脂活性。綜上，杜仲多糖發揮降血糖和調血脂活性的潛在機制見圖3。

圖3 杜仲多糖降血糖和調血脂的潛在機制示意圖Fig. 3 Schematic representation of underlying mechanism of hypoglycemic and hypolipidemic activities of E. ulmoides polysaccharides

4.4 抗炎和鎮痛活性

在脂多糖誘導的敗血癥小鼠模型中，杜仲多糖1 能有效減輕肺損傷，抑制炎性細胞因子的表達，提高動物存活率，但是具體的機制尚未闡明[41]。多糖納米顆粒作為藥物輸送系統可以更好地發揮藥效。Ye 等[60]首次采用杜仲多糖對納米硒顆粒（nanoselenium particle，SeNP）進行改性，得到粒徑170 nm 的EUPs-SeNP，并探討其對3%葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎的影響。結果表明，EUPs-SeNP 治療能恢復結腸炎小鼠的體質量減輕、降低疾病活動指數、改善腸道通透性、調節腸道微生物群組成、增加結腸抗氧化能力、修復腸道屏障功能、調節腸上皮細胞凋亡和增殖及炎癥細胞因子表達。體外實驗結果發現EUPs-SeNP 能明顯抑制脂多糖誘導的腸上皮細胞系TRL-4/NF-κB 信號通路的激活。江增宏等[61]研究發現EUPs 具有明顯的鎮痛作用，杜仲多糖能夠顯著抑制慢性嗎啡耐受小鼠的進展，下調慢性嗎啡耐受小鼠脊髓水平炎癥因子如IL-1β等mRNA 水平，其機制與抑制脊髓促炎癥因子和細胞因子釋放有關。此外，杜仲多糖對坐骨神經慢性壓迫模型（chronic constriction injury，CCI）大鼠也具有明顯的鎮痛活性，杜仲多糖單次給藥能顯著降低CCI 誘導的大鼠機械學痛覺超敏，延長鎮痛時間，下調CCI 大鼠脊髓活化的p-JNK 和p-ERK 的蛋白水平，而杜仲多糖連續給藥則能抑制CCI 誘導的神經膠質纖維酸蛋白的表達，提示杜仲多糖發揮鎮痛活性與抑制星形膠質細胞活化和JNK/ERK/MAPK信號通路有關，但其具體機制仍需要進一步研究探索[62]。綜上，杜仲多糖發揮抗炎和鎮痛活性的潛在機制見圖4。

圖4 杜仲多糖抗炎和鎮痛的潛在機制示意圖Fig. 4 Schematic representation of underlying mechanism of anti-inflammatory and antinociceptive activities of E. ulmoides polysaccharides

4.5 抗氧化活性

大量研究表明杜仲多糖可顯著提高SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）、GSH-Px 和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性，降低丙二醛含量，對缺血再灌注損傷誘導的家兔腎臟氧化損傷具有抑制作用[21]。Gao 等[63]研究表明杜仲多糖可顯著降低血清丙氨酸氨基轉移酶（ alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、高遷移率族蛋白B1、IL-1β、TNF-α 和丙二醛水平，提高SOD 活性，減輕肝臟病理性改變，從抗炎和抗氧化角度對肝缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用，其機制與減少活性氧水平和抑制TLR4/NF-κB 通路激活有關。雷燕妮等[64]采用水提醇沉法提取杜仲葉多糖并以DEAE-52 色譜柱進行純化得到EFPs-1 和EFPs-2，進一步評價其抗氧化活性。結果發現EFPs-1 和EFPs-2均能劑量相關性清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH）、、和2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽 （ 2,2-azinobis-3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）等自由基，且EFPs-2 作用比EFPs-1強。EFPs-1 對上述自由基體系的半數有效濃度（median effective concentration，EC50）分別為3.393、5.259、3.692和2.463 mg/mL，EFPs-2的EC50為2.379、2.893、2.516 和2.066 mg/mL。劉夢培等[65]研究了動態 高 壓 微 射 流 （ dynamic high pressure microfluidization，DHPM）對杜仲雄花多糖（E.ulmoidesmale flower polysaccharides，EUMFPs）溶液粒徑、結構及抗氧化能力的影響。結果顯示，DHPM 處理后的EUMFPs 溶液，其粒徑逐漸減小，從0 MPa 的449.5 nm 降低到140 MPa 的370.4 nm，而EUMFPs 結構無明顯變化，但其抗氧化能力逐漸增強。直到壓力達到140 MPa 時，羥自由基、ABTS和DPPH 等自由基的清除率增幅依次為15.1%、16.2%和40.7%，其中DPPH清除率最高，為EUMFPs作為一種新的抗氧化劑的研發提供理論支撐，也為DHPM 在多糖改性上的應用提供參考依據。綜上，杜仲多糖發揮抗氧化的潛在機制見圖5。

圖5 杜仲多糖抗氧化的潛在機制示意圖Fig. 5 Schematic representation of underlying mechanism of antioxidant activity of E. ulmoides polysaccharides

4.6 抗疲勞和抗衰老活性

夏樹林等[27]研究發現，在電刺激誘導的蟾蜍肌肉疲勞模型中，杜仲多糖能明顯延長肌肉收縮持續的時間，并延緩肌肉疲勞的發生，具有明顯的抗疲勞作用，其具體機制有待進一步深入研究。王一民等[66]研究指出，在小鼠游泳模型中，杜仲多糖能明顯增加小鼠的體質量，延長游泳力竭時間，降低血清中肌酸激酶活性和尿素氮含量，發揮明顯的抗疲勞活性，其機制可能與其調節機體糖代謝和抗氧化能力有關。腸道菌群被認為在人體免疫和健康中發揮著關鍵作用。衰老過程改變了微生物群的組成，這與炎癥、活性氧、組織功能下降和與年齡相關疾病的易感性增加有關。Wei 等[39]研究發現在發育過程中給予杜仲多糖能通過上調Kelch 樣ECH 相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/Nrf2 信號通路顯著延長果蠅的壽命，減少年齡相關的活性氧積累，并能抑制老年果蠅腸道內葡萄糖桿菌、普羅維頓菌和腸桿菌科細菌的相對豐度。其中，微生物群中葡萄糖桿菌、普羅維登斯菌和腸桿菌科的增加可能會導致果蠅年齡相關的腸道功能障礙，縮短其壽命。此外，杜仲多糖還能有效改善年齡引起的衰退，如運動活性和繁殖力，其延壽作用機制主要是通過重塑腸道菌群失調來實現的。因此，杜仲多糖在保健品領域可開發益生元劑來預防衰老相關的腸道生態失調和反應性氧化應激。

4.7 抗肝纖維化活性

周程艷等[67]研究指出，在CCl4致肝纖維化大鼠模型中，杜仲多糖能明顯增加肝纖維化模型大鼠肝臟和脾臟指數，減少血清ALT、AST、透明質酸、層黏連蛋白、III 型前膠原、IV 型膠原和球蛋白含量，升高總蛋白和白蛋白的含量，降低肝組織中丙二醛水平和羥脯氨酸水平，亦能升高肝組織SOD 和GSH-Px 活性，降低肝組織中TGF-β1 蛋白的表達，杜仲多糖顯示出良好的抗肝纖維化作用，其機制與抗氧化、抑制膠原增生、調節TGF-β1 水平等有關。王乾宇等[68]進一步證實報道，杜仲多糖能通過抑制肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）大鼠肝臟組織的I、III型膠原蛋白、金屬蛋白酶組織抑制因子-1及TGFβ1mRNA 表達，上調MMP1mRNA 表達，減少細胞外基質沉積，進而對CCl4聯合高脂飲食誘導的大鼠肝臟纖維化具有保護作用。

4.8 心血管保護活性

杜仲多糖還顯示出良好的心血管保護活性。研究表明，杜仲多糖能通過減少心肌酶譜肌酸激酶、肌酸激酶同功酶、乳酸脫氫酶和AST 的水平，提高SOD 活性并降低丙二醛含量，增強自由基清除能力、減少脂質過氧化物形成，從抗氧化角度對兔心肌缺血再灌注損傷具有較好的保護作用[69]。鄧華[70]研究發現，杜仲多糖能顯著抑制氧化型低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌VSMC 細胞的增殖和遷移，減少TNF-α 和IL-6 的分泌，同時能顯著下調細胞周期蛋白D1 和細胞周期蛋白依賴激酶2 蛋白表達，其機制可能與抑制TGF-β1/Smad 信號通路的活化而發揮作用。以上結果均提示杜仲多糖可為肝臟相關疾病和心血管疾病的預防及治療提供新的靶點和方向。

4.9 其他生物活性

除上述報道的生物活性之外，杜仲多糖還顯示出其他生物活性。杜仲多糖能通過減少免疫球蛋白沉積和蛋白尿，減輕腎小球損傷，同時抑制血清自身抗體和總IgG 的增加，對空腸彎曲桿菌誘導的BALB/c 小鼠系統性紅斑狼瘡樣綜合征具有保護作用[71]。沈磊等[72]研究發現，杜仲多糖能通過下調miR-1207-5p 表達，進而抑制腎小管上皮細胞損傷和凋亡及炎癥因子釋放，對高糖誘導的人腎皮質近曲小管上皮HK-2 細胞損傷具有保護作用。杜仲多糖能通過激活Caspase-3 途徑進而抑制小鼠Lewis肺癌LLC 細胞的增殖、侵襲和遷移并誘導肺癌細胞凋亡，發揮抗癌活性[73]。 間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）作為一種基于細胞的治療策略已被廣泛用于治療各種疾病和組織損傷。其中，細胞遞送載體在決定MSC 的治療性能及其植入后的命運方面發揮重要作用。Niu 等[74]發現了1 種新的杜仲多糖生長因子復合物EUP3-血小板源性生成因子-BB（EUP3-platelet-derived growth factor-BB，EUP3-PDGF-BB）并探討其對MSC 和成纖維細胞的影響。結果發現，EUP3-PDGF-BB 在體外可調節PDGF-BB 的活性，促進細胞遷移、增殖和保持細胞干性。進一步將EUP3-PDGF-BB 制成微球，并在微球上植入細胞。結果發現，EUP3-PDGFBB 微球對rMSC 的增殖表現出強有力的影響，并對維持干性具有持久的影響，提示EUP3-PDGF-BB具有調節PDGF-BB 的活性，作為一種有價值的細胞載體在干細胞的遞送中具有廣闊的應用前景。Sun 等[75]研究發現杜仲多糖通過降低肥胖相關指標水平、重塑腸道微生物群和控制色氨酸代謝減輕肥胖飲食誘導的小鼠認知和社會功能障礙，提示杜仲多糖可作為一種新的治療選擇預防神經發育障礙。最新研究表明，慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）破壞了小鼠腸道菌群組成，誘導神經炎癥，引發行為和生理缺陷。而補充杜仲多糖能顯著減輕CUMS 小鼠的生理應激反應，包括菌群失調、腸道通透性增加以及神經炎癥反應。同時，杜仲多糖可恢復CUMS 小鼠的神經發生節律，并表現出行為學測試特異性的抗抑郁和抗焦慮作用，其機制與抑制小膠質細胞介導的TLR4/NF-κB/MAPK 信號通路減輕海馬炎癥有關。這些結果提示杜仲多糖對CUMS 引起的神經炎癥和抑郁樣癥狀有改善作用，可能與其對腸道菌群組成的有益影響密切相關[76]。

5 結語與展望

杜仲作為陜西省“十大秦藥”品種之一，因其“藥食同源”屬性在功能性食品和醫藥方面的健康益處而受到研究者的廣泛關注。以杜仲為原料開發的保健食品種類較多，且劑型豐富，有杜仲飲料、茶飲、口服液、膠囊、顆粒劑和丸劑等，在緩解疲勞、增強免疫、降糖調脂、增加骨密度、改善睡眠和通便等方面效果顯著[77]。Ren 等[78]以杜仲葉超細粉為添加劑，在糯米發酵中，研制了新型保健品杜仲葉甜米酒。該米酒在體外實驗中展現出較強的抗氧化、降血糖和調血脂作用，為杜仲葉的廣泛利用提供依據，增加了甜米酒的品種，從而進一步擴大杜仲的保健食品市場。近年來研究發現，從杜仲皮和葉中分離純化出的多糖憑借其優良的健康活性及較高的營養價值，開發新型生物活性多糖及研發多糖功能性食品和藥物已成為當前研究的熱點。

未來對杜仲多糖的研究應聚焦在以下幾個方面。（1）多糖的生物活性與其提取方法和結構特征密切相關。然而，目前對杜仲多糖的結構特征與活性之前的關系研究缺乏。需要進一步闡明杜仲多糖的高級結構及其與生物活性的多維相關性，以闡明其的構效關系，為深入開發杜仲多糖相關產品奠定基礎。（2）關于杜仲多糖的合成生物學研究很少。提取特異性杜仲多糖合成基因并對其進行靶向修飾以進一步提高其生物活性也是未來研究的重點。而且，通過對杜仲多糖結構修飾或制備杜仲多糖的脂質體和納米制劑等劑型，能有效改善藥理活性和藥物遞送能力，開發其作為藥物載體和傳遞系統等，實現杜仲多糖的進一步分析利用、新藥研發及安全用藥。雖然已經報道了杜仲多糖的多種生物活性，但其在免疫調節、抗骨質疏松、降血糖、調血脂、抗炎鎮痛、抗氧化、抗疲勞和抗衰老及神經保護等方面的活性僅停留在表觀指標測定上，其潛在分子機制值得進一步深入研究。（3）目前對杜仲多糖結構表征文獻較少，與其他植物多糖相比較，無法體現出差異性，導致對杜仲多糖的生物活性的研究主要集中在細胞和動物實驗上，臨床試驗尚更未見報道，極大地限制了其在保健食品和制藥等領域的應用。因此，未來的研究需要利用更先進的技術如宏基因組學和代謝組學等高度跨學科和動態的方法進行更深入的分子機制探討。隨著我國醫療健康產業高速發展及“健康中國2030”的戰略布局下，功能性食品逐漸受到人們的青睞，特別是以杜仲多糖為主要成分的綠色保健食品在增強免疫、骨保護、降血糖、調血脂、抗疲勞和抗氧化等方面擁有廣闊的市場前景和商業價值，可在此領域深入探索挖掘，在食品、保健品及藥品開發領域做出貢獻。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突