羅漢果根多糖的分離純化及免疫活性研究

張 潔 ，張巧鈴 ，盧鳳來，宋靜茹，劉宏偉，蔣小華*

1. 沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016

2. 廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點實驗室，廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006

羅漢果Siraitiagrosuenorii(Swingle) C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang 為葫蘆科羅漢果屬藤本植物，主要分布于我國西南地區(qū)，其果實為廣西的道地藥材。羅漢果始載于《嶺南采藥錄》，1987 年被國家衛(wèi)生部列為首批藥食同源中藥材，其果實為常用的藥用部位，具有止咳化痰、潤腸通便等功效。羅漢果塊根肥大，味苦、性微寒[1]，民間用于治頑癬、癰腫、瘡癤等，具有葫蘆烷型四環(huán)三萜、多糖等活性成分[2-3]。然而，有關羅漢果根的化學成分及藥理活性研究明顯不足，導致其未得到充分利用，每年有大量的根被丟棄，造成極大的資源浪費。

現(xiàn)代研究表明多種植物多糖具有雙向調(diào)節(jié)的免疫作用，一定濃度范圍的多糖可以增強機體的非特異性免疫和特異性免疫[4]。巨噬細胞是機體非特異性免疫的重要組成部分，在炎癥反應和宿主防御中發(fā)揮著重要作用。已有報道表明羅漢果的果實多糖具有抗氧化、保護糖尿病腎病小鼠、增強免疫功能等作用[3,5-6]，而對根多糖的研究較少。本課題組前期通過動物實驗發(fā)現(xiàn)羅漢果根粗多糖可以增加小鼠胸腺器官指數(shù)，推測其具有免疫調(diào)節(jié)的潛力[3]。本實驗通過提取與分離純化，從羅漢果根中獲得均一多糖并進行了初步的結(jié)構(gòu)分析，同時采用巨噬細胞研究其免疫調(diào)節(jié)活性，為羅漢果根多糖的開發(fā)利用提供了新的研究思路與技術儲備。

1 材料

1.1 主要材料與試劑

羅漢果根采自廣西壯族自治區(qū)桂林市永福縣，經(jīng)盧鳳來副研究員鑒定為葫蘆科羅漢果屬植物羅漢果S.grosvenorii(Swingle) C. Jeffrey 的塊根。對照品D-無水葡萄糖（批號MUST-22030214，質(zhì)量分數(shù)＞99%）、D-甘露糖（批號MUST-23012802，質(zhì)量分數(shù)＞99%）、D-核糖（批號MUST-23021307，質(zhì)量分數(shù)＞98% ）、D- 葡萄糖醛酸（ 批號MUST-23021309，質(zhì)量分數(shù)＞98%）、L-鼠李糖（批號MUST-22061104，質(zhì)量分數(shù)＞99%）、D-半乳糖醛酸（批號MUST-23021308，質(zhì)量分數(shù)＞98%）、D-半乳糖（批號MUST-22061105，質(zhì)量分數(shù)＞98%）、DL-阿拉伯糖（批號MUST-22022819，質(zhì)量分數(shù)＞98%），購自成都曼斯特生物科技有限公司；標準品右旋糖酐系列D0（批號140637-201203）、D1（批號140638-201203）、D2（批號140639-201203）、D3 （ 批號 140640-201203 ）、 D4 （ 批號140641-201203）、 D5（批號140642-201203）、D6（批號140643-201203）、D7（批號140644-201203）、D8 （ 批號 140645-201203 ）、 D2000 （ 批號140646-201203），相對分子質(zhì)量（Mw）分別為180、2 500、4 600、7 100、1.0×104、2.14×104、4.11×104、8.44×104、1.338×105、2.0×106，購自中國食品藥品檢定研究院；CCK-8 檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）檢測試劑盒（Ela bscience 公司）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），HPD100 大孔吸附樹脂（賽譜銳思（北京）科技有限公司）；DEAE-52 纖維素（上海源葉生物科技有限公司）；Sephadex LH-20 凝膠（美國GE 公司）；MD55 透析袋 [賽譜銳思（北京）科技有限公司]；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

Waters 515 型液相色譜儀（配置Waters 2410 示差檢測器，Waters 公司）；LC-2030C 型液相色譜儀（日本島津公司）；Nicolet 傅里葉紅外光譜儀（美國Therom Fisher 公司）；Brucker Avance500MHz 超導核磁共振波譜儀（德國Brucker公司）；ALPHA1-2LD PLU 冷凍干燥機（北京博勱行儀器有限公司）；SP-756P 型紫外可見分光光度計（美國Spectrum 公司）；Zeiss EVO18 型掃描電子顯微鏡（德國Zeiss公司）；Spark 酶標儀（瑞士Tecan 公司）；BSP-150型生化培養(yǎng)箱（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；5% CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma 公司）；Dmi1 倒置相差顯微鏡（美國徠卡公司）。

2 方法

2.1 羅漢果根多糖的分離純化

取500 g 干燥的羅漢果根塊粉碎過20 目篩，加入10 倍量的95%乙醇溶液回流脫脂（2 h、2 次），殘渣干燥后，加入4 倍量的水于70 ℃水浴中加熱回流提取（4 h、2 次）。提取液濾過后，合并濾液，55 ℃真空濃縮至原體積的1/4，過AB-8 大孔樹脂脫色，水洗部分濃縮，加入4 倍體積的95%乙醇溶液進行沉淀，4 ℃靜置12 h，4 000 r/min 離心10 min，得到粗多糖LGP。LGP 加水溶解，采用Sevage法[7]脫蛋白，重復5 次，直至無明顯蛋白質(zhì)為止。脫蛋白后的LGP 依次用30%、50%、70%、90%乙醇進行分級醇沉，分別得到LGP1～LGP4。將70%醇沉部位LGP3 溶解上DEAE-52 柱（42 cm×2.1 cm），依次用水和0.05、0.1、0.15、0.3、0.5 mol/L氯化鈉梯度洗脫，體積流量為1.0 mL/min，7 min/管收集，采用苯酚-硫酸法檢測吸光度（A）值，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫峰收集組分，減壓濃縮，透析（截留相對分子質(zhì)量3 000）后冷凍干燥得粗多糖LGP3-1～LGP3-6。0.15 mol/L 洗脫組分LGP3-3 經(jīng)Sephadex LH-20 柱（65 cm×1.4 cm）純化，25%乙醇等度洗脫，體積流量為0.5 mL/min。透析后冷凍干燥得羅漢果根多糖LGP-A。

2.2 LGP-A 結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 純度和相對分子質(zhì)量的測定 采用紫外全波長掃描的方法檢驗多糖的純度。取2.0 mg 干燥樣品溶于純水中，配成0.5 mg/mL 的多糖溶液，以純水作為空白對照。在190～400 nm 進行全波長掃描。

采用高效凝膠色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測定多糖Mw。取干燥LGP-A、D0、D2、D4、D6、D7、D8、D2000等葡聚糖標準品，加水溶解，配成1 mg/mL 的溶液，離心，液相分析[8]。HPLC 條件：TSK-gel G5000PWXL色譜柱（7.8 mm×30 cm，10 μm），流動相為超純水，柱溫為30 ℃，體積流量為0.5 mL/min；RID 10A型示差檢測器，進樣量為20 μL。以保留時間為橫坐標（X），Mw對數(shù)為縱坐標（Y）繪制標準曲線。計算LGP-A 的Mw。

2.2.2 單糖組成分析 采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）-柱前衍生HPLC 測定單糖組成。取多糖樣品1.25 mg，加1.25 mL 2 mol/L 的三氟乙酸溶解，搖勻，封口，110 ℃水解3 h，冷卻后加2 mL甲醇，減壓蒸干，重復5 次以除去多余的三氟乙酸。取多糖樣品和單糖對照品200 μL，加0.5 mol/L 的PMP-甲醇溶液200 μL 和0.3 mol/L 的NaOH 溶液200 μL，于70 ℃烘箱中避光反應100 min 進行衍生化。反應結(jié)束后，冷卻至室溫，加0.3 mol/L 鹽酸溶液250 μL，混勻，加三氯甲烷萃取5 次，棄下層，除去過量的PMP，在10 000 r/min 離心，上清液放入4 ℃保存，待HPLC 檢測[9]。

混合單糖對照品溶液制備：分別吸取已衍生化的1 mg/mL 的單糖對照品溶液各10 μL，混合均勻，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HPLC 條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2）15∶85；柱溫為30 ℃，體積流量為0.8 mL/min，紫外檢測波長為254 nm，進樣量為10 μL。

2.2.3 FT-IR 分析 稱取干燥LGP-A 樣品1.5 mg，干燥溴化鉀150 mg，于真空干燥器干燥過夜。在紅外燈下混合，研磨均勻，壓片，在4 000～400 cm-1進行紅外掃描。

2.2.4 NMR 分析 取樣品LGP-A 約25 mg 溶于0.5 mL D2O 中，用Bruker AVANCE III 500 MHz 超導核磁共振儀測定 1D-NMR（1H- 和13C-NMR）和2D-NMR（HSQC、1H-1H COSY 及HMBC），通過HSQC 對C-H 進行歸屬，1H-1H COSY 連接單糖骨架，HMBC 確定糖的連接方式。

2.2.5 剛果紅實驗 取干燥樣品，加水配成0.5 mg/mL 的多糖溶液，與200 μmol/L 的剛果紅溶液混合均勻。加入適量體積1.0 mol/L 的NaOH 溶液使其最終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L。室溫避光反應10 min，使用紫外分光光度計進行全波長掃描，以NaOH 濃度為橫坐標（X），最大吸收波長為縱坐標（Y）繪制折線圖[10]。

2.2.6 掃描電子顯微鏡（ scanning electron microscope，SEM）分析 稱取1.5 mg 干燥樣品，使用熱場發(fā)射SEM 來分析LGP-A 的微觀形態(tài)。

2.3 LGP-A 對小鼠巨噬細胞RAW264.7 免疫作用的影響

2.3.1 RAW264.7 細胞的增殖實驗 采用CCK-8 法檢測多糖對細胞增殖的影響，選取對數(shù)生長期的細胞，將其調(diào)整為1×105個/mL 接種于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h。給藥組每孔加入不同質(zhì)量濃度的多糖溶液（0.625、1.25、2.5、5.0 μg/mL）、陽性對照組加入1.0 μg/mL 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）溶液、對照組（具有細胞）和背景組（無細胞）加入相同體積的完全培養(yǎng)基，每組3 個復孔，給藥后培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃孵育45 min，酶標儀450 nm 下檢測A值。按下述公式計算細胞增殖率。

細胞增殖率＝(A給藥－A0)/(A1－A0)

A給藥為給藥組平均A值；A0為背景組平均A值；A1為對照組平均A值

2.3.2 RAW264.7 細胞吞噬能力 采用中性紅實驗檢測RAW264.7 細胞吞噬能力，具體方法參考文獻報道[11]，略有改動。

選取對數(shù)生長期的細胞，將其調(diào)整為1×105個/mL 接種于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h。給藥組每孔加入相同體積不同濃度的多糖溶液（0.625、1.25、2.5、5 μg/mL）、陽性對照組加入1.0 μg/mL LPS 溶液、對照組加入相同體積的完全培養(yǎng)基，每組3 個復孔，給藥后培養(yǎng)24 h。棄上清液，磷酸緩沖液（PBS）清洗2 次，每孔加0.05%中性紅溶液100 μL 培養(yǎng)1 h，棄上清液，PBS清洗2 次，加細胞裂解液（冰醋酸-無水乙醇1∶1）100 μL 室溫放置1 h，酶標儀檢測540 nm 下A值。吞噬率采用以下公式進行計算。

吞噬率＝A給藥/A對照

2.3.3 RAW264.7 細胞NO、TNF-α、IL-6 分泌量 采用Griess 法檢測LGP-A 對小鼠巨噬細胞NO 分泌量的影響。細胞培養(yǎng)與給藥方法按“2.3.1”項下進行，給藥后培養(yǎng)24 h。取上清液按試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀檢測540 nm 下A值。

采用ELISA 法檢測LGP-A 對小鼠巨噬細胞TNF-α、IL-6 分泌量的影響。細胞培養(yǎng)、給藥方法同上。按試劑盒說明書進行操作，酶標儀檢測450 nm下A值。

3 結(jié)果與分析

3.1 LGP-A 分離純化

羅漢果根干燥粉末經(jīng)95%乙醇脫脂，70 ℃熱水提取醇沉、脫蛋白后，濃縮，干燥得羅漢果根粗多糖LGP，得率為1.3%（基于羅漢果根原料質(zhì)量計算）。經(jīng)不同的乙醇進行分級醇沉，分別得到LGP1～LGP4。將70%醇沉部位LGP3 上DEAE-52纖維離子交換柱，分別用0.05、0.1、0.15、0.2 和0.5 mol/L 氯化鈉洗脫，采用苯酚-硫酸法檢測A值并繪制吸收曲線（圖1-A），得LGP3-1～LGP3-6。分析后發(fā)現(xiàn)0.15 mol/L 氯化鈉洗脫部位（LGP3-3）分離度較高，選擇該部位繼續(xù)純化。經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜進一步純化，得到1 個均一的羅漢果根多糖LGP-A，得率為0.13%（基于粗多糖質(zhì)量計算）。

圖1 LGP3 的DEAE-52 纖維素 (A) 與Sephadex LH-20(B) 柱色譜純化洗脫曲線Fig. 1 Column chromatography purification elution curves of LGP3 by DEAE-52 (A) and Sephadex LH-20 (B)

3.2 LGP-A 結(jié)構(gòu)表征

3.2.1 純度和相對分子質(zhì)量分析 核酸和蛋白質(zhì)在紫外光譜中的特征吸收峰分別是260、280 nm，因此通過紫外掃描的方法可以確定多糖中蛋白質(zhì)、核酸和肽類等雜質(zhì)的含量。如圖2-A 可看出LGP-A在230 nm 處存在最大吸收，在260～280 nm 未出現(xiàn)明顯吸收峰，表明其不含蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)。LGP-A 經(jīng)HPGPC 法鑒定純度，結(jié)果顯示有一對稱性良好的單一色譜峰，保留時間為10.386 min（圖2-B），說明多糖Mw分布均一。以已測定Mw的葡聚糖對照品保留時間為橫坐標（Х），lgMw為縱坐標（Y），得葡聚糖對照品回歸方程為Y＝-0.223 9Х＋8.588 3（R2＝0.978 4），計算LGP-A 的Mw為1.83×106。

圖2 LGP-A 紫外全波長掃描 (A) 及Mw 分布 (B)Fig. 2 UV full wavelength scanning analysis (A )and molecular weight determination of LGP-A (B)

3.2.2 單糖組成分析 單糖組成分析是多糖的結(jié)構(gòu)表征及生物活性研究必不可少的部分，對于功能性多糖的質(zhì)量控制也具有一定的意義。LGP-A 單糖組成分析結(jié)果見圖3，通過與單糖混合對照品進行比較，推測出LGP-A 主要由半乳糖、阿拉伯糖組成，其百分比為51.23∶44.68，此外還含有微量甘露糖、葡萄糖醛酸等單糖。結(jié)果表明，LGP-A 是一種阿拉伯半乳聚糖。

圖3 LGP-A 單糖組成成分分析液相色譜圖Fig. 3 Liquid chromatogram of monosaccharide composition analysis of LGP-A

3.2.3 FT-IR 分析 采用FT-IR 光譜測定了LGP-A在4 000～500 cm-1的紅外吸收光譜，結(jié)果如圖4 所示，在3 302.79、2 929.89 cm-1處分別為O-H 的伸縮振動峰[12]和C-H 伸縮振動峰[13]，是糖類物質(zhì)的2 個特征吸收峰；1 645.12 cm-1是羧基的C＝O 非對稱伸縮振動峰，說明存在結(jié)合水[14]；1 400～1 200 cm-1是C-H 角變振動峰；1 405 cm-1是C-H 面內(nèi)彎曲振動峰；1 075、1 046 cm-1是C-O-C 和C-O-H 伸縮振動和環(huán)振動峰重疊而成[15-16]，說明存在吡喃糖；899 cm-1吸收峰說明存在β-糖苷鍵[17]。

圖4 LGP-A 的FT-IR 光譜圖Fig. 4 FT-IR spectrum of LGP-A

3.2.4 NMR 分析 在1H-NMR 譜中，通常α 型糖苷的異頭氫化學位移大于δ5.0，β 型一般小于δ5.0[18-19]，圖5-a 給出LGP-A 的1H-NMR 信號，δ4.50～5.39是異頭氫信號，其余的氫信號堆積在δ3.00～4.30內(nèi)，相互交叉重疊。由于存在偶合和裂分，從1H-NMR 譜中還不能確定異頭氫的位置，需要借助HSQC 來確定。在13C-NMR 譜中，糖的異頭碳位于較低場，δ95～110，此范圍內(nèi)有幾個信號，表示有幾種單糖組成，但是同一種單糖在多糖中的位置比較接近，幾乎重疊[18,20]，圖5-b 給出LGP-A 的13CNMR，在δ99～110 是異頭碳信號，δ84～60 為LGP-A 單糖殘基C2～C6信號位移的重疊。結(jié)合LGP-A 的HSQC 譜（圖5-d），可以清晰地找到8個異頭氫和異頭碳的偶合信號，分別為A：C1-H1(109.3/5.26)、B：C1-H1(108.0/5.39)、C：C1-H1(107.5/5.09)、D：C1-H1(107.2/5.21)、E：C1-H1(103.7/4.69)、F：C1-H1(103.3/4.52)、G：C1-H1(102.8/4.54)、H：C1-H1(99.5/5.01)。結(jié)合單糖組成分析可以初步判斷LGP-A中主要以α糖苷鍵連接的呋喃型阿拉伯糖和β 糖苷鍵連接的吡喃型半乳糖構(gòu)成。結(jié)合文獻報道[21-23]δ109.3/5.26、108.0/5.39、107.5/5.09、107.2/5.21 是α-L-Araf的信號；而δ103.7/4.69、103.3/4.52、102.8/4.54 是β-D-Galp的信號，δ99.5/5.01 是α-D-Galp的信號，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 羅漢果根多糖LGP-A 的核磁數(shù)據(jù)Table 1 13C-NMR and 1H-NMR data of LGP-A

圖5 LGP-A 的1H NMR (a)、13C NMR (b)、1H-1H COSY (c)、HSQC (d) 和HMBC(e) 譜Fig. 5 1H-NMR (a), 13C-NMR (b), 1H-1H COSY (c), HSQC (d) and HMBC (e) spectra of LGP-A

以殘基A 為例，1H-1H COSY 譜中顯示的相關信號有δH5.26/δH4.23、δH4.23/δH3.97、δH3.97/δH4.14、δH4.14/δH3.83、δH4.14/δH3.73，分別為A 殘基 H1-H2、H2-H3、H3-H4、H4-H5a、H4-H5b的相關信號，表明A 殘基的H2～H5化學位移分別為δH4.23、3.97、4.14、3.83、3.73。此外，根據(jù)HSQC譜圖可以看到δ5.26/109.3、4.23/81.4、3.97/76.6、4.14/83.9、3.83, 3.73/61.4 的交叉峰，由此推斷出A殘基的C2～C5化學位移分別為81.4、76.6、83.9、61.4。結(jié)合文獻報道[21-22,24]中殘基化學位移信息可推斷殘基A 為阿拉伯糖殘基，其連接方式為T-α-LAraf。采用以上方法及參考文獻數(shù)據(jù)[21-22,24-27]對其余7 個糖殘基的其余信號進行歸屬如下：→3)-α-L-Araf-(1→（B）、→5)-α-L-Araf-(1→（C）、→3,5)-α-L-Araf-(1→（D）、→3)-β-D-Galp-(1→（E）、→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）、→6)-β-D-Galp-(1→（G）、→3)-α-D-Galp-(1→（H）。8 種殘基的化學位移值歸納如表1 所示。

根據(jù)HMBC 光譜確認相鄰糖基殘基之間的糖苷鍵，在LGP-A 的HMBC 光譜（圖5-e）中，δ69.9/4.52 處的交叉峰代表→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）的C-6 和→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）的H-1 相關；δ69.9/4.54 處的交叉峰代表→6)-β-D-Galp-(1→（G）的C-6 和→6)-β-D-Galp-(1→（G）的H-1 相關；δ103.3/3.77、103.3/3.66 處的交叉峰代表→3,6)-β-DGalp-(1→（F）的C-1 和→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）的H-6a、H-6b 相關；以上信息表明LGP-A 中含有→3,6)-β-D-Galp-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→殘基，且多糖中殘基F 的連接以1，6 位C 相連。δ83.9/5.26 處的交叉峰代表→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）的C-3 與T-α-LAraf（A）的H-1 相關。表明殘基A 的C-1 與殘基F的C-3相連；δ107.5/5.26處的交叉峰表明→5)-α-LAraf-(1→（C）的C-1 和T-α-L-Araf（A）的H-1 相關；δ83.9/5.09 處的交叉峰表明→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）的C-3 和→5)-α-L-Araf-(1→（C）的H-1相關；δ66.9/5.09 處的交叉峰表明→5)-α-L-Araf-(1→（C）的C-5 和→5)-α-L-Araf-(1→（C）的H-1 相關。δ76.6/5.09 處的交叉峰表明T-α-L-Araf（A）的C-3和→5)-α-L-Araf-(1→（C）的H-1 相關；δ84.1/5.26處的交叉峰表明T-α-L-Araf（A）的H-1 和→3,5)-α-LAraf-(1→（D）的C-3 相關；基于上述結(jié)果和文獻報道[21-27]，推斷LGP-A 是一種阿拉伯半乳聚糖，且主鏈是F 的C-1 與C-6 相連，另2 個主要殘基A、C 都是C-1 與主鏈中F 的C-3 相連。

由于多糖結(jié)構(gòu)復雜，NMR 譜圖中信號重疊嚴重，采用NMR 分析結(jié)構(gòu)只能初步推測糖殘基之間的連接方式，很難準確判斷糖苷鍵連接位點。后續(xù)課題組將繼續(xù)對LGP-A 的結(jié)構(gòu)進行解析，采用甲基化等分析手段進一步表征多糖結(jié)構(gòu)。

3.2.5 剛果紅實驗 若1 個多糖具有三螺旋結(jié)構(gòu)與剛果紅試劑混合后會發(fā)生絡合反應，混合溶液的最大吸收波長（λmax）向長波方向移動，即紅移。氫氧化鈉可以破壞多糖三螺旋結(jié)構(gòu)，因此隨著氫氧化鈉濃度升高混合溶液λmax逐漸減小，即藍移[28]。從圖6中可以看到LGP-A 與剛果紅混合后λmax未發(fā)生顯著性紅移，且隨氫氧化鈉濃度升高，混合溶液與剛果紅單一溶液λmax變化趨勢相似，因此判斷LGP-A不含三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖6 LGP-A 剛果紅實驗Fig. 6 Congo Red experiment of LGP-A

3.2.6 SEM 分析 如圖7 所示，LGP-A 在掃描電鏡下呈現(xiàn)出帶孔的片狀堆疊，表面緊密，說明其分子間及分子鏈間相互作用較強，其結(jié)構(gòu)有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，另有少量棒狀結(jié)構(gòu)，說明LGP-A 排布不規(guī)律，規(guī)整性不強，可能為無定型結(jié)構(gòu)。

圖7 LGP-A 的SEM 圖Fig. 7 SEM of LGP-A

3.3 LGP-A 細胞免疫活性

3.3.1 對細胞增殖的影響 用 CCK-8 法檢測LGP-A 對RAW264.7 細胞增殖率的影響，結(jié)果如圖8-A 所示，與對照組相比，LGP-A 質(zhì)量濃度在0.625～5.0 μg/mL 對細胞沒有毒性作用，亦未顯著促進RAW264.7 細胞增殖。因此采用0.625～5.0 μg/mL 質(zhì)量濃度的多糖溶液進行以下實驗。

圖8 LGP-A 對RAW264.7 細胞的增殖活性 (A)、吞噬中性紅 (B) 及釋放NO (C)、TNF-α (D) 和IL-6 (E) 的影響(± s , n=3)Fig. 8 Effects of LGP-A on proliferation (A), phagocytosis of neutral red (B), release of NO (C), TNF-α (D) and IL-6 (E) of RAW264.7 cells (± s , n=3)

3.3.2 對細胞吞噬能力的影響 巨噬細胞的吞噬作用是非特異性免疫在病原體入侵時的最初反應，巨噬細胞吞噬病原體后不僅可以激活特異性免疫，對炎癥的消退也起到重要作用。因此，巨噬細胞的吞噬能力可以作為機體免疫防御水平的指標之一。有研究表明，中藥多糖能夠提高巨噬細胞吞噬能力，增強機體免疫調(diào)節(jié)能力。LGP-A 多糖的結(jié)果如圖8-B 所示，以對照組為100%吞噬率，在0.625～5.0 μg/mL LGP-A 可以顯著性增強RAW264.7 細胞的吞噬能力（P＜0.01），1.25 μg/mL 下吞噬率為138.5%。

3.3.3 對細胞NO、TNF-α、IL-6 分泌量的影響 NO作為細胞產(chǎn)生的一種信號轉(zhuǎn)導介質(zhì)，可以激活巨噬細胞啟動非特異性免疫，促進巨噬細胞代謝，提高巨噬細胞吞噬能力[26]，是評價免疫應答水平的重要指標。細胞因子主要是巨噬細胞在免疫應答過程中的產(chǎn)物，可以參與免疫應答，調(diào)節(jié)巨噬細胞功能。其中TNF-α 是一種強促炎因子[29]，參與機體多種生命活動，對腫瘤也有一定的抑制活性。IL-6 可以誘導機體產(chǎn)生炎癥反應，還可以調(diào)節(jié)代謝及再生[30]。因此TNF-α、IL-6 等細胞因子水平的上升是巨噬細胞激活的標志之一。有研究表明，多糖提高RAW264.7 細胞NO、TNF-α、IL-6 等因子的分泌，且分泌水平低于LPS 誘導組，以此來評價其免疫調(diào)節(jié)活性[31]。

由圖 8-C～E 可知，LGP-A 多糖可以促進RAW264.7 細胞NO、TNF-α、IL-6 等細胞因子的分泌，且呈劑量相關性。與對照組相比，5 μg/mL LGP-A 組的NO、TNF-α 分和IL-6 分泌量均較顯著上升，分別為（20.64±1.29）μmol/L、（27.16±0.17）ng/mL 和（3.77±0.13）ng/mL，但低于1 μg/mL LPS組分泌量 [（25.79±1.63）μmol/L、（75.54±0.23）ng/mL、（18.97±0.11）ng/mL]。綜合細胞因子與細胞吞噬實驗結(jié)果，可知LGP-A 具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

4 討論

目前對羅漢果根多糖的構(gòu)效關系未有充分研究，但在其他多糖的研究中發(fā)現(xiàn)單糖組成是影響多糖生物活性的重要因素，其中半乳糖、阿拉伯糖等單糖是否存在和含量高低會影響其免疫活性。由阿拉伯糖和半乳糖聚合而成的中性多糖稱為阿拉伯半乳聚糖（AG），安全無毒，且具有良好的生物活性。如從落葉松中提取的AG 能促進TNF-α、IL-6 和IL-1β 等細胞因子，具有很強的免疫調(diào)節(jié)活性。在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)AG 可以提高人體對細菌抗原的免疫力，還可以治療風寒感冒等呼吸道疾病[32-33]。除了免疫活性外，AG 在抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、維持腸道穩(wěn)態(tài)等方面也有較好的活性。

本研究通過紅外光譜、核磁波共振波譜、相關參考文獻和結(jié)合單糖組成分析結(jié)果，對LGP-A 結(jié)構(gòu)進行初步分析，推斷其是一種阿拉伯半乳聚糖。實驗證明LGP-A 具有較好的免疫活性，可能與其相對分子質(zhì)量大小有關。相對分子質(zhì)量是多糖發(fā)揮生物活性的重要影響因素，多糖需要與受體結(jié)合跨越細胞屏障才能進入機體發(fā)揮生物活性。多糖相對分子質(zhì)量過高難以跨越細胞屏障，相對分子質(zhì)量過低難以形成活性聚合物結(jié)構(gòu)[34]。研究發(fā)現(xiàn)不同植物多糖發(fā)揮免疫活性的最佳相對分子質(zhì)量范圍不同，如單糖組成、糖鏈主要結(jié)構(gòu)及官能團基本一致但相對分子質(zhì)量有明顯差異的鐵皮石斛多糖在免疫調(diào)節(jié)活性方面具有顯著差異，在1.2×105～5.44×105免疫效果強于3.91×104[35]，推測在一定范圍內(nèi)，多糖相對分子質(zhì)量越大活性越強。本實驗從羅漢果根中分離得到的LGP-A 多糖，經(jīng)PMP-HPLC 分析后發(fā)現(xiàn)與紅花多糖HH1-1 單糖組成[21]及比例相似，相對分子質(zhì)量與草菇多糖相似。研究表明紅花多糖HH1-1 與草菇多糖可以增加巨噬細胞NO 生成量，促進細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS 的分泌及其mRNA表達量[36]，表現(xiàn)出良好的免疫調(diào)節(jié)能力，本實驗結(jié)果與以上研究比較一致。

目前羅漢果栽培方式是一年一栽，每年產(chǎn)生大量的根資源。但羅漢果根不是傳統(tǒng)的藥用部位，尚未得到系統(tǒng)的研究與開發(fā)，從而遭受丟棄造成巨大的資源浪費。本實驗以羅漢果根為原料，通過脫脂、水提醇沉得到羅漢果根粗多糖，利用DEAE-52 和Sephadex LH-20 柱色譜純化得到1 個均一性較好的中性多糖LGP-A，通過FT-IR、NMR、SEM 等技術初步表征了其結(jié)構(gòu)，以細胞實驗證明其具有免疫調(diào)節(jié)活性。今后擬進一步加強對LGP-A 精細結(jié)構(gòu)的解析，并開展其體內(nèi)的免疫活性研究，為開發(fā)羅漢果根多糖的大健康產(chǎn)品奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突