指紋圖譜、一測多評與模式識別相結合的忍冬藤配方顆粒質量評價

曹桂云，寧 波，余彩娟，莊雪松，劉羽康，王岱杰，林永強，董曉弟，楊純國，崔偉亮，劉洪超，孟兆青*

1. 山東宏濟堂制藥集團股份有限公司 山東省中醫藥治療呼吸系統疾病技術創新中心，山東 濟南 250103

2. 齊魯工業大學（山東省科學院）山東省分析測試中心，山東 濟南 250014

3. 山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101

4. 山東一方制藥有限公司，山東 臨沂 276000

忍冬藤LoniceraeJaponicaeCaulis是忍冬科忍冬屬植物忍冬LonicerajaporacaThunb.的干燥莖枝，有清熱解毒、疏風通絡之功效。用于溫病發熱、風濕熱痹、癰腫瘡瘍、關節紅腫熱痛[1]。忍冬藤最早記載于漢末的《名醫別錄》，其性甘味寒，尤善清熱解毒、疏風通絡[2]。《本草綱目》稱其“莖葉及花，功用皆同，治一切濕氣及諸腫痛”。現代研究發現，忍冬藤與金銀花所含化學成分相似，主要為有機酸、黃酮類、環烯醚萜苷類等化合物[3-4]，具有抗菌、抗炎、抗氧化、調節機體免疫力等多種藥理作用[5-7]。

忍冬藤配方顆粒是由忍冬藤飲片經水提取后濃縮干燥而成，具有免煎易服，易儲存，攜帶方便、便于調劑等優點，滿足了隨證加減的臨床用藥特點，已經成為忍冬藤臨床用藥的重要形式。因此建立完善的忍冬藤配方顆粒質量評價方法規范忍冬藤配方顆粒質量并明確忍冬藤配方顆粒與臨床湯劑一致性對于其臨床應用具有十分重要的意義。國家藥品監督管理局于2021 年發布的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》[8]（下稱《技術要求》）明確了“標準湯劑”的概念及標準湯劑的制備方法與工藝，并對配方顆粒質量標準評價系統的建立提供了思路與依據。目前僅有4 篇文獻報道了忍冬藤標準湯劑及配方顆粒相關研究。胥愛麗等[9]建立了忍冬藤配方顆粒的HPLC 指紋圖譜。李志嬌等[10]建立了HPLC 法同時測定忍冬藤配方顆粒中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷等3 種成分含量的方法。余德發等[11]以出膏率和綠原酸、馬錢苷的含量及轉移率為評價指標對忍冬藤配方顆粒的制備工藝進行了研究。范帥帥等[12]制備了15 批忍冬藤標準湯劑，以綠原酸、咖啡酸、馬錢苷作為定量檢測指標，計算出膏率、含量和轉移率，并建立超高液相色譜指紋圖譜分析方法。其中前3 篇報道未基于標準湯劑進行研究，第4 篇報道采用購買的飲片進行標準湯劑的制備，均不符合《技術要求》相關規定，導致所測定配方顆粒中馬錢苷含量數據及出膏率數據與忍冬藤配方顆粒國家標準差距較大，難以反映現行忍冬藤配方顆粒質量。這些報道還存在研究指標成分過少或單一、未制定配方顆粒指標成分含量限度等問題，難以用于忍冬藤配方顆粒的全面質量控制。另外，尚無忍冬藤配方顆粒與對其飲片臨床用藥的一致性相關研究，不利于忍冬藤配方顆粒的臨床配伍使用。

本研究根據《技術要求》相關規定，于山東、河南、河北等地收集代表性藥材，炮制成飲片，制備標準湯劑，并建立忍冬藤質量評價標準，并以標準湯劑出膏率、指紋圖譜及新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷6 個特征成分含量和轉移率評價忍冬藤配方顆粒與標準湯劑的一致性，為忍冬藤配方顆粒的質量控制、工藝研究及臨床應用提供參考。

1 儀器與材料

Agilent1260 型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；BSA224S-CW 型1/1 萬電子天平，賽多利斯科技儀器（北京）有限公司；TS8606 型凍干機，菲維科公司；XS105 型1/10 萬電子天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；YRE2000A 型旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；KQ-800VSW型雙頻靜音型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；KDM 型可調控溫電熱套，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

忍冬藤對照藥材，批號121069-202107，中國食品藥品檢定研究院；對照品隱綠原酸（批號250031-202104）、新綠原酸（批號240008-202110）、當藥苷（批號260014-202108），質量分數均為98.0%，上海鴻永生物科技有限公司；對照品馬錢苷酸，批號ST05430120，質量分數98.0%，上海詩丹德生物技術有限公司；對照品綠原酸，批號 110753-202119，質量分數96.3%，中國食品藥品檢定研究院；對照品馬錢苷，批號200359-200604，質量分數99.9%，江蘇永健醫藥科技有限公司。

15 批忍冬藤藥材來源見表1，經山東省食品藥品檢驗研究院林永強主任藥師鑒定，為忍冬科忍冬屬植物忍冬L.japoracaThunb.的干燥莖枝。水為超純水，乙腈、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純。忍冬藤配方顆粒，山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，批號220501、220502、220503、220504、220505、220506，編號S16～S21；北京康仁堂藥業有限公司，批號22015443，編號S22；山東一方制藥有限公司，批號G2020732、G2020742、G2020721，編號S23～S25；忍冬藤配方顆粒規格均為每克中藥配方顆粒均相當于飲片6.5 g。

表1 15 批忍冬藤藥材信息Table 1 Information of 15 batches of LJC

2 方法與結果

2.1 忍冬藤標準湯劑凍干粉及配方顆粒制備

2.1.1 忍冬藤標準湯劑凍干粉的制備 將15 批忍冬藤藥材按照《中國藥典》2020 年版一部忍冬藤飲片【炮制】項下的方法炮制，即除去雜質，洗凈，悶潤，切段，干燥，得到15 批忍冬藤飲片（批號與藥材批號對應相同，編號YP1～YP15）。結合現代臨床用藥習慣，標準湯劑制備工藝確定為稱取15批忍冬藤飲片不少于100 g，置于砂鍋中，加水煎煮2 次，第1 次加10 倍量水浸泡30 min，武火煮沸后改為文火煎煮20 min，第2 次加8 倍量水武火煮沸后改為文火煎煮15 min，趁熱用200 目篩濾過，合并濾液，減壓濃縮，冷凍干燥，即得15 批標準湯劑凍干粉（編號S1～S15）。

2.1.2 忍冬藤配方顆粒制備 取忍冬藤飲片6 500 g，加水煎煮，濾過，濾液濃縮成清膏，干燥，加入輔料適量，制粒，制成1 000 g，即得。其中，山東宏濟堂制藥集團股份有限公司 220501、220502、220503（編號S16～S18）批配方顆粒由YF2104005批（編號YC3）藥材炮制成飲片，制備成配方顆粒。

2.2 忍冬藤標準湯劑和配方顆粒HPLC 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫：0～40 min，6%～9%乙腈；40～50 min，9%乙腈；50～51 min，9%～13%乙腈；51～70 min，13%～20%乙腈；70～80 min，20%乙腈；檢測波長0～60 min 為236 nm，60～80 min 為327 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。理論塔板數按馬錢苷峰計算不低于3 000。

2.2.2 參照物溶液的制備 取忍冬藤對照藥材1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，回流提取30 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，作為對照藥材參照物溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備 取馬錢苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成含馬錢苷60 μg/mL 的對照品溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備 預試驗采用單因素實驗分別對提取方式、提取溶劑、提取時間和取樣量等進行考察，確定供試品溶液制備方式為取忍冬藤配方顆粒或標準湯劑凍干粉適量，研細（過五號篩），取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.5 專屬性試驗 取忍冬藤配方顆粒所使用的輔料（糊精）適量，按照“2.2.4”項下制備方法制備成陰性對照溶液；取忍冬藤配方顆粒供試品溶液、馬錢苷對照品溶液、陰性對照溶液按“2.2.1”項下方法獲得其色譜圖，結果表明（圖1）陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 忍冬藤配方顆粒的專屬性分析Fig. 1 Chromatogram of specificity determination of LJC dispensing granules

2.2.6 重復性試驗 精密稱取同一批號忍冬藤配方顆粒樣品6 份，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，以馬錢苷峰為參照峰，考察各共有峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，結果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD＜2%，相對峰面積的RSD＜3%，供試品指紋圖譜相似度＞0.90，表明該方法的重復性較好。

2.2.7 中間精密度試驗 由2 個分析人員在不同日期分別按“2.2.4”項下方法分別制備6 份供試品溶液，利用不同儀器按“2.2.1”項下色譜條件檢測，以馬錢苷峰為參照峰，考察各共有峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，結果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD＜3%，相對峰面積的RSD＜5%，供試品指紋圖譜相似度＞0.90，表明該方法的中間精密度較好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 按“2.2.1”項下色譜條件測定，以馬錢苷峰為參照峰，考察各共有峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，結果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD＜1%，相對峰面積的RSD＜3%，供試品指紋圖譜相似度＞0.90，表明供試品溶液穩定性較好。

2.2.9 指紋圖譜的建立 取15 批忍冬藤標準湯劑和10 批忍冬藤配方顆粒樣品，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），其疊加色譜圖見圖2。對15 批忍冬藤標準湯劑的指紋圖譜進行多點校正和Mark 峰匹配后，生成忍冬藤標準湯劑的對照指紋圖譜（R），見圖3。共標定16 個共有峰，并指認了其中11 個成分，分別為新綠原酸（峰3）、馬錢苷酸（峰5）、8-表馬錢酸（峰6）、綠原酸（峰7）、隱綠原酸（峰8）、當藥苷（峰10）、馬錢苷（峰11）、斷氧化馬錢子苷（峰12）、異綠原酸B（峰14）、異綠原酸A（峰15）、異綠原酸C（峰16）。

圖2 忍冬藤標準湯劑 (S1～S15) 和配方顆粒 (S16～S25) 的HPLC 指紋圖譜Fig. 2 HPLC fingerprints of LJC standard decoctions (S1—S15) and dispensing granules (S16—S25)

圖3 忍冬藤標準湯劑對照指紋圖譜Fig. 3 Reference fingerprint of LJC standard decoctions

2.2.10 忍冬藤配方顆粒與標準湯劑的指紋圖譜比較 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）計算相似度，忍冬藤配方顆粒與標準湯劑對照指紋圖譜的相似度均＞0.9，S16～S18 批配方顆粒與相應標準湯劑（S3）圖譜相似度＞0.95，表明配方顆粒的生產工藝較為穩定且化學成分與標準湯劑一致性較好。15 批忍冬藤標準湯劑與對照指紋圖譜的相似度＞0.9，說明不同批次忍冬藤飲片所制備的標準湯劑具有較高的相似度。

2.2.11 聚類分析 將15 批忍冬藤標準湯劑指紋圖譜中16 個特征峰的峰面積按制成量折算配方顆粒峰面積，將折算后的峰面積和10 批配方顆粒的峰面積導入SPSS 20.0 軟件進行聚類分析，結果見圖4。結果發現，當刻度距離為15 時，可分為2 類，配方顆粒S16～S25 與標準湯劑S1～S13、S15 聚為一類，標準湯劑S14 單獨聚為一類，說明配方顆粒的生產工藝較穩定，且化學成分與標準湯劑一致性較好。

圖4 15 批忍冬藤標準湯劑和10 批配方顆粒指紋圖譜聚類分析Fig. 4 Fingerprint cluster analysis map of 15 batches of LJC standard decoction and 10 batches of dispensing granules

2.2.12 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將15 批忍冬藤標準湯劑HPLC 指紋圖譜中16個特征峰的峰面積按制成量折算配方顆粒峰面積，將折算后的峰面積和10 批配方顆粒的峰面積導入SPSS 20.0 軟件進行PCA，以特征值＞1 為提取標準得到3 個主成分，其方差貢獻率分別為52.63%、23.89%、10.15%，累積方差貢獻率為86.67%，可以代表16 個共有成分的大部分信息，得分圖見圖5。結果發現配方顆粒與標準湯劑的成分較為一致，但存在3 批配方顆粒（S23～S25）與其余配方顆粒及標準湯劑樣品分布距離較遠，分析其原因是由于該3 批配方顆粒峰10（當藥苷）峰面積偏高所致。

圖5 15 批忍冬藤標準湯劑和10 批配方顆粒PCA 得分圖Fig. 5 PCA score chart of 15 batches of LJC standard decoction and 10 batches of dispensing granules

2.2.13 偏最小二乘法-判別分析（partial least squares- discriminant analysis，PLS-DA） 將15 批忍冬藤標準湯劑指紋圖譜中16 個特征峰的峰面積按制成量折算配方顆粒峰面積，將折算后的峰面積和10 批配方顆粒的峰面積導入SIMCA 14.1 軟件進行PLS-DA，獲得相應模型，模型參數為RX2為0.985，RY2為0.886，Q2為0.695，均大于0.5，表明擬合模型的準確度和預測能力較好，結果見圖6。結果與相似度分析、PCA 結果相似，配方顆粒S16～S18與其對應標準湯劑S3 分布集中，10 批配方顆粒分布集中，表明配方顆粒生產工藝穩定性較好，成分與標準湯劑一致性較好，以上結果與聚類分析及PCA 相似。

圖6 15 批忍冬藤標準湯劑和10 批配方顆粒PLS-DA 得分散點圖Fig. 6 PLS-DA score scatter plots of 15 batches of LJC standard decoction and 10 batches of dispensing granules

2.3 忍冬藤配方顆粒的HPLC 定量方法研究

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫：0～40 min，6%～9%乙腈；40～55 min，9%乙腈；55～65 min，9%～75%乙腈；檢測波長236 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。理論板數按綠原酸峰計算不低于3 000。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 取新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷對照品適量，精密稱定，加入30%甲醇制成質量濃度分別為0.975 1、1.301 4、1.508 0、1.146 6、1.173 1、2.081 2 mg/mL 的混合對照品儲備液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 采用單因素實驗分別對供試品提取方式、提取溶劑、提取時間和取樣量等進行考察，確定供試品溶液制備方式為取忍冬藤配方顆粒或標準湯劑凍干粉適量，研細（過五號篩），取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，用30%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3.4 專屬性考察 取忍冬藤配方顆粒所使用的輔料（糊精）適量，按照“2.3.3”項下方法制備成陰性對照溶液；取忍冬藤配方顆粒供試品溶液，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷混合對照品溶液，空白溶液，陰性對照溶液，按“2.3.1”項下方法獲得其色譜圖，結果表明（圖7）表明陰性對照無干擾，方法專屬性良好。

圖7 忍冬藤配方顆粒的專屬性分析Fig. 7 Chromatogram of specificity determination of LJC dispensing granules

2.3.5 線性關系考察 采用逐級稀釋法，精密量取適量新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷混合對照品儲備液，置于10 mL 量瓶中，加入30%甲醇定容，稀釋得到質量濃度分別為97.51、130.14、150.80、114.66、117.31、520.30 μg/mL的對照品溶液，分別稀釋1、2、4、8、16 倍，從低到高濃度的混合對照品溶液編號分別為I～V，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，每個質量濃度平行進樣2 次，以質量濃度為橫坐標（X），色譜峰峰面積積分值為縱坐標（Y）進行線性回歸，得到各指標成分的回歸方程和相關系數，結果分別為新綠原酸Y＝11.290X－11.353，r＝0.999 9，線性范圍6.09～97.51 μg/mL；馬錢苷酸Y＝14.637X－7.810 6，r＝1.000 0，線性范圍8.13～130.14 μg/mL；綠原酸Y＝18.175X－31.221，r＝0.999 9，線性范圍9.42～150.80 μg/mL；隱綠原酸Y＝10.862X－22.52，r＝0.999 8，線性范圍7.17～114.66 μg/mL；當藥苷Y＝12.731X－4.369 5，r＝1.000 0，線性范圍7.33～117.31 μg/mL；馬錢苷Y＝15.108X－23.868，r＝1.000 0，線性范圍32.52～520.30 μg/mL。

2.3.6 中間精密度試驗 由2 個分析人員在不同日期分別按“2.3.3”項下方法制備6 份供試品溶液，利用不同儀器按“2.3.1”項下色譜條件檢測，結果忍冬藤配方顆粒中新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷峰面積的RSD 分別為1.96%、1.60%、2.97%、2.26%、2.48%、0.30%，結果表明方法中間精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗 取220501 批次忍冬藤配方顆粒供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷峰面積的RSD 分別為1.66%、0.30%、0.88%、2.64%、0.14%、0.34%，結果表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.8 重復性試驗 精密稱取220501 批次忍冬藤配方顆粒樣品，共6 份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷質量分數的RSD 分別為1.16%、0.48%、0.67%、0.53%、0.53%、0.71%，結果表明該方法的重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取0.1 g 忍冬藤配方顆粒，分別加入新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷對照品儲備液0.4、1.5、0.2、0.3、0.4、0.7 mL，按“2.3.3”項下方法制備溶液，平行制備6 份，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率，結果表明，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷的平均加樣回收率分別為99.01%、102.18%、99.92%、97.72%、96.99%、97.42%，RSD 分別為2.26%、1.65%、1.20%、2.64%、2.33%、2.48%，符合分析要求。

2.4 忍冬藤配方顆粒的一測多評方法建立研究

2.4.1 相對校正因子（fi/s）計算 精密吸取“2.3.5”項下系列混合對照品溶液I～V 各適量，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以綠原酸為內參物（s），計算新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷的fi/s，計算公式fi/s＝AsCi/AiCs，As為內標峰面積，Cs為內標質量濃度，Ai為待測物峰面積，Ci為待測物質量濃度。結果見表2。

表2 fi/s 計算結果Table 2 fi/s of each component reference

2.4.2fi/s重現性考察 分別考察3 臺不同Agilent 1260 高效液相色譜儀、1 臺Waters e2695 高效液相色譜儀和6 根不同色譜柱對fi/s的影響，結果見表3，測得的fi/s的RSD 值在2.31%～2.72%，表明各待測組分fi/s在不同儀器和不同色譜柱之間重現性良好。

表3 不同儀器和色譜柱對fi/s 的影響Table 3 Effects of different instruments and chromatographic columns on fi/s

分別考察不同體積流量及柱溫對fi/s的影響，結果見表4，測得的fi/s的RSD 值分別在0.56%～1.40%，表明各待測組分fi/s在不同體積流量及柱溫之間重現性良好。

2.4.3 待測組分色譜峰定位 分別計算各待測組分與內參物綠原酸的相對保留時間（tR）與保留時間差（Δt），并考察其在不同儀器和不同色譜柱之間的重現性，結果表明（表5），相對保留時間波動較小，最終選擇不同儀器和不同色譜柱中各待測成分的相對保留時間值的平均值作為峰定位依據。

表5 不同儀器和色譜柱中各目標成分的相對保留時間及保留時間差Table 5 Values of r and ΔtR determined by different instruments and columns

2.4.4 一測多評法與外標法測定結果的比較 分別采用一測多評法和外標法計算待測成分的含量，結果見表6。外標法與一測多評法計算的含量經t檢驗比較，P遠大于0.05，表明2 種方法測得的含量無明顯差異，且2 組含量之間RSD＜2%，表明所建立的一測多評法準確性良好，可用于忍冬藤配方顆粒及標準湯劑的含量測定。

表6 外標法與QAMS 測定忍冬藤中6 種成分含量的比較Table 6 Comparison of six effective constituents determined by external standard method and QAMS in LJC

2.5 忍冬藤配方顆粒與標準湯劑出膏率、有效成分含量及轉移率比較

對標準湯劑和配方顆粒的出膏率進行測定，結果見表7、8。15 批標準湯劑的出膏率在7.80%～14.57%，出膏率平均值為11.80%，平均值的70%～130%分別為8.26%～15.34%。3 批配方顆粒的出膏率為14.40%～14.80%，均在15 批標準湯劑出膏率平均值±30%范圍內。分別取15 批忍冬藤標準湯劑和3 批配方顆粒，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3.1”項下色譜條件測定新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷含量。由表7 可知，15 批標準湯劑中新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷質量分數分別為2.09～8.60、6.91～21.84、2.71～6.83、1.94～8.72、1.51～6.81、10.26～33.88 mg/g，平均值分別為4.76、11.96、5.14、4.78、3.98、22.73 mg/g。

表7 忍冬藤標準湯劑的出膏率，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷的含量及轉移率Table 7 Extraction rate of LJC standard decoction, content and transfer rate of new chlorogenic acid, loganic acid,chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, sweroside and loganin

表8 忍冬藤配方顆粒的出膏率、指標成分含量及轉移率Table 8 Extraction rate, index ingredients content and transfer rate of LJC dispensing granules

為計算該6 種成分從飲片到配方顆粒和標準湯劑的轉移率，需測定其在飲片中的含量。經過考察，確定其測定方法為分別取15 批忍冬藤飲片粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，稱定質量，回流提取30 min，放冷，用30%甲醇補足減失的質量，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，并計算飲片中新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷含量。6 種指標成分從飲片到標準湯劑的轉移率分別為新綠原酸24.14%～41.75%、馬錢苷酸40.64%～70.83%、綠原酸26.48%～44.22%、隱綠原酸29.58%～51.97%、當藥苷28.96%～46.59%、馬錢苷45.73%～84.73%，平均值分別為33.25%、54.53%、35.41%、42.23%、37.10%、65.19%。雖然各指標成分含量差異較大，但轉移率較穩定，分析可知是由于相應飲片中指標成分含量差異大。根據《技術要求》，配方顆粒藥效物質應與標準湯劑保持一致，需根據標準湯劑的含量及含量轉移率范圍制定合理含量上下限度。

配方顆粒在制備過程中加入了一定量的輔料，按制成量換算15 批標準湯劑中6 種成分的含量，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷在配方顆粒中理論質量分數分別為1.57～5.14、4.20～19.81、2.04～6.28、1.46～5.49、1.14～4.84、9.31～32.10 mg/g，平均值為3.34、9.53、3.85、3.42、2.90、16.74 mg/g，分別計算±s、±2s、±3s、平均值的70%～130%范圍，為更好的控制配方顆粒的質量，取指標成分含量下限為平均值的70%，含量上限為＋3s，將該范圍作為配方顆粒可接受的含量限度范圍，即新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷質量分數限度范圍分別為2.34～7.09、6.67～22.47、2.70～6.97、2.40～7.24、2.03～6.13、11.72～31.93 mg/g。經測定（表6），S16～S22 批配方顆粒6 種指標成分的含量符合所制定配方顆粒含量限度要求，S23～S25批配方顆粒當藥苷含量略高于限度范圍，其余指標成分含量符合所制定配方顆粒含量限度要求。S23～S25 批配方顆粒均購自山東一方制藥有限公司，推測其生產工藝參數或生產設備可能與其他廠家存在差異導致當藥苷含量略高于限度要求。

指標成分從飲片到3 批配方顆粒（S16～S18）的轉移率分別為46.16%～47.20%、41.87%～42.26%、39.64%～40.17%、58.20%～59.42%、31.14%～31.26%、84.06%～86.26%，基本符合15 批標準湯劑轉移率平均值±30%范圍。以上數據說明配方顆粒制備工藝較為合理。

3 討論

3.1 標準湯劑的制備

標準湯劑是指以傳統中醫藥理論作為指導，選取主產區藥材或道地藥材，經加工炮制而成合格飲片后，按照臨床應用時傳統湯劑的煎煮方法，參照現代中藥提取方法制備而成的單味中藥飲片水煎劑。本研究購買15 批次代表性藥材炮制成飲片制備標準湯劑。忍冬藤屬于清熱解毒類中藥，藥用部位為藤木。《技術要求》標準湯劑制備中規定，清熱類藥物不宜久煎，煮沸后再煎煮20 min 為宜，質地較硬的飲片可適當延長煎煮時間。結合現代臨床用藥習慣，在《醫療機構中藥煎藥室管理規范》相關規定的基礎上，出膏率和新綠原酸等6 種指標成分的轉移率為主要指標對標準湯劑制備的工藝參數進行優化對標準湯劑制備工藝參數進行考察，確定標準湯劑制備工藝。按照固化的工藝對飲片進行提取，對提取液進行濃縮、凍干，制備成標準湯劑，標準湯劑制備工藝合理，可用于配方顆粒工藝合理性判斷及質量標準制定。

3.2 指標性成分的選擇

忍冬藤的化學成分較為豐富，其中的主要活性成分為環烯醚萜苷類和有機酸類。對忍冬藤配方顆粒進行成分分析，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷在忍冬藤中含量較大，生物活性較高[13-21]，綠原酸和馬錢苷也是《中國藥典》忍冬藤藥材及飲片質量控制所采用的指標成分。因此，將此6 種成分作為忍冬藤配方顆粒質量評價的指標。

建立一測多評法檢測6 種成分含量的方法，其中，綠原酸化學性質穩定且廉價易得，作為內標物，建立其與新綠原酸、馬錢苷酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷的fi/s，在不同液相色譜系統與色譜柱中RSD均小于5%，符合測定要求。故選擇綠原酸為內標物，以降低檢測成本。此方法的建立為全面考察忍冬藤質量提供了參考方法，提示在缺少對照品的情況下，通過fi/s及色譜峰的定位計算含量，可以實現忍冬藤中6 種成分的質量控制。該方法作為忍冬藤質量的一種有效評價方式，可為忍冬藤的質量評價提供參考和依據。

3.3 配方顆粒質量評價標準的建立及與標準湯劑對比分析

本研究收集了4 個產地的15 批忍冬藤藥材，根據《技術要求》制備標準湯劑，采用高效液相色譜法建立了忍冬藤標準湯劑和配方顆粒的指紋圖譜，建立忍冬藤標準湯劑和配方顆粒中新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、馬錢苷的含量測定方法。以出膏率、指紋圖譜、6 種指標成分含量及轉移率為指標，并結合化學模式識別分析，多維度衡量了忍冬藤配方顆粒與標準湯劑的一致性，為忍冬藤配方顆粒的生產工藝的研究提供依據。

配方顆粒出膏率在標準湯劑出膏率平均值±30%范圍內；3 批配方顆粒與其對應標準湯劑的指紋圖譜相似度均＞0.95，10 批配方顆粒的指紋圖譜相似度＞0.9；聚類分析顯示3 批配方顆粒可與其對應標準湯劑聚成一類，10 批配方顆粒可與14 批標準湯劑聚為一類；PCA 與PLS-DA 顯示3 批配方顆粒對其應標準湯劑S3 分布集中，10 批配方顆粒分布較為集中；除S23～S25 批配方顆粒當藥苷含量略高，指標成分的含量在標準湯劑按制成量換算后含量平均值的70%～＋3s范圍內；6 種指標成分從飲片到配方顆粒中的轉移率基本符合從飲片到標準湯劑轉移率平均值的70%～130%；以上結果說明忍冬藤配方顆粒制備工藝合理，與忍冬藤飲片臨床湯劑物質基礎基本一致。以上研究能夠比較全面的反映忍冬藤配方顆粒的內在質量，可忍冬藤配方顆粒在臨床中的應用提供研究基礎，并為其他配方顆粒研究提供思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突