經(jīng)典名方葛根芩連湯基準(zhǔn)樣品的HPLC 指紋圖譜及量質(zhì)傳遞規(guī)律研究

陳佳美，陳 蓉，成顏芬，楊曉琴，王 瀟，傅超美，章津銘，吳億晗

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川 成都 611137

經(jīng)典名方葛根芩連湯（ Gegen Qinlian Decoction，GQD）出自東漢著名醫(yī)家張仲景所著《傷寒論》第34 條，原方名為葛根黃芩黃連湯，至近代《中國醫(yī)藥大辭典》始成“葛根芩連湯”方名[1]。全方由葛根、黃芩、黃連、炙甘草4 味中藥組成，方中以葛根為君，既能清熱解表，又能升發(fā)脾胃清陽之氣而治下痢；臣藥以黃芩、黃連苦寒之品可清胃腸之濕，使以炙甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥[2]。該方具有表里雙解、清熱止利之功，為治熱陷陽明、協(xié)熱下利常用方[3]。現(xiàn)代研究表明，GQD 具有止瀉、抗炎抑菌、解熱、抗心律失常、降糖等藥理作用[4]。可用于治療胃腸型感冒、細(xì)菌性痢疾、糖尿病、高血壓病、高脂血癥、潰瘍性結(jié)腸炎等疾病[5]。

《中藥注冊分類及申報資料要求》[6]將第3 類古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑細(xì)分為“3.1 按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑”（以下簡稱“3.1 類”）及“3.2 其他來源于古代經(jīng)典名方的中藥復(fù)方制劑”（以下簡稱“3.2 類”）。在“3.1 類”經(jīng)典名方相關(guān)政策出臺逐步完善、其制劑的關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)討論熱這一趨勢下，本研究參考“3.1 類”經(jīng)方制劑研發(fā)思路開發(fā)“3.2 類”經(jīng)典名方GQD 具有巨大潛力與研究意義。在《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑基準(zhǔn)樣品的申報資料要求（征求意見稿）》中提出了為保障制劑的質(zhì)量，應(yīng)重點關(guān)注基準(zhǔn)樣品質(zhì)量控制體系的建立，該質(zhì)量控制體系的建立應(yīng)以按照國家發(fā)布的古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息及古籍記載內(nèi)容制備的基準(zhǔn)樣品為前提[7]，以出膏率、含量測定、指紋圖譜或特征圖譜等為指標(biāo)，進(jìn)行量質(zhì)傳遞分析，從而保證基準(zhǔn)樣品質(zhì)量的均一性和可追溯性[8]。

目前，對于GQD 中4 味中藥的化學(xué)基礎(chǔ)及主要活性成分的研究較為清楚[9-13]，其相關(guān)制劑的整體質(zhì)量控制的研究，多為以HPLC 同時測定多種有效成分為主，其中，章軍等[9]、李麗莉等[14]、毛瑩等[15]分別建立了葛根芩連相關(guān)制劑中10 種以上有效成分，在不同波長下同時測定的HPLC 含量測定方法，胡曉茹等[16]對葛根芩連片特征圖譜中8 個特征峰進(jìn)行指認(rèn)。因此，本研究在前期文獻(xiàn)考證明確《傷寒論》中記載的GQD 的飲片處方量、加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)的基礎(chǔ)上，擬制備15 批GQD基準(zhǔn)樣品，并分別建立了4 味中藥中關(guān)鍵指標(biāo)成分的含量測定方法，優(yōu)化前期研究中葛根芩連相關(guān)制劑的HPLC 指紋圖譜條件，以出膏率、含量測定、指紋圖譜或特征圖譜等為指標(biāo)，探明GQD 指標(biāo)成分在“飲片-水煎液-凍干粉”的傳遞規(guī)律，為后續(xù)GQD 經(jīng)方制劑的質(zhì)量控制奠定了研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UPK-I-107 型優(yōu)普超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司；FTS-10A 型全自動煎藥壺，潮州市一壺百飲電器實業(yè)有限公司；Sartorius CPA225D 型電子天平，十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HTP-312 型電子天平，萬分之一，上海華潮電器有限公司；SCIENTZ-10N 型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；DL-720D 型超聲機(jī)，上海之信儀器有限公司；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher 公司；色譜柱Xterra RP18（250 mm×4.6 mm，5μm），沃特世科技（上海）有限公司；色譜柱5C18-MS-II（250 mm×4.6 mm，5 μm），上海屹利科學(xué)儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海泉杰儀器有限公司；Scientz-10N 型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 試藥

對照品葛根素（批號wkq22012601）、大豆苷（批號wkq22041304）、大豆苷元（批號wkq16080304）、黃芩苷（批號 wkq21010608）、黃芩素（批號wkq21030203）、漢黃芩苷（批號wkq21031811）、漢黃芩素（批號wkq21022605）、黃連堿（批號wkq21030107）、鹽酸小檗堿（批號wkq21022201）、巴馬汀（批號wkq21050608）、表小檗堿（批號wkq22032907）、甘草苷（批號wkq18040902）、甘草酸銨（批號wkq22011005）均購于成都維克奇生物科技有限公司，各對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。水為超純水；乙腈（色譜級，湖北弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司、磷酸、甲醇（色譜級，成都市諾爾施科技有限責(zé)任公司），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。葛根、黃芩、黃連、甘草藥材均購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)蔣桂華教授鑒定，分別為豆科葛屬植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi 的干燥根、唇形科黃芩屬植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi 的干燥根、毛茛科黃連屬植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖、豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。葛根、黃芩、黃連、炙甘草飲片均為自制[17]，藥材產(chǎn)地與飲片炮制加工方法見表1。

表1 GQD 飲片來源Table 1 Sources of GQD pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 15 批GQD 基準(zhǔn)樣品的制備

2.1.1 藥材基原、飲片炮制、用法用量考證 參照《中國藥典》2020 年版一部[17]，明確了葛根為豆科葛屬植物野葛P.lobata(Willd.) Ohwi 的干燥根、黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩S.baicalensisGeorgi 的干燥根。根據(jù)《中國藥典》2020 年版以及國家中醫(yī)藥管理局、國家藥品監(jiān)督管理局聯(lián)合發(fā)布的32 首經(jīng)典名方關(guān)鍵信息[18]中來源于《傷寒論》的經(jīng)方對于黃連的基原記載，明確了黃連為多基原植物，其來源于毛茛科黃連屬植物黃連C.chinensisFranch.、三角葉黃連C.deltoideaC. Y. Cheng et Hsiao 或云連C.teetaWall.的干燥根莖。在本研究中考慮到實驗的時效性以及藥材方便購買程度，固定了黃連基原為毛茛科黃連屬植物黃連C.chinensisFranch.的干燥根莖做進(jìn)一步研究。經(jīng)課題組前期對于甘草的本草考證發(fā)現(xiàn)，所記載的甘草基原均為烏拉爾甘草G.uralensisFisch.，未見藥典所載脹果甘草G.inflataBat.和光果甘草G.glabraL.[17,19-22]。參照32 首經(jīng)典名方關(guān)鍵信息來源于《傷寒論》的經(jīng)方對于甘草基原記載，其明確規(guī)定了甘草藥材基原為豆科甘草屬植物甘草G.uralensisFisch.的干燥根和根莖。對于甘草的“炙”法，藥典規(guī)定為蜜炙，然而蜜作為輔料最早出現(xiàn)于唐代，在此之前未提及關(guān)于輔料的記載，參照32 首經(jīng)典名方關(guān)鍵信息，此處的“炙”法應(yīng)為清炒法[17,22]。

對于處方劑量，原文記載：“葛根（半斤）、黃芩（三兩）、黃連（三兩）、甘草（二兩）……，上四味，以水八升，先煮葛根，減二升，內(nèi)諸藥，煮取二升，去滓……”[18]。參照古代計量史專家丘光明、邱隆、楊平合著，由科技出版社出版的《中國科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》[23]，明確東漢時期的1 兩折合為13.8 g，1 升折合成現(xiàn)今200 mL，“去滓”多指過濾除去藥渣[24]，由此可知，《傷寒論》中GQD 的制法為加水1 600 mL，先煮葛根（110.4 g），當(dāng)煮至湯液體積為1 200 mL，再加入黃芩（41.4 g）、黃連（41.4 g）、炒甘草（27.6 g），煮至湯液為400 mL，過濾除去藥渣。

2.1.2 15 批GQD 基準(zhǔn)樣品的制備 采用隨機(jī)數(shù)表法對4 味飲片進(jìn)行隨機(jī)組合及排序，組成15 批GQD基準(zhǔn)樣品對應(yīng)飲片的批號。按前期研究得到的方法制備GQD 基準(zhǔn)樣品，先將葛根置于紫砂壺中，加入1 600 mL 純水，設(shè)定浸泡時間為30 min，參考傳統(tǒng)武火煮沸、文火保持微沸的湯液煎煮方法，武火煮沸后，轉(zhuǎn)文火煎煮至湯液體積為1 200 mL 時，加入黃芩、黃連、炙甘草，煮至湯液為400 mL。150目無紡布趁熱濾過，濾液減壓濃縮至一定體積，得葛根芩連水煎濃縮液，將濃縮液置入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，即得到15 批GQD 基準(zhǔn)樣品。

2.2 GQD 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為5C18-MS-II（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.02 mol/L 醋酸銨加入0.03%三乙胺（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值為4.3），梯度洗脫：0～5 min，15%乙腈；5～10 min，15%～20%乙腈；10～15 min，20%～25%乙腈；15～30 min，25%乙腈；30～33 min，25%～40%乙腈；33～48 min，40%～50%乙腈；48～57 min，50%～65%乙腈；57～60 min，65%～15%乙腈；60～65 min，15%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 GQD 基準(zhǔn)樣品供試品溶液的制備 取GQD基準(zhǔn)樣品0.2 g 于25 mL 棕色量瓶中，精密加70%甲醇25 mL，超聲（250 W、40 kHz）30 min，取出，待冷卻后加70%甲醇定容至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，1 000 r/min 離心10 min（離心半徑16 cm），取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.3 單味飲片和陰性對照供試品溶液的制備 分別稱取處方量的葛根、黃芩、黃連、炙甘草4 味飲片，按“2.1”項下GQD 基準(zhǔn)樣品制備工藝和“2.2.2”項下的處理方法，制得單味飲片供試品溶液；同法按處方量分別制備缺葛根、缺黃芩、缺黃連、缺甘草的4 個陰性對照供試品溶液。

2.2.4 對照品溶液的制備 分別取葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃連堿、鹽酸小檗堿、巴馬汀、表小檗堿、甘草苷、甘草酸銨適量，精密稱定，用70%甲醇分別制成含葛根素1.013 mg/mL、大豆苷1.005 mg/mL、大豆苷元0.995 mg/mL、黃芩苷2.120 mg/mL、黃芩素1.020 mg/mL、漢黃芩苷0.520 mg/mL、漢黃芩素1.067 mg/mL、黃連堿1.005 mg/mL、鹽酸小檗堿1.045 mg/mL、巴馬汀1.020 mg/mL、表小檗堿0.990 mg/mL、甘草苷0.995 mg/mL、甘草酸銨1.030 mg/mL 的對照品儲備液。

2.2.5 精密度考察 取GQD 基準(zhǔn)樣品凍干粉，按“2.2.2”項下方法制備同一批GQD 基準(zhǔn)樣品凍干粉（S6）供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果指紋圖譜相似度＞0.96；以6 號峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均＜2%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性考察 按“2.2.2”項下方法平行制備同一批GQD 基準(zhǔn)樣品凍干粉（S6）的供試品溶液6份，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果指紋圖譜相似度＞0.98；以6 號峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均＜2%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性考察 按“2.2.2”項下方法制備GQD基準(zhǔn)樣品凍干粉（S6）供試品溶液1 份，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于樣品制備后的0、12、15、18、24、30 h 后進(jìn)樣分析，結(jié)果指紋圖譜相似度＞0.96；以6 號峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均＜2%，表明本方法的穩(wěn)定性良好。

2.2.8 化學(xué)指紋圖譜的建立及其相似度評價 根據(jù)“2.2.1”項下色譜條件對15 批次GQD 基準(zhǔn)樣品供試品溶液進(jìn)行檢測，將樣品所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A 版）軟件進(jìn)行分析，利用中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)置為0.2 min，以S6 為對照，生成HPLC 疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜，結(jié)果見圖1。共標(biāo)定了34 個共有峰，對15批GQD 基準(zhǔn)樣品相似度進(jìn)行計算，得到不同批次的指紋圖譜的相似度均＞0.993，符合指紋圖譜要求，結(jié)果見表2。

圖1 15 批GQD 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜和對照指紋圖譜的HPLC 圖Fig. 1 Fingerprints of 15 batches of GQD benchmark samples and HPLC of control fingerprints

表2 15 批GQD 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜相似度評價結(jié)果Table 2 Similarity evaluation results of 15 batches of GQD benchmark samples

經(jīng)與化學(xué)對照品的色譜行為進(jìn)行比較，指認(rèn)了13 個共有峰，分別為葛根素（6 號峰）、大豆苷（10號峰）、甘草苷（15 號峰）、黃芩苷（20 號峰）、表小檗堿（24 號峰）、黃連堿（25 號峰）、漢黃芩苷（26號峰）、大豆苷元（28 號峰）、巴馬汀（29 號峰）、鹽酸小檗堿（30 號峰）、甘草酸銨（32 號峰）、黃芩素（33 號峰）、漢黃芩素（34 號峰）。對照品溶液、供試品溶液、空白溶劑的HPLC 圖見圖2。

圖2 空白溶劑 (A)、混和對照品 (B) 和GQD 基準(zhǔn)樣品(C) 的HPLC 圖Fig. 2 HPLC of solvent blank (A), mixed reference substances (B) and GQD benchmark sample (C)

2.2.9 指紋圖譜量質(zhì)傳遞關(guān)系分析 通過分別將4種單味飲片樣品、缺單味飲片陰性樣品和全方基準(zhǔn)樣品指紋圖譜進(jìn)行比對，對標(biāo)定的34 個共有峰進(jìn)行歸屬，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，4、6（葛根素）、7、9、10（大豆苷）、12、28（大豆苷元）號峰來源于葛根，11、14、16、19、20（黃芩苷）、21、22、26（漢黃芩苷）、27、33（黃芩素）、34（漢黃芩素）來源于黃芩，3、8、13、23、24（表小檗堿）、25（黃連堿）、29（巴馬汀）、30（鹽酸小檗堿）來源于黃連；15（甘草苷）、29、31、32（甘草酸銨）來源于甘草，5 號峰在葛根、黃連均有出現(xiàn)，17、18 號峰在葛根、黃芩、黃連均有出現(xiàn)，1、2 號峰在4 味中藥中均有出現(xiàn)，推測可能為極性相似的一類化合物，有待進(jìn)一步研究。

圖3 GQD 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜 (R) 中34 個共有峰及其歸屬Fig. 3 Common peaks and their assignments in fingerprint chromatogram of GQD benchmark sample (R)

2.3 GQD基準(zhǔn)樣品中各指標(biāo)成分含量在飲片-水煎液-基準(zhǔn)樣品中的傳遞規(guī)律研究

2.3.1 HPLC 色譜條件

（1）葛根飲片、GQD 水煎液、GQD 基準(zhǔn)樣品中葛根素、大豆苷、大豆苷元：5C18-MS-II 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水，梯度洗脫：0～20 min，25%甲醇；20～30 min，25%～45%甲醇；30～40 min，45%～60%甲醇；40～50 min，60%～75%甲醇；體積流量1.0 mL/min；檢測波長250 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

（2）黃芩飲片、GQD 水煎液、GQD 基準(zhǔn)樣品中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素：Xterra RP18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，25%～30%乙腈；10～30 min，30%～50%乙腈；30～35 min，50%～100%乙腈；35～40 min，100%～25%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長275 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

（3）甘草飲片、GQD 水煎液、GQD 基準(zhǔn)樣品中甘草苷、甘草酸銨：Xterra RP18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～3 min，19%乙腈；3～20 min，19%～26%乙腈；20～22 min，26%～40%乙腈；22～34 min，40%乙腈；34～36 min，40%～19%乙腈；體積流量0.7 mL/min；檢測波長237 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

（4）黃連飲片、GQD 水煎液、GQD 基準(zhǔn)樣品中鹽酸小檗堿、巴馬汀：Xterra RP18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值為3.0）25∶75；體積流量1 mL/min；檢測波長346 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 水煎液供試品溶液的制備 精密吸取水煎液0.2 mL 于5 mL 棕色量瓶中，加入70%甲醇2 mL，1 000 r/min 離心10 min（離心半徑16 cm），取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.3.3 基準(zhǔn)樣品供試品溶液的制備 同“2.2.2”項下。

2.3.4 單味飲片供試品溶液的制備 同“2.2.3”項下。

2.3.5 陰性對照供試品溶液的制備 同“2.2.3”項下。

2.3.6 對照品溶液的制備 按“2.2.4”項下方法配制的不同質(zhì)量濃度的葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、巴馬汀、甘草苷、甘草酸銨11 個對照品溶液。

2.3.7 系統(tǒng)適用性考察 取上述基準(zhǔn)樣品、單味飲片、陰性對照供試品溶液，以及對照品溶液，按“2.3.1”項下各HPLC 色譜條件分別進(jìn)行測定，記錄色譜圖，結(jié)果各成分分離度均＞1.5，符合《中國藥典》2020 年版要求，峰形較好，理論塔板數(shù)（n）以保留時間（tR）和峰寬（W）按n＝16(tR/W)2計算均不低于15 000，陰性樣品無干擾。

2.3.8 線性關(guān)系考察 將“2.3.6”項下對照品溶液按比例稀釋2 倍形成系列梯度質(zhì)量濃度，各指標(biāo)成分按“2.3.1”項下各HPLC 色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為橫坐標(biāo)（X）、以質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸方程計算，各指標(biāo)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及線性范圍分別為葛根素Y＝0.558 0X＋1.456 3，R2＝0.999 9，線性范圍3.96～1 012.50μg/mL；大豆苷Y＝0.653 6X＋2.109 0，R2＝0.999 7，線性范圍1.96～502.50 μg/mL；大豆苷元Y＝1.258 7X＋2.367 8，R2＝0.999 7，線性范圍1.94～497.50μg/mL；黃芩苷Y＝0.614 8X－3.939 7，R2＝1.000 0，線性范圍16.56～2 120.00 μg/mL；漢黃芩苷Y＝0.556 6X－1.531 9，R2＝0.999 4，線性范圍2.03～520.00 μg/mL；黃芩素Y＝0.856 4X＋0.018 5，R2＝1.000 0，線性范圍1.99～510.00 μg/mL；漢黃芩素Y＝0.940 1X＋1.888 9，R2＝0.999 7，線性范圍2.07～530.00 μg/mL；鹽酸小檗堿Y＝0.403 3X＋0.054 1，R2＝1.000 0，線性范圍4.10～523.30 μg/mL；巴馬汀Y＝0.403 5X＋0.023 6，R2＝1.000 0，線性范圍4.0～502.20 μg/mL；甘草苷Y＝0.449 7X＋0.683 7，R2＝0.999 9，線性范圍3.87～495.00 μg/mL；甘草酸銨Y＝0.113 4X－0.967 4，R2＝0.999 3，線性范圍4.02～515.00 μg/mL。

2.3.9 精密度考察 取編號為S13 的GQD 基準(zhǔn)樣品，按“2.3.3”項下制備其供試品溶液1 份，參照“2.3.1”項下4 種HPLC 色譜條件，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果顯示，11 種指標(biāo)成分葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、巴馬汀、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD 分別為1.7%、0.5%、0.8%、1.2%、1.5%、1.0%、0.3%、0.8%、0.9%、1.3%、0.7%，均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.10 穩(wěn)定性考察 取編號為S13 的GQD 基準(zhǔn)樣品，按“2.3.3”項下制備其供試品溶液1 份，參照“2.3.1”項下4 種HPLC 色譜條件，分別在制備后 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，結(jié)果顯示，11 種指標(biāo)成分葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、巴馬汀、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD 分別為1.9%、0.8%、0.6%、1.2%、1.8%、0.3%、1.0%、1.1%、0.7%、1.2%、1.0%，均小于2.0%，表明基準(zhǔn)樣品供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.11 重復(fù)性考察 取編號為S13 的GQD 基準(zhǔn)樣品，按“2.3.3”項下方法平行制備6 份其供試品溶液，參照“2.3.1”項下4 種HPLC 色譜條件，分別進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，11 種指標(biāo)成分葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、巴馬汀、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD 分別為0.9%、1.6%、1.3%、0.4%、0.9%、1.2%、1.8%、0.5%、1.5%、0.7%、1.2%，均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.12 加樣回收率考察 精密稱取編號為S13 的已知指標(biāo)成分含量的GQD基準(zhǔn)樣品2.00 g于25 mL量瓶中，分別按樣品中各成分含量的100%水平加入“2.3.6”項下11 種對照品溶液，按“2.3.3”項下方法平行制備6 份其供試品溶液，參照“2.3.1”項下4 種HPLC 色譜條件，分別進(jìn)樣分析，進(jìn)行含量測定，計算11 種指標(biāo)成分的加樣回收率及RSD 值，結(jié)果葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、巴馬汀、甘草苷、甘草酸銨的平均加樣回收率分別為102.79%、98.89%、103.25%、104.22%、99.78%、105.10%、96.87%、99.10%、101.76%、101.44%、99.76%，RSD 分別為0.6%、0.7%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.1%、0.9%、1.2%、1.0%、0.9%，表明該方法加樣回收率良好。

2.3.13 GQD 處方各味藥指標(biāo)成分在飲片、水煎液、基準(zhǔn)樣品中的含量測定結(jié)果 按“2.3.1”項下方法分別測定15 批飲片、水煎液、基準(zhǔn)樣品中11 個指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表3～5。

表3 飲片中指標(biāo)性成分的含量Table 3 Content of index components in decoction pieces

表4 水煎液中指標(biāo)性成分的含量Table 4 Content of index components in decoction

表5 基準(zhǔn)樣品中指標(biāo)性成分的含量Table 5 Content of index components in benchmark samples

15 批飲片中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為葛根素92.142～116.619 mg/g、大豆苷20.412～28.744 mg/g、大豆苷元1.338～1.989 mg/g、黃芩苷150.442～162.818 mg/g、漢黃芩苷48.887～51.232 mg/g、黃芩素4.419～4.818 mg/g、漢黃芩素1.848～2.485 mg/g、鹽酸小檗堿66.437～88.617 mg/g、巴馬汀17.446～22.016 mg/g、甘草苷19.950～20.613 mg/g、甘草酸銨43.400～52.267 mg/g；15 批水煎液中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為葛根素8.891～11.205 mg/g、大豆苷1.206～1.949 mg/g、大豆苷元0.162～0.260 mg/g、黃芩苷6.577～7.285 mg/g、漢黃芩苷2.049～2.663 mg/g、黃芩素0.018～0.032 mg/g、漢黃芩素0.021～0.035 mg/g、鹽酸小檗堿0.809～1.32 2 mg/g、巴馬汀0.365～0.652 mg/g、甘草苷1.442～1.972 mg/g、甘草酸銨0.883～1.071 mg/g；

15 批基準(zhǔn)樣品中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為葛根素8.031～10.938 mg/g、大豆苷1.048～1.789 mg/g、大豆苷元0.117～0.244 mg/g、黃芩苷4.709～7.369 mg/g、漢黃芩苷2.112～2.199 mg/g、黃芩素0.011～0.022 mg/g、漢黃芩素0.012～0.022 mg/g、鹽酸小檗堿0.532%～1.154 mg/g、巴馬汀0.224～0.423 mg/g、甘草苷1.188～1.954 mg/g、甘草酸銨0.876～0.992 mg/g。

2.3.14 GQD 各味藥指標(biāo)成分含量在飲片-水煎液-基準(zhǔn)樣品之間的傳遞規(guī)律 飲片-水煎液-基準(zhǔn)樣品中指標(biāo)成分含量的轉(zhuǎn)移率是考察傳遞規(guī)律的重要指標(biāo)，其計算方法為飲片到水煎液轉(zhuǎn)移率＝m2/m1，水煎液到基準(zhǔn)樣品轉(zhuǎn)移率＝m3/m2，其中，m1為飲片中指標(biāo)性成分的質(zhì)量，m2為水煎液中指標(biāo)性成分的質(zhì)量，m3為凍干粉中指標(biāo)性成分的質(zhì)量。

根據(jù)試驗樣品所測數(shù)據(jù)，對各藥味指標(biāo)成分含量轉(zhuǎn)移率結(jié)果如表6、7 所示，葛根素飲片到水煎液的轉(zhuǎn)移率為17.71%～19.69%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率為84.18%～104.00%；大豆苷飲片到水煎液的轉(zhuǎn)移率為10.32%～13.65%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率為86.90%～105.38%；大豆苷元飲片到水煎液的轉(zhuǎn)移率為21.13%～27.65%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率為64.64%～104.09%；黃芩苷飲片到水煎液的轉(zhuǎn)移率為22.46%～23.99%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率為71.58%～107.61%；漢黃芩苷飲片到水煎液的轉(zhuǎn)移率為21.38%～28.16%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率為82.54%～106.78%；黃芩素飲片到水煎液的轉(zhuǎn)移率為2.15%～3.81%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率為51.85%～83.33%；漢黃芩素飲片到水煎液的轉(zhuǎn)移率為4.83%～9.55%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率為43.75%～73.33%；鹽酸小檗堿飲片到水煎液的轉(zhuǎn)移率為6.33%～8.70%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率為60.33%～99.95%；巴馬汀飲片到水煎液的轉(zhuǎn)移率為11.09%～15.79%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率為60.56%～76.94%；甘草苷飲片到水煎液的平均轉(zhuǎn)移率為57.82%～76.53%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的平均轉(zhuǎn)移率為80.98%～103.70%；甘草酸銨飲片到水煎液的平均轉(zhuǎn)移率為14.98%～18.08%，水煎液到基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率87.96%～106.12%。

根據(jù)《征求意見稿》中相關(guān)內(nèi)容，不同批次基準(zhǔn)樣品的指標(biāo)性成分含量及轉(zhuǎn)移率應(yīng)控制在其均值的70%～130%，本實驗中15 批GQD 基準(zhǔn)樣品的各指標(biāo)性成分的含量及轉(zhuǎn)移率均在其均值的±30%范圍內(nèi)，說明前期葛根、黃芩、黃連、炙甘草飲片和基準(zhǔn)樣品的制備工藝相對穩(wěn)定可行。

2.4 GQD 基準(zhǔn)樣品制備過程中干膏率傳遞規(guī)律研究

按“2.1”項下的制備方法制備GQD 全方、葛根、黃芩、黃連、甘草各單味的水煎液，精密吸取50 mL 于100 mL 恒定質(zhì)量后的蒸發(fā)皿中，水浴加熱成稠膏，真空干燥48 h 以上至恒定質(zhì)量，即得各飲片及15 批GQD 基準(zhǔn)樣品的干膏粉。計算15 批基準(zhǔn)樣品的實際干膏率及其對應(yīng)飲片的干膏率，計算公式為飲片單煎干膏率＝m1/M1，全方水煎液干膏率＝m2/M2，其中m1表示飲片干膏粉質(zhì)量，M1表示飲片質(zhì)量，m2表示GQD 基準(zhǔn)樣品干膏粉質(zhì)量，M2表示全方飲片質(zhì)量。

為了解飲片-基準(zhǔn)樣品傳遞過程中干膏率的變化，根據(jù)單味藥劑量在全方中的占比以及各單味藥飲片的干膏率，計算全方中各單味藥折算加和后的理論干膏率，計算公式為全方理論干膏率＝∑單味藥干膏率×(單味藥生藥量/全方生藥量)，對比理論干膏率于實際出膏率，計算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表8，具體計算公式為轉(zhuǎn)移率＝實際干膏率/理論干膏率。由表8 可知，15 批全方基準(zhǔn)樣品的理論干膏率為29.71%～33.31%，實際干膏率在24.63%～26.91%，干膏率的傳遞率均值為81.35%，轉(zhuǎn)移率為75.08%～87.48%，均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)（平均值的±10%以外），表示不同批次基準(zhǔn)樣品間干膏率較為穩(wěn)定。

表8 15 批GQD 單味藥飲片、基準(zhǔn)樣品的干膏率及轉(zhuǎn)移率結(jié)果Table 8 Results of dry extract rate and transfer rate of each decoction pieces and benchmark samples of GQD

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的確定

經(jīng)典名方基準(zhǔn)樣品作為后續(xù)復(fù)方制劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制的參照，在研究過程中具有核心地位，因此，其指標(biāo)成分的選擇應(yīng)具有代表性，并能全面反映復(fù)方質(zhì)量[25]。結(jié)合GQD 質(zhì)量標(biāo)志物以及相關(guān)文獻(xiàn)報道[26-27]，本研究采用化學(xué)指紋圖譜與多指標(biāo)成分在飲片-水煎液-基準(zhǔn)樣品傳遞相結(jié)合進(jìn)一步確定該方與藥效相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵成分。葛根中具有較強(qiáng)藥理活性且含量最豐富的成分為異黃酮類，研究表明，異黃酮類中主要的活性成分為葛根素、大豆苷、大豆苷元等，這些成分在抗氧化、降血糖、解熱、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等方面具有較好的藥理作用[28]。黃芩中主要含有黃酮及其苷類化合物，其代表性活性成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素，這些成分具有多方面的藥理活性，包括抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降血壓、提高免疫力等[29]。黃連的主要活性成分為生物堿類成分，本研究參照《中國藥典》[17]收載的葛根芩連片劑、丸劑2 種劑型中明確規(guī)定的黃連的定量指標(biāo)鹽酸小檗堿外，還選擇了巴馬汀作為指標(biāo)成分進(jìn)一步研究。甘草的指標(biāo)成分的選擇依據(jù)《中國藥典》甘草飲片項下的定量指標(biāo)甘草苷、甘草酸銨。因此，選擇測定葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、巴馬汀、甘草苷、甘草酸銨11 種與葛根芩連湯藥效相關(guān)且較穩(wěn)定的指標(biāo)成分的含量，能進(jìn)一步提升對GQD 內(nèi)在質(zhì)量的控制。

3.2 供試品溶液制備方法考察

在供試品制備過程中，本研究對提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇，甲醇、50%乙醇、70%乙醇、乙腈、純水）、提取方法（超聲、室溫）、提取時間（20、25、30 min）和溶劑用量（15、20、25、30 mL）等影響因素進(jìn)行了考察，從提取化學(xué)成分全面性以及方法穩(wěn)定性等方面考慮，確定GQD 基準(zhǔn)樣品及單味飲片供試品溶液最佳制備方法為以70%甲醇為提取溶劑，溶劑用量為25 mL，超聲提取30 min。

3.3 色譜條件分析

3.3.1 GQD 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的色譜條件考察通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[17]，分別以乙腈-0.5%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸（含0.01 mol/L 磷酸二氫鉀）水溶液、乙腈-0.05%磷酸二氫鉀＋0.05%三乙胺溶液（磷酸調(diào)pH 至3.0）、乙腈-0.02 mol/L 醋酸銨＋0.03%三乙胺溶液（用冰醋酸調(diào)pH 至4.3）共4 種不同流動相體系和比例下色譜峰的分離情況，結(jié)果顯示以流動相乙腈-0.02 mol/L 醋酸銨＋0.03%三乙胺溶液（用冰醋酸調(diào)pH 至4.3）進(jìn)行梯度洗脫時，基線平穩(wěn)，色譜峰分離度良好；參考《中國藥典》以及相關(guān)文獻(xiàn)報道[10,16]，選擇230、250、280、346 nm 4 個波長作為測試波長，顯示在280 nm 時各色譜峰響應(yīng)較好，雜質(zhì)干擾少；另外，考察了柱溫（25、30、35 ℃）對色譜峰分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30 ℃條件下，各色譜峰分離度較好。

3.3.2 GQD 4 味藥指標(biāo)成分含量測定的色譜條件考察 由于GQD 中化學(xué)成分復(fù)雜多樣，主要為黃酮類、生物堿類和皂苷類成分，通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)黃芩、葛根以及甘草的指標(biāo)成分在230～280 nm均有較強(qiáng)吸收，而黃連的生物堿類成分在330～360 nm 處有較強(qiáng)吸收，因此，采用同一波長不能同時實現(xiàn)不同成分的最大吸收。該研究曾采用指紋圖譜色譜條件，通過切換波長來實現(xiàn)對多成分含量同時測定，但實際考察過程中發(fā)現(xiàn)切換波長對基線、峰形有一定的影響，基線較差對含量測定的精度有一定影響。故本研究在參考《中國藥典》的基礎(chǔ)上，分別建立了方中4 味藥的含量測定方法。

此外，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，HPLC 法測定黃酮類化合物時，流動相多為乙睛-水系統(tǒng)或甲醇-水系統(tǒng)[30-31]，并通常在水相中加入0.1%冰醋酸、磷酸或甲酸，以抑制黃酮中酚羥基的電離，改善拖尾，并提高分離度[32]。因此，在參考《中國藥典》的基礎(chǔ)上，結(jié)合預(yù)試驗考察，進(jìn)一步優(yōu)化了葛根、黃芩、黃連、甘草的色譜條件，最終建立了4 味藥的含量測定方法。

3.4 15 批GQD 基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜分析

15 批GQD 基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜相似度良好（＞0.99），匹配結(jié)果顯示出有34 個共有峰，并指認(rèn)出13 個特征峰。方中的葛根、黃芩、黃連、炙甘草在《中國藥典》2020 年版單味藥項下規(guī)定的指標(biāo)性成分均指認(rèn)出，表明所建立的指紋圖譜可以基本滿足表征每味藥特征峰的要求。然而，由于單味飲片煎液及其基準(zhǔn)樣品的供試品溶液成分更為復(fù)雜，使得黃連的指標(biāo)性成分表小檗堿與黃連堿在該色譜條件下分離度并不理想。同時，該色譜條件下的30～45 min 并未檢測到主成分，仍可進(jìn)一步優(yōu)化。對于上述的不足之處，本課題組今后將進(jìn)一步深入研究，力求方中各味藥的主成分出峰時間更為合理，分離度更佳。

3.5 15 批GQD 基準(zhǔn)樣品量質(zhì)傳遞規(guī)律分析

11 種指標(biāo)性成分在飲片至水煎液的傳遞過程中，成分的轉(zhuǎn)移率皆在規(guī)定范圍（均值的70%～130%）內(nèi)，說明該煎煮過程較穩(wěn)定可控，工藝可行。其中，甘草酸銨、鹽酸小檗堿、巴馬汀轉(zhuǎn)移率較低，通過對比研究發(fā)現(xiàn)，黃連、甘草飲片單煎液皆較為澄清透明，而復(fù)方湯液明顯有大量絮狀物生成，通過查閱文獻(xiàn)推測這些成分在復(fù)方湯液煎煮過程中發(fā)生酸堿絡(luò)合反應(yīng)，以絮狀物的形式被濾過除去部分，造成了成分損失[33-34]。

此外，黃芩素、漢黃芩素轉(zhuǎn)移率也較低，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，黃芩素與漢黃芩素本身不穩(wěn)定，易被氧化成醌類，且黃芩素和漢黃芩素是由黃芩中所含的一種酶水解黃芩苷和漢黃芩苷而成，此酶在冷水中活性較高，熱水中活性較低[35]，因此，其在煎煮過程中導(dǎo)致成分含量的下降。在水煎液-基準(zhǔn)樣品的過程中，部分批次的轉(zhuǎn)移率有些許升高，大于100%，推測在水溶液和凍干粉兩者不同的物理狀態(tài)下，導(dǎo)致雖在相同的溶劑和提取方法下檢測到的含量仍有些許差異，但11 種指標(biāo)成分在水煎液-基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率皆在規(guī)定范圍（均值的70%～130%）內(nèi)，說明該基準(zhǔn)樣品的制備工藝穩(wěn)定可行，成分具有良好傳遞性。該研究為后續(xù)GQD 基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量控制提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突