雷公藤紅素-氨基葡萄糖酰胺偶聯物的合成及其減毒調脂作用

畢 晨，游清徽

江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022

雷公藤TripterygiumwilfordiiHook. f.是一種傳統中藥，擁有悠久的藥用歷史。現有研究明確指出，雷公藤具有多種藥理作用，包括抗腫瘤、抗炎、抗肥胖、治療自身免疫疾病和糖尿病等功能。此外，雷公藤還顯示出神經保護、預防心血管和代謝相關疾病的效果[1-5]。雷公藤紅素（celastrol，Cel）是從雷公藤植物根部提取得到的一種五環三萜類化合物，具有抗炎和抗腫瘤等良好效果[6-8]。近年來的相關研究發現，Cel 還參與機體脂質代謝的調控，并具有一定的減肥效果。劉伯宇等[9]研究發現，Cel通過提高瘦素敏感性，對于高脂飲食誘導的肥胖（diet-induced obesity，DIO）小鼠可以降低其食欲并明顯減輕其體質量。然而，對于缺乏瘦素及瘦素受體的小鼠，并未觀察到明顯的減肥效果。另外，研究顯示Cel 可以通過下調轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARγ2）和CCAAT 增強子結合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein，C/EBPα）的表達，降低早期脂肪基因的表達，并有效抑制小鼠胚胎呈纖維細胞（3T3-swiss albino，3T3-L1）向脂肪細胞的終末分化[10]。盡管Cel 具有顯著的藥理活性，但其對肝臟、腎臟、心腦血管等也存在強烈的不良反應，并具有較差的水溶性，從而限制了其在臨床中的應用[11]。

近年來，偶聯藥物技術的發展使得Cel 的臨床應用成為可能。為了解決Cel 本身理化性質限制以及隨劑量增加而引發的藥物毒性等問題，研究人員已經開發了多種藥物制劑，如納米遞藥系統[12-13]、聚合物膠[14]、聚合物前藥[15]、脂質體[16-17]等被研發出來以提高Cel 的生物利用度。然而，Cel 相關制劑目前仍處于研發階段，并未有產品上市。

用于聚合物-藥物偶聯物的材料需要具備無毒、低免疫反應以及良好的水溶性等特點，例如N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺[18]、聚乙二醇以及部分多糖聚合物（如殼聚糖、葡聚糖、透明質酸等）均為常用藥物輔料。葡聚糖阿霉素前藥是第1 個進入臨床試驗階段的葡聚糖偶聯藥物，但后續研究證明其具有一定的肝毒性、會引起血小板減少等不良癥狀[19]。聚谷氨酸是一種人工合成的聚合物具有低免疫反應和無毒性等特點，但也存在制備成本高昂，無法普及的問題。氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）是一種含有氨基的己糖，具有改善軟骨關節代謝、抗菌、抗氧化、抗炎和保肝的作用?，F有臨床試驗證明，氨基葡萄糖沒有急性毒性、亞急性毒性和遺傳毒性方面的問題，其鹽酸鹽形式被美國國家食品營養協會（National Nutritional Foods Association，NNFA）批準為膳食補充劑[20]。

本實驗研發了一種Cel-GlcN 酰胺偶聯物，合成工藝見圖1，并從理化性質、藥物毒性和抗脂效果等方面評價該復合物。研究結果顯示，該復合物的水溶性、藥物毒性和氧化應激水平等方面均優于原始藥物Cel。

圖1 Cel-GlcN 的合成工藝Fig. 1 Cel-GlcN synthesis process

1 儀器與材料

1.1 儀器

CKX 53 型倒置光學顯微鏡，日本Olympus 公司；MCO-15AC 型二氧化碳細胞培養箱，日本Sanyo公司；Agilent-API4500 型液質聯用儀，美國AB Sciex 公司；FW-4A 型粉末壓片機，天津市拓普儀器有限公司；Spectra Max M5 型酶標儀，美國Molecular Devices 公司；Nicolet iN10 MX 型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet 公司。

1.2 材料與試劑

DMEM 細胞培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、非必需氨基酸、胎牛血清蛋白、油酸、棕櫚酸均購自北京索萊寶科技有限公司；GlcN 購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈購自Sigma-Aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；Cel 購自成都普思生物科技股份有限公司；N,N-乙基二異丙胺（N,Ndiisopropylethylamine，DIPEA）、二氯甲烷、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽（benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate，PyBOP）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽［1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC·HCl］、N-羥基苯并三氮唑（1-hydroxybenzotriazole，HOBt）均購自Adamas 上海泰坦科技股份有限公司；HepG2 細胞系購自美森細胞生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）試劑盒、2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉（bicinchonininc acid，BCA）試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 細胞培養

將人肝癌HepG2 細胞（美森細胞生物科技有限公司）置于含有15%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的高糖DMEM 培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

2 方法與結果

2.1 Cel-GlcN 的合成與表征

2.1.1 基于DMF 體系Cel-GlcN 的合成 在常溫條件下，將Cel（100 mg、0.22 mmol）、PyBOP（57 mg、0.11 mmol）溶解于5 mL DMF（99.5%）溶劑中，隨后將反應液置于冰水混合物中冷卻30 min。在攪拌的條件下，緩慢滴入DIPEA（71 mg、0.55 mmol）至反應溶液中，待反應溶液恢復至室溫后逐滴加入氨基葡萄糖溶液（92 mg、0.44 mol/L），持續攪拌48 h 直至反應完全。然后收集反應液，使用二氯甲烷和飽和食鹽水萃取3 次（15 mL×3），有機層用無水硫酸鈉干燥。在40 ℃下減壓旋蒸完全后，通過硅膠柱色譜進行純化（洗脫劑為二氯甲烷-甲醇12∶1）。最終得到棕紅色固體粉末82.3 mg（61.4%）。收集所得樣品后，通過LC-MS 確定其相對分子質量，使用1H-NMR、13C-NMR 對其結構進行鑒定，并通過壓片法對產物進行傅里葉紅外光譜（FTIR）表征。

2.1.2 基于二氯甲烷體系Cel-GlcN 的合成 在氮氣氛圍下，將HOBt（42.4 mg、0.22 mmol）和EDC·HCl（63 mg、0.33 mmol）加入到溶解有Cel（100 mg、0.22 mmol）的二氯甲烷溶液中，并在0 ℃的條件下攪拌15 min，待反應溶液恢復至室溫后逐滴加入氨基葡萄糖溶液（92 mg、0.44 mol/L），攪拌過夜至反應完全。收集反應液，直接加入飽和食鹽水洗滌3 次（15 mL×3），有機層用無水硫酸鈉干燥，40 ℃下減壓旋蒸完全后，通過硅膠柱色譜進行純化（洗脫劑為二氯甲烷-甲醇14∶1）。最終得到棕紅色固體粉末60.4 mg（40.5%），其表征方式與“2.1.1”項一致。

2.1.3 FTIR分析 FTIR參數：光譜范圍4 000～500 cm-1；分辨率0.5 cm-1；掃描次數64；信噪比50 000∶1。Cel-GlcN 是由Cel 的羧基與GlcN 的氨基之間形成酰胺鍵而合成（如圖1 所示），通過FTIR（圖2）對酰胺鍵進行了驗證，在Cel-GlcN 的FTIR 譜圖中，1 647 cm-1處的吸收峰對應酰胺I 譜帶C＝O 的伸縮振動，1 586 cm-1處的強吸收則對應酰胺II 譜帶中N-H 的彎曲振動，同時，在Cel-GlcN 中觀察到Cel中由C＝O 在1 702 cm-1處的伸縮振動吸收峰消失，表明酰胺鍵的成功引入。

圖2 Cel-GlcN 的紅外光譜圖Fig. 2 Infrared spectra of Cel-GlcN

2.1.4 LC-MS 檢測分析

（1）色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18為（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；體積流量1 mL/min；檢測波長200～600 nm。洗脫條件：0～18 min，30%～100%乙腈；18～28 min，100%乙腈；28～30 min，100%～30%乙腈。

（2）質譜條件：電噴霧離子源（ESI），掃描方式為負離子模式；噴嘴電壓4 kV；鞘氣溫度250 ℃；鞘氣體積流量8 L/min；干燥氣體積流量6 L/min；干燥器溫度250 ℃；錐孔電壓100 V；掃描范圍m/z100～1 700。

通過LC-MS 梯度分析結果（圖3、4），觀察到無論是DMF 還是二氯甲烷體系中均有目標產物Cel-GlcN 的液相峰，對比分析可知，在二氯甲烷體系中不光有目標產物，同時還生成了2 種副產物（tR分別為23.891、24.916 min），其相對分子質量與目標產物Cel-GlcN 不符，Cel（tR＝21.848 min）具有較小的極性，只在純有機相乙腈洗脫后被紫外檢測器檢測到。GlcN 因其結構上具有多個羥基，表現出良好的水溶性和較大的極性。在Cel 與GlcN 共價結合生成Cel-GlcN（tR＝12.819 min）后，結合物的分子極性增加，水溶性得到改善，峰出現時間也提前。同時，在對目標峰Cel-GlcN（tR＝12.819 min）進行質譜分析時（圖5），初步判斷其相對分子質量約為611（可能含有奇數氮化合物），基本與Cel（Mr＝450）和GlcN（Mr＝179）共價結合后去除1 個水分子后的相對分子質量相符，因而本實驗在后續的實驗中選擇使用高產率的DMF 溶劑作為反應體系。

圖4 基于二氯甲烷體系的Cel-GlcN 經LC-MS 分析的液相色譜圖Fig. 4 LC-MS LC chromatogram of Cel-GlcN based on dichloromethane system

圖5 Cel-GlcN 經LC-MS 分析的質譜圖Fig. 5 Mass spectra of Cel-GlcN analyzed by LC-MS

2.1.51H-NMR、13C-NMR 檢測

（1）氫譜參數：溫度298.0 K；譜寬10 000 Hz；脈沖寬度11.11 μs；弛豫時間2 s；采樣點數65 536；采樣時間3 s；掃描次數16。

（2）碳譜參數：溫度296.2 K；譜寬22 045.7 Hz；脈沖時間16 μs；采樣時間3.65 s；弛豫時間2.0 s；采樣數據點65 536；掃描次數50。

1H-NMR (400 MHz, MeOD)δ: 7.20 (2H, s), 6.49(2H, d,J= 10.2 Hz), 6.45～6.41 (1H, m), 3.79～3.69(7H, m), 3.69～3.64 (2H, m), 3.48 (1H, d,J= 6.6 Hz),3.31 (3H, s), 2.47 (2H, d,J= 15.4 Hz), 2.21 (2H, s),2.19 (6H, s), 2.15 (3H, s), 1.93～1.80 (7H, m), 1.74(7H, dt,J= 15.6, 7.5 Hz), 1.50 (7H, d,J= 14.0 Hz),1.42 (5H, s), 1.35 (4H, dd,J= 7.2, 3.7 Hz), 1.27 (9H,d,J= 6.2 Hz), 1.19 (6H, s), 1.13 (7H, s), 0.96 (3H, d,J= 15.3 Hz), 0.72 (5H, s)。

13C-NMR (100 MHz, MeOD)δ: 181.14 (C-29),180.03 (C-2), 172.56 (C-8), 166.42 (C-10), 147.75(C-3), 136.55 (C-6), 128.49 (C-5), 120.61 (C-4),119.98 (C-7), 119.61 (C-1), 92.36 (C-1′), 73.08 (C-3′),72.64 (C-4′), 72.52 (C-5′), 62.79 (C-6′), 56.11 (C-2′),46.27 (C-14), 45.83 (C-18), 44.30 (C-9), 41.53 (C-13),40.77 (C-20), 38.87 (C-24), 37.61 (C-22), 36.08(C-16), 34.73 (C-11), 34.39 (C-25), 32.07 (C-27),32.00 (C-19), 31.71 (C-15), 30.94 (C-17), 30.47(C-12), 29.75 (C-21), 22.27 (C-29), 19.69 (C-26),10.37 (C-23)。

ESI-HRMS: 分子式（C35H49NO8-），m/z610.937 6，出峰時間12.819 min，檢測波長425 nm。Cel-GlcN質量分數95.46%。

2.2 水溶性及穩定性測試

精密稱取3 mg 經DMF 體系合成純化后的Cel-GlcN，溶于1 mL 去離子水中，在室溫下進行漩渦震蕩5 min，然后超聲2 min 使其充分溶解。最后，在14 000 r/min、4 ℃下冷凍離心（離心半徑5 cm）10 min，取上清液，并使用紫外分光光度計讀取其在425 nm 處的吸光度（A）值。將10 mg 的Cel-GlcN分別置于50 mL 的PBS（pH 7.4）、DMEM 細胞培養基（10% FBS）、模擬胃液（SGF，0.32%胃蛋白酶，pH 1.2）和模擬腸液（SIF，1%胰酶，pH 7.5）中，以37 ℃孵育24 h。之后，在1、2、4、8、12、24 h 分別取200 μL 溶液，經醋酸乙酯萃取后進HPLC 定量分析［色譜條件：流動相為乙腈-超純水（90∶10）；使用Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量為1.0 mL/min；溫度為25 ℃；檢測波長為425 nm］。

根據425 nm 處的A值數據，相比于Cel 微弱的水溶性（1.23 μg/mL），Cel-GlcN 在水中的溶解度極大地改善，達到了226 μg/mL。

如圖6 所示，Cel-GlcN 在PBS 水溶液（pH 7.4）中常溫保存24 h，只檢測到極少量的Cel（5.5%），這表明合成的Cel-GlcN 是一個高度穩定的化合物。而在DMEM 細胞培養基、模擬胃液（SGF，pH 1.2）及SIF（pH 7.5）中常溫保存24 h，檢測到Cel 在SGF、SIF、DMEM 細胞培養基中的質量分數分別為23.5%、35.7%、51.1%，其水解程度均有所提高，這表明Cel-GlcN 的酰胺鍵可以被其中的蛋白酶或者肽酶催化水解。此外，在SGF 條件下GEL 的釋放趨近于穩定，而在DMEM 細胞培養基中，12 h內釋放了大量的游離Cel（48.3%），且在隨后的12 h內呈緩慢上升的趨勢。這表明Cel-GlcN 在DMEM細胞培養基中的釋放效率更高，可能與其中胎牛血清中所含復雜的蛋白質相關。另外，在SGF 的酸性條件下，Cel-GlcN 的釋放效率較低。考慮到實際情況下，藥物在胃液中的轉運時間約為3 h，此時間段釋放的微量Cel 對藥物轉運并沒有實際意義，說明Cel-GlcN 很可能在腸道運輸中被攝取吸收，并部分轉運至毛細血管。

圖6 Cel-GlcN 在PBS、SGF (pH 1.2)、SIF (pH 7.5)、DMEM(10% FBS) 培養基中孵育時Cel 累積釋放率隨時間變化的控釋曲線Fig. 6 Controlled-release curve of Cel cumulative release rate over time of Cel-GlcN incubated in PBS, SGF (pH 1.2),SIF (pH 7.5), DMEM (10% FBS) medium

2.3 Cel-GlcN 細胞毒性評價

2.3.1 細胞培養 將HepG2 細胞置于含有15%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的高糖DMEM 培養基，37 ℃、5% CO2濃度的培養箱中傳代培養，保持細胞處于對數生長期。

2.3.2 MTT 檢測細胞毒性 將對數生長期的HepG2 細胞經胰蛋白酶消化后，以1×105個/mL 的密度接種于96 孔板中，每孔體積為100 μL。在37 ℃、5% CO2濃度的培養箱中孵育24 h。待細胞貼壁后，分別加入0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 μmol/L 的Cel 和Cel-GlcN，并設置對照組（僅含有細胞及培養基）和空白組（無細胞）。每組設置4 個復孔。繼續培養48 h 后，每孔加入100 μL MTT 溶液（終質量濃度為0.5 mg/mL）。在培養箱中孵育4 h 后，棄去上清液，并加入150 μL DMSO進行著色。振蕩10 min 后，使用酶標儀在490 nm處讀取每孔的A值。隨后，按以下公式計算細胞存活率。

細胞存活率＝(A實驗－A空白)/(A對照－A空白)

以HepG2 細胞評估了Cel 和Cel-GlcN 的體外細胞毒性。結果（表2）顯示，培養至24 h 時，Cel和Cel-GlcN 的IC50值分別為（1.68±0.37）μmol/L和（2.75±0.11）μmol/L；而培養至48 h，它們的IC50值分別為（0.96±0.23）μmol/L 和（1.82±0.56）μmol/L。與原始藥物Cel 相比，偶聯物Cel-GlcN 對HepG2 細胞的毒性明顯較弱。當載藥量質量濃度相同時，偶聯藥物Cel-GlcN 在相同時間對HepG2 細胞活力的抑制均低于Cel。這可能是由于偶聯藥物中的酰胺鍵在培養基中逐漸斷裂，緩慢釋放出游離的Cel，從而減輕藥物的不良反應。

表2 Cel 及Cel-GlcN 在24、48 h 內的體外細胞存活率Table 2 In vitro cell viability of Cel and Cel-GlcN within 24 h and 48 h

2.3.3 高血脂細胞模型建立與檢測 根據文獻報道的方法[21]，制備游離脂肪酸（free fatty acids，FFA）。按以下條件制備FFA，精密稱取適量的油酸和棕櫚酸，按照2∶1 的比例溶解在1 mol/L KOH 溶液中，并在室溫下攪拌過夜。緩慢滴入含有10% BSA 蛋白的PBS 溶液中，并調節pH 值至7.4。經過0.22 μm濾膜濾過后，得到含有10% BSA 蛋白的20 倍母液（FFA-BSA 8∶1，所有實驗組的BSA 蛋白質量分數均控制在0.5%）。使用0.8 mmol/L 濃度的FFA 誘導細胞體外脂肪變性24 h，以建立非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFLD）細胞模型。將細胞分為模型組、對照組以及實驗組（分為Cel 和Cel-GlcN 處理組）。經過藥物處理48 h 后，棄去細胞上清液，使用PBS 洗滌2 次，然后用200 μL RIPA裂解液破碎細胞。待裂解完全后，取100 μL 裂解液轉移至新的EP 管中，使用TC、TG 試劑盒檢測細胞中的TC 和TG 含量。剩余的細胞裂解液使用BCA試劑盒進行蛋白定量。

肝臟中脂肪的積聚是導致NAFLD 的一個重要因素，與多種疾病有關。0.6 mmol/L 的FFA 成功誘導了體外高脂細胞模型（如表3 所示）。與對照組相比較，在24 h 內，模型組的TG 含量增加了220%（P＜0.001），TC 含量增加了280%（P＜0.001），二者差異顯著，這預示著高血脂模型的成功建立。在對模型組細胞使用不同濃度的Cel 和Cel-GlcN 處理后，實驗組的TC 和TG 含量均有不同程度的減少。1 μmol/L 的Cel 在處理FFA 誘導的高脂模型時，相對于模型組，TG 水平顯著降低（P＜0.05），但TC含量與模型組沒有明顯差異。隨著Cel 濃度增加，TG 和TC 的含量顯著下降（P＜0.05、0.01）。因此，本實驗確定2 μmol/L 的Cel 為最低調脂藥物濃度。

表3 不同濃度Cel 和Cel-GlcN 干預FFA-HepG2 細胞后TC、TG 含量變化 (±s, n = 4)Table 3 Changes of TC and TG contents of FFA-HepG2 cells after different concentrations of Cel intervention(±s, n = 4)

表3 不同濃度Cel 和Cel-GlcN 干預FFA-HepG2 細胞后TC、TG 含量變化 (±s, n = 4)Table 3 Changes of TC and TG contents of FFA-HepG2 cells after different concentrations of Cel intervention(±s, n = 4)

與對照組比較：###P＜0.001；與FFA 組比較：*P＜0.05 **P＜0.01。###P < 0.001 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs FFA group.

藥物 濃度/(μmol·L-1)TG/(μmol·μg-1 protein)TC/(mmol·g-1 protein)對照 - 0.756±0.061 0.061±0.009 FFA - 1.553±0.045### 0.145±0.004###FFA＋Cel 1 1.451±0.036* 0.138±0.008 2 1.252±0.055** 0.126±0.005*4 1.216±0.085** 0.113±0.002**FFA＋Cel-GlcN 1 1.511±0.087 0.141±0.006 2 1.336±0.050** 0.133±0.004*4 1.296±0.075** 0.118±0.003**

根據表3 可以得知，1 μmol/L 的Cel-GlcN 對模型組細胞的血脂水平下降并不顯著，但2、4 μmol/L濃度的Cel-GlcN 干預后，總體TG 和TC 水平呈現較小范圍的梯度下降，呈現濃度相關性。這也預示著與Cel 相比，Cel-GlcN 在24 h 內對高脂細胞模型組血脂水平的降低程度較低，極可能是由于游離的Cel 沒有完全釋放，需要更持續的發揮Cel-GlcN 的緩慢釋放效果。

2.3.4 細胞內脂滴形態觀測 經藥物處理后的細胞棄去培養液，經PBS 洗滌2 次后使用4%多聚甲醛固定30 min。除去多聚甲醛后，使用PBS 再次清洗細胞。每孔加入0.5 mL 油紅工作液（油紅溶于異丙醇制備0.5%的儲備液，與蒸餾水以6∶4 的比例混勻后濾過至液體澄清），染色30 min。用60%異丙醇清洗至無明顯浮沫后快速晾干。倒置顯微鏡下觀察細胞形態。相比于對照組，高脂模型組的HepG2細胞形態發生了明顯的變化，由圖7 可知，經FFA處理后的模型組細胞內出現大量的脂滴，且整個細胞形態有變圓的趨勢，團聚現象也更加明顯，在經過Cel 和Cel-GlcN 進行藥物干預后，細胞脂滴逐漸減小，紅色區域面積也與Cel-GlcN 的濃度呈劑量依賴性減少，表明Cel、Cel-GlcN 可有效減少細胞內脂滴數量，降低脂肪的沉積程度，同時，隨著濃度的增大，細胞表面的脂滴大小及面積也呈現梯度的減少，具有劑量相關性。Cel 或Cel-GlcN 在1、2 μmol/L 的濃度下，Cel 與Cel-GlcN 對于細胞脂滴形態、紅色脂滴面積的改善效果并不明顯，但隨著濃度達到4 μmol/L 時，可觀察到Cel 對紅色脂滴面積的改善作用更加明顯，團聚現象減弱。

圖7 Cel、Cel-GlcN 干預后各實驗組細胞油紅染色細胞圖 (×200)Fig. 7 Diagram of oil red stained cells in each experimental group after Cel and Cel-GlcN intervention (× 200)

2.3.5 Cel、Cel-GlcN 對肝臟氧化應激的影響 使用熒光探針DCFH-DA 測定細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）相對含量。將DCF-DA 母液通過DMSO 制備為50 mmol，并使用無血清細胞培養血液DMEM 稀釋為10 μmol/L。加入各組細胞后，在37 ℃的培養箱中孵育20 min。使用PBS 清洗2次去除未反應的DCFH-DA 探針。在特定的時間點（1、2、4、8、12、24 h），使用酶標儀讀取每個孔在激發波長488 nm、發射波長525 nm 下的熒光強度（fluorescence intensity，F），按公式計算ROS 相對含量。

ROS 相對含量＝(F實驗－F空白)/(F對照－F空白)

肥胖是一種多因素引起的慢性疾病。其中，脂肪組織分泌的脂肪因子可以誘導ROS 的產生。當細胞內的ROS 增多而無法及時清除時，就會導致細胞氧化損傷，這被稱為氧化應激（oxidative stress，OS），OS 被認為是引發高脂血癥等一系列代謝疾病的關鍵因素[22]。當人體攝入過多的FFA 時，攝入能量遠大于消耗的能量，導致原本在線粒體上正常進行的β-氧化部分轉化為過氧化物酶體中的β-氧化和內質網上的ω-氧化。這不僅降低了脂肪代謝效率，還會產生更多的ROS，引發機體氧化應激反應。本研究通過對比不同濃度的Cel 和Cel-GlcN 作用于高脂細胞模型后的ROS 水平，其動力學曲線見圖8，發現Cel和Cel-GlcN 對細胞內ROS 產生呈現劑量相關性增加。

圖8 Cel 及Cel-GlcN 對細胞ROS 產生隨時間變化的動力學曲線 (±s, n = 4)Fig. 8 Kinetic curves of Cel and Cel-GlcN on cellular ROS over time (±s, n = 4)

值得注意的是，Cel 在單獨作用時同樣也會引發細胞內的氧化應激反應[23]，低劑量組1 μmol/L Cel和Cel-GlcN 產生的ROS 水平位于空白組和模型組之間，與FFA 模型組之間差異呈顯著性（P＜0.01），表明Cel 和Cel-GlcN 均具有一定抑制機體氧化應激，降低ROS 水平作用，相比于原始藥物Cel，Cel-GlcN 能更小程度減弱相關氧化應激反應。推測其可能與Cel-GlcN 釋放游離Cel 介導提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助活化因子1（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC-1）活性相關[24]。在使用2 μmol/L Cel 和Cel-GlcN 處理后，Cel 組的細胞中ROS 水平與FFA 誘導的高脂模型細胞相當，Cel-GlcN 組所產生的ROS水平，與模型組相比較低具有顯著性差異（P＜0.05）。經過高濃度組4 μmol/L Cel 和Cel-GlcN 處理后，ROS 水平均高于FFA 模型組（P＜0.01），表明高濃度組的Cel 和Cel-GlcN 所引發的氧化應激反應較模型組更加劇烈，但4 μmol/L Cel-GlcN 相比于同濃度組的Cel，誘發的ROS 水平更低（P＜0.01）。具體結果如表4 所示，因此，體外研究表明，在使用Cel-GlcN 作為藥物干預時，不僅可以發揮Cel 和GlcN的調脂、抗炎保肝及抗腫瘤等活性，還可在等濃度條件下減弱由原始藥物Cel 誘發的氧化應激反應。

表4 Cel、Cel-GlcN 干預誘導HepG2 細胞24 h 后ROS 含量 (±s, n = 4)Table 4 ROS content in HepG2 cells induced by Cel and Cel-GlcN intervention for 24 h (±s, n = 4)

表4 Cel、Cel-GlcN 干預誘導HepG2 細胞24 h 后ROS 含量 (±s, n = 4)Table 4 ROS content in HepG2 cells induced by Cel and Cel-GlcN intervention for 24 h (±s, n = 4)

與對照組比較：###P＜0.001；與FFA 組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與同劑量Cel 組比較：★★P＜0.01。###P < 0.001 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs FFA group; ★★P <0.01 vs same dose Cel group.

組別 濃度/(μmol·L-1) ROS 相對含量/%對照 - 100.0 FFA - 304.3±16.1###Cel 1 197.3±14.1**2 320.5±10.6 4 378.6±20.0**Cel-GlcN 1 174.3±5.1**2 275.0±15.5*★★4 345.2±15.7**★★

3 討論

雖然Cel 可以與多個疾病靶點相互作用產生強烈藥理學活性，在治療各種疾病中方面具有巨大潛力，但鑒于其微弱的水溶性（常溫下為1.23 μg/mL），較低的生物利用度（SD 大鼠中17%）尤其是對各種器官具有明顯的不良反應，Cel 臨床應用面對的這些問題也是研究人員重點關注的對象，因而對Cel 進行結構修飾，篩選出藥理活性更為突出的衍生物成為了目前研究的熱點。

作為一種五環三萜類結構，Cel 具有多個活潑基團，主要包括A/B 環的醌甲基、C-3 位羥基和C-20位羧基，因此，結構修飾大多集中在這些位置。其中，基于第20 位的羧酸基團進行結構修飾，可以通過酰化和酯化反應引入合適的基團從而生成酰胺類、酯類及脲類衍生物。以往對Cel 的酯類衍生物研究中發現，Cel 醌甲基部位為其發揮藥理活性的必要部位，一旦改變醌甲基的結構，藥物活性就會減弱。單偉光等[23]通過對Cel 第20 位羧酸基團的修飾（添加鹵素元素、苯環、六環以及羥基），合成了一系列酯類衍生物（化合物1～10，圖9）。這些衍生物中，化合物1～4 和6～8 的極性明顯大于Cel，水溶性也更好。其中，化合物4 和8 顯示出最強的藥物活性，在體外HepG2 細胞實驗中表現出最好的效果，這表明羥基的引入可能對Cel 的極性和藥理活性有很大改善作用。Zhang 等[24]通過對C-20 羧基修飾后引入胺和三唑類衍生物，發現酰胺鍵的引入可以提高Cel 的抗增殖活性（化合物11～14）。在哌嗪衍生物類（化合物15～20）中，含氮雜環化合物也同樣顯示出良好的抗增殖活性，這表明Cel的活性增加可能與引入的含氮基團有關。

圖9 Cel 酯類、酰胺類衍生物Fig. 9 Esters and amide derivatives of Cel

GlcN 分子為含氮原子的六元環結構，具有多個羥基，水溶性較好且安全無毒，易于與Cel 分子的活性基團羧基發生酰胺化反應。因此，為降低Cel的藥物毒性，本實驗選擇了GlcN 與Cel 進行酰胺化縮合，在對比2 種不同的反應體系DMF、二氯甲烷后，選擇了產率及質量分數均更高的DMF 體系進行小批量酰胺縮合制備Cel-GlcN，相比于Tian 等[11]的研究，該反應無需對Cel 的碳鏈進行延伸分步與伯胺縮合來實現酰胺化。此外，部分學者為保證酰胺化反應中目標產物的產率，會將羧酸反應為酰氯，經醇淬滅后再與胺反應來提高該反應的效率[25]，本研究方案使用高活性催化劑PyBOP 在DMF 溶劑中完成了該反應，極大地減少了反應副產物生成，同時也保證了具有良好的產率。

肥胖是一種代謝疾病，若不及時干預，可能引發糖尿病、高血壓和高血脂癥等風險。Cel 作為一種具有多種生物活性的天然產物，在提供顯著的減肥功效的同時，其不良反應也是不可忽視的因素。本研究通過對Cel 分子的羧酸基團進行修飾合成了Cel-GlcN 這一衍生物，大大改善了Cel 的溶解性（達到226 μg/mL）。通過比較Cel 和Cel-GlcN 在體外細胞試驗中的活性，結果驗證了在相同劑量水平下，Cel-GlcN 與Cel 具有相似的減肥調脂活性。此外，Cel-GlcN 可能通過緩控釋方式釋放游離的Cel，從而減輕其對細胞的毒性和機體內的氧化應激水平。相較于天然產物Cel，Cel-GlcN 很可能減輕其對肝臟、腎臟和心腦血管的不良反應，為Cel 在臨床應用上提供了有價值的線索。本研究結果表明，Cel-GlcN 很可能是改善Cel 水溶性和不良反應的重要化合物，并為相關藥物的研發提供了參考依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突