基于脂肪可塑性研究大黃素對肥胖小鼠的改善作用和機制

馮倩倩，賀潤鋮，張 磊，耿 楊，趙子陽，史浩男，賈占紅，張碩峰，孫建寧，董世芬

北京中醫藥大學中藥學院 中藥藥理系，北京 102488

隨著生活水平的提高，以脂質代謝異常為共同特征的相關代謝疾?。òǚ逝帧⑻悄虿?、心血管和肝臟疾病以及衰老等），發病率逐年升高，預計到2030 年，我國成人超重及肥胖患病率將達到65.3%[1]。肥胖癥是常見的慢性脂質代謝性疾病，主要表現為體內脂肪含量過多、體脂分布失調以及局部脂肪沉積。肥胖的病生理原因主要包括攝食異常、脂肪組織功能障礙、瘦素受體缺陷或其信號轉導改變、腸道菌群紊亂。多數肥胖癥患者存在嚴重的脂質代謝紊亂，并與2 型糖尿病、冠心病、高血壓等合并存在形成惡性循環，致使疾病加重[2]，對身心健康造成嚴重負擔。據估算，2000—2025 年，我國因肥胖導致的經濟損失將達到國民生產總值的3.6%～8.7%，造成了重大的社會經濟負擔[3]。因此，從改善脂質代謝角度尋找肥胖癥的治療藥物具有重要意義。

脂肪具有可塑性特點。脂肪組織是一類具有高度動態變化的內分泌器官，在能量代謝穩態維持過程具有重要作用。哺乳動物的脂肪組織主要由白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）、棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）及米色脂肪組織組成。WAT 可將機體過剩的能量以三酰甘油（triglycerides，TG）形式在體內積聚；BAT 是一種產熱組織，能夠通過加快脂肪的氧化產熱，促進機體的能量代謝和消耗，人體50 g BAT（＜0.1%體質量）最多可利用超過20%的基礎熱量。WAT 細胞被藥物誘導或冷暴露刺激后“褐變”產生棕色樣脂肪細胞，也就是米色脂肪細胞，獲得棕色化的表型特征，改善因肥胖引起的代謝紊亂[4-7]，是目前廣受關注的對抗肥胖、糖尿病的治療方法。大黃素是一種天然蒽醌苷元，是大黃中的主要成分，體內外研究發現，大黃素具有抗糖尿病、抗肥胖、抗骨質疏松、抗癌等藥理作用[8-9]。課題組前期研究發現，大黃素為三黃瀉心湯改善肥胖的主要有效成分之一，進一步研究發現大黃素可有效抑制肥胖，并且與調節脂肪組織小分子代謝物有關，推測脂肪組織是大黃素改善肥胖的關鍵作用位置。因此，本研究深入探究大黃素對脂肪可塑性的影響以及改善肥胖的作用及機制，旨在為肥胖治療提供新的思路。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠48 只，6 周齡，體質量（20±2）g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，合格證號SCXK（京）2019-0010。小鼠飼養于北京中醫藥大學屏障環境動物實驗室（溫度20～24 ℃、相對濕度50%～70%、明暗12 h/12 h），使用許可證號SYXK（京）2020-0033。動物實驗通過北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會批準（批準號BUCM-4-2021102003-4054）。

1.2 藥品與試劑

大黃素（ 質量分數為 95.0% ， 批號T17O11F127680）、馬來酸羅格列酮（質量分數為99%，批號S17088）購自上海源葉生物科技有限公司；β3-腎上腺素受體激動劑CL316243（批號C5795）購自美國Sigma-Aldrich 公司；D12492 高脂飼料購自斯貝福（北京）生物技術有限公司；羧甲基纖維素鈉（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na，批號S14016）購自上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖（批號20201028）購自北京百瑞極生物科技有限公司；血糖試紙（批號06454038022）購自瑞士Roche公司；TG 試劑盒（批號20211102）、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（批號20220114）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（批號20220114）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒（批號20220114）購自南京建成生物工程研究所；解偶聯蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）抗體（批號23673-1-AP）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活劑-1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）抗體（批號66369-1-Ig）、線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）抗體（批號22586-1-AP）、葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）抗體（批號66846-1-Ig）購自武漢三鷹生物技術有限公司；PR結構域蛋白16（positive regulatory domain-containing 16，PRDM16）抗體（批號PA5-20872）購自賽默飛世爾科技公司；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPdependent/activated protein kinase，AMPK）抗體（批號GR284787-18）、磷酸化AMPK（phosphorylated AMPK，p-AMPK）抗體（批號GR3357969-1）、β-actin抗體（批號GR3371313-1）購自英國Abcam 公司；4%多聚甲醛固定液（批號20210118）購自北京百瑞極生物科技有限公司；無水乙醇（批號100092683）、二甲苯（批號10023418）、中性樹膠（批號10004160）、正丁醇（批號1000521090）購自國藥集團化學試劑有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液套裝（批號G1003）、檸檬酸（pH6.0）抗原修復液（批號G1202）、EDTA 抗原修復液（pH 9.0，批號G1203）、EDTA 抗原修復液（pH 8.0，批號G1206）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號G5001）、超凈快干封片膠（批號G1404）、組化試劑盒DAB 顯色劑（批號G1211）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；PVDF 膜（批號 R0BB30223）購自德國 Merck Millipore 公司；山羊抗小鼠Ig 二抗（批號ZB-2301）、山羊抗兔Ig 二抗（批號ZB-2305）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；細胞組織快速裂解液RIPA（批號080320200921）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號120320210419）購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 儀器

LOT480134 型血糖儀（瑞士Roche 公司）；5810R 型高速冷凍式離心機（德國Eppendorf 公司）；TiS50 型紅外熱像儀（美國Fluke 公司）；蛋白電泳系統（美國Bio-Rad 公司）；Donatello 脫水機、Giotto染色機（意大利DIAPATH 公司）；JB-P5 型包埋機、JB-L5 型凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P 型組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；TSY-B 型脫色搖床（武漢賽維爾生物科技有限公司）；DS-U3 型成像系統、Eclipse E100 型正置光學顯微鏡（日本Nikon 公司）；Epoch 酶標儀（美國Bio Tek 公司）；Amersham Imager 680 型超靈敏多功能成像儀（美國 Cellular Technology 公司）；FBZ2001-up-p 型標準試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

取40 只C57BL/6J 小鼠喂食高脂飼料，另取8只小鼠喂食普通飼料作為對照組。造模8 周后，將造模小鼠按體質量隨機分為模型組，大黃素（40、80 mg/kg）組，CL316243（1 mg/kg）組和羅格列酮（10 mg/kg）組。大黃素組和羅格列酮組ig 給藥（20 mL/kg），1次/d，連續給藥4周；取材前3 d，CL316243組ip 給藥（10 mL/kg），1 次/d，連續3 d；對照組、模型組ig 等體積CMC-Na 溶液。

2.2 體質量的測定

給藥期間每周監測各組小鼠體質量的變化，考察大黃素對模型小鼠肥胖程度的影響。

2.3 Lee’s 指數的測定

藥物連續干預4 周后，稱定小鼠體質量，精確測量小鼠體長（鼻尖至肛門的距離），計算Lee's 指數。Lee's 指數為評價小鼠肥胖程度的指標。

2.4 紅外熱像儀測量小鼠肩胛骨皮膚溫度

末次給藥前1 d脫去小鼠背部肩胛骨處的毛發，第2 天各組小鼠的肩胛骨皮膚溫度由紅外熱像儀（Fluke TiS50 THERMAL IMAGER）在安靜狀態下測定，并用特定的軟件包（Smart view 4.3）分析。

2.5 口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT）

使用OGTT 研究高脂飲食小鼠體內的葡萄糖代謝情況。藥物連續干預4 周后，小鼠在禁食不禁水12 h 的情況下，采用剪尾法取血，用血糖儀試紙法測定小鼠血糖。ig 50%葡萄糖（2 g/kg），測定ig 后0、30、60、90、120 min 血糖值，繪制OGTT 時間曲線圖，并采用近似梯形方法計算曲線下面積（area under curve，AUC）。實驗結束小鼠放回籠子，保證充足的飲水和食物。

2.6 血清血脂水平檢測

給藥結束后，小鼠禁食不禁水12 h，麻醉取血約1 mL，3 500 r/min 離心10 min，分離血清。按照試劑盒說明書測定各組小鼠血清中TC、TG、LDLC 和HDL-C 的含量。

2.7 脂肪組織形態觀察和脂肪指數的測定

取血后，解剖分離皮下腹股溝白色脂肪組織（inguinal white adipose tissue，iWAT）、附睪白色脂肪組織（epididymal white adipose tissue，eWAT）、腎周白色脂肪組織（perirenal white adipose tissue，pWAT）、BAT，觀察各組小鼠iWAT、eWAT、pWAT、BAT 大小、厚度和顏色，稱定質量，計算脂肪指數。

脂肪指數＝脂肪質量/體質量

2.8 HE 染色檢測脂肪組織形態

用4%多聚甲醛固定iWAT、BAT，梯度脫水，石蠟包埋，制備成2～3 μm 厚的組織薄片，HE 染色，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.9 免疫組化法檢測UCP1 表達

石蠟切片進行常規脫蠟，將iWAT、BAT 切片放在抗原修復緩沖液中進行修復，滴加3%雙氧水溶液，避光室溫孵育25 min，PBS 洗滌3 次，滴加山羊血清封閉1 h。滴加UCP1 抗體（1∶500），將切片放入濕盒內4 ℃孵育過夜。滴加二抗，37 ℃孵育20 min，DAB 顯色，蘇木素復染3 min，常規脫水，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照，通過Image-Pro Plus 6.0 軟件處理數據。

2.10 Western blotting檢測脂肪棕色化相關蛋白表達

取各組小鼠的iWAT，加入細胞組織快速裂解液裂解，提取蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，于5%脫脂牛奶中封閉后，分別加入PGC-1α、PRDM16、TFAM、AMPK、p-AMPK、GLUT4 和β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次，加入二抗，37 ℃搖床孵育2 h；TBST 洗滌后，加入ECL 化學發光試劑顯影，Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.11 統計學分析

圖片使用Image J 軟件進行處理，實驗數據采用IBM SPSS Statistics 26 軟件進行統計，計量資料用±s表示，對于正態數據，多組間數據比較采用單因素方差分析法（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD。

3 結果

3.1 大黃素對肥胖小鼠體質量和Lee’s 指數的影響

如圖1 所示，與對照組比較，模型組小鼠體質量和Lee's 指數均顯著升高（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，給藥4 周時大黃素各劑量組體質量和Lee's 指數均顯著降低（P＜0.01、0.001），表明大黃素可顯著改善小鼠肥胖程度。

圖1 大黃素對肥胖小鼠體質量 (A) 和Lee’s 指數 (B) 的影響 (±s, n = 8)Fig. 1 Effect of emodin on body weight (A) and Lee’s index (B) of obese mice (±s, n = 8)

3.2 大黃素對肥胖小鼠肩胛骨體溫的影響

如圖2 所示，與對照組比較，模型組BAT 周圍的皮膚溫度顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素（40 mg/kg）組BAT 周圍的皮膚溫度顯著升高（P＜0.01），表明大黃素能促進肥胖小鼠的BAT產熱，激活BAT 功能。

圖2 大黃素對肥胖小鼠肩胛骨體溫的影響 (±s, n = 8)Fig. 2 Effect of emodin on scapular temperature of obese mice (±s, n = 8)

3.3 大黃素對肥胖小鼠脂肪組織形態和脂肪指數的影響

與對照組比較，模型組小鼠iWAT、eWAT、pWAT 明顯增大、增厚；與模型組比較，大黃素各劑量組iWAT、eWAT、pWAT 明顯變小、變薄，更褐色，有棕色化趨勢，BAT 無明顯變化，表明大黃素能有效減少肥胖小鼠的白色脂肪沉積，促進WAT棕色化。

如表1 所示，與對照組比較，模型組iWAT、eWAT、pWAT 指數均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，大黃素（40、80 mg/kg）組iWAT、eWAT、pWAT 指數均顯著降低（P＜0.001），表明大黃素能有效減少肥胖小鼠的白色脂肪沉積。

表1 大黃素對肥胖小鼠脂肪指數的影響 (±s, n = 8)Table 1 Effect of emodin on adipose index of obese mice (±s, n = 8)

表1 大黃素對肥胖小鼠脂肪指數的影響 (±s, n = 8)Table 1 Effect of emodin on adipose index of obese mice (±s, n = 8)

與對照組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下表同。##P ＜ 0.01 ###P ＜ 0.001 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs model group, same as below tables.

組別 劑量/(mg kg-1) iWAT 指數 eWAT 指數 pWAT 指數對照 — 0.004±0.001 0.008±0.001 0.002±0.001模型 — 0.016±0.002### 0.034±0.005### 0.014±0.002###大黃素 40 0.008±0.001*** 0.018±0.002*** 0.006±0.002***80 0.009±0.001*** 0.016±0.002*** 0.005±0.001***CL316243 1 0.006±0.001*** 0.010±0.002*** 0.004±0.001***羅格列酮 10 0.009±0.001*** 0.020±0.002*** 0.006±0.001***

3.4 大黃素對肥胖小鼠口服葡萄糖代謝的影響

如圖3 所示，葡萄糖耐量實驗中，與對照組比較，模型組空腹血糖及AUC 顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）；與模型組比較，大黃素（40 mg/kg）組空腹血糖顯著降低（P＜0.05、0.01），大黃素（40、80 mg/kg）組AUC 降低但無顯著性差異。

圖3 大黃素對肥胖小鼠葡萄糖耐量及AUC 的影響 (±s, n = 8)Fig. 3 Effect of emodin on glucose tolerance and AUC of obese mice (±s, n = 8)

3.5 大黃素對肥胖小鼠血脂的影響

如表2 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中TC、LDL-C 和HDL-C 水平均顯著升高（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，大黃素（40、80 mg/kg）組血清中TG、TC、LDL-C 水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），表明大黃素能改善肥胖小鼠的脂質代謝紊亂。

表2 大黃素對肥胖小鼠血脂的影響 (±s, n = 8)Table 2 Effect of emodin on blood lipid of obese mice (±s, n = 8)

表2 大黃素對肥胖小鼠血脂的影響 (±s, n = 8)Table 2 Effect of emodin on blood lipid of obese mice (±s, n = 8)

組別 劑量/(mg kg-1) TG/(mmol·L-1) TC/(mmol·L-1) LDL-C/(mmol·L-1) HDL-C/(mmol·L-1)對照 — 0.54±0.04 3.05±0.22 0.52±0.06 2.97±0.21模型 — 0.65±0.03 4.80±0.23### 1.26±0.13### 3.66±0.13##大黃素 40 0.44±0.05** 3.85±0.32** 0.54±0.06*** 3.50±0.07 80 0.46±0.05* 4.04±0.22* 0.57±0.06*** 3.31±0.18 CL316243 1 0.38±0.05*** 3.90±0.23* 0.60±0.06*** 3.01±0.14**羅格列酮 10 0.52±0.07 3.91±0.25* 0.50±0.05*** 3.41±0.09

3.6 大黃素對肥胖小鼠脂肪組織病理變化的影響

如圖4 所示，與對照組比較，模型組小鼠iWAT細胞直徑明顯變大，較為松散，WAT 細胞特征明顯；與模型組比較，大黃素（40、80 mg/kg）組小鼠iWAT細胞體積變小，排列更致密，形態趨向BAT細胞。

圖4 大黃素對肥胖小鼠脂肪組織病理變化的影響 (HE, ×400)Fig. 4 Effect of emodin on pathological change of adipose tissue in obese mice (HE, × 400)

與對照組比較，模型組小鼠BAT 細胞直徑較大，組織中具有單一空泡狀脂滴的細胞明顯增多，細胞形態更加趨向WAT 細胞；與模型組比較，大黃素（40、80 mg/kg）組小鼠BAT 細胞增多，排列緊密，細胞間毛細血管豐富，具有較為明顯的BAT 細胞形態特征。

3.7 大黃素對肥胖小鼠脂肪組織中UCP1 表達的影響

如圖5 所示，與對照組比較，模型組iWAT 中UCP1 陽性細胞表達減少但無顯著性差異；與模型組比較，大黃素（40、80 mg/kg）組小鼠UCP1 陽性細胞表達增多但無顯著性差異。

圖5 大黃素對肥胖小鼠iWAT 和BAT 中UCP1 蛋白表達的影響 (免疫組化, ×400)Fig. 5 Effect of emodin on UCP1 protein expression in iWAT and BAT of obese mice (immunohistochemistry, × 400)

與對照組比較，模型組小鼠BAT 中UCP1 陽性細胞表達顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素（40、80 mg/kg）組UCP1 陽性細胞表達顯著增多（P＜0.001）。

3.8 大黃素對肥胖小鼠iWAT中脂肪可塑性相關蛋白表達的影響

如圖6 所示，與對照組比較，模型組iWAT 中PRDM16、p-AMPK/AMPK 和GLUT4 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01、0.001），PGC-1α、TFAM蛋白表達水平降低但無顯著性差異；與模型組比較，大黃素（40、80 mg/kg）組PRDM16、p-AMPK/AMPK和GLUT4 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），大黃素（80 mg/kg）組PGC-1α、TFAM 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。

圖6 大黃素對肥胖小鼠iWAT 中PGC-1α、PRDM16、p-AMPK/AMPK、TFAM 和GLUT4 蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Fig. 6 Effect of emodin on PGC-1α, PRDM16, p-AMPK/AMPK, TFAM and GLUT4 protein expressions in iWAT of obese mice (±s, n = 3)

4 討論

肥胖對患者身心健康和社會經濟產生重大影響，因此研究改善肥胖癥的藥物作用及分子機制具有重要意義。為進一步研究大黃素改善肥胖的藥效作用及機制，采用高脂飼料喂養建立肥胖模型，研究大黃素對肥胖程度、糖脂代謝、組織形態變化及脂肪可塑性相關蛋白表達的影響。皮下iWAT 細胞較小并具有更大的分化潛力，因此常被用來作為WAT 棕色化的重要研究部位[10]；嚙齒類動物大部分BAT 位于背部肩胛區域[11]。因此，本研究對皮下iWAT 及肩胛部BAT 進行重點關注。本研究發現，大黃素可降低肥胖小鼠體質量、Lee's 指數、肩胛骨體溫、WAT 指數及iWAT 細胞大小，表明大黃素可改善小鼠肥胖程度，促進BAT 產熱，改善WAT、BAT 指數和形態。大黃素顯著降低血糖、TC、TG、LDL-C 水平，表明大黃素可以改善糖脂代謝紊亂。

研究發現，不同的脂肪細胞中糖代謝靶點GLUT4 的功能強度表達不一，在胰島素的刺激下較大的脂肪細胞中GLUT4 轉位和擴散都明顯弱于較小脂肪細胞[12]。本研究結果顯示，與模型組比較，大黃素組皮下iWAT 細胞明顯變小，GLUT4 表達顯著增加，表明大黃素可促進GLUT4 表達，改善糖代謝。UCP1、PRDM16 是重要的脂肪棕色化相關蛋白。UCP1 是一種特殊的線粒體蛋白，介導BAT 產熱過程。UCP1 在線粒體內膜上形成質子通道，內膜胞質側的H+可經此通道返回線粒體基質，使氧化磷酸化解偶聯而不合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），質子濃度梯度儲存的能量以熱能形式釋放[13]。因此，BAT 細胞的UCP1 活動被認為是一種很有前途的對抗肥胖和代謝疾病的策略。PRDM16 近年來被發現具有激活BAT 特異性的生熱程序、提高其線粒體密度、促進UCP1 的表達、增加能量消耗的作用[14]。同時，當WAT 中異位表達UCP1 和PRDM16 時，可作為識別WAT 細胞出現米色脂肪細胞的標志[15]。此外，PRDM16 也被證明是羅格列酮誘導褐變效應所必須的蛋白[16]。PRDM16 能夠誘導UCP1 以及其他棕色基因的表達，同時抑制包括抵抗素在內的特定WAT基因[17]。本研究中，大黃素顯著回調iWAT 中PRDM16 蛋白表達，表明大黃素可促進WAT 棕色化，激活BAT。

AMPK 是機體內最重要的代謝調控蛋白之一，在機體能量水平下降時被激活，通過磷酸化一系列下游因子促進分解代謝、抑制合成代謝，從而維持能量平衡。AMPK 被證明在調節米色脂肪組織和BAT 的代謝方面具有重要意義。在脂肪細胞中，AMPK 的激活能夠促使蛋白激酶A 磷酸化甘油三酯脂肪酶和激素敏感性脂肪酶，這些酶可促進細胞內脂肪分解，分解的產物游離脂肪酸是非顫抖產熱過程中必要的底物[18]。AMPK 的敲除會對WAT 棕色化功能造成明顯影響，當AMPKα1 被敲除后，WAT 中UCP1 表達水平劇烈下降[19]；AMPKβ1 敲除小鼠WAT 中PGC-1α 蛋白表達減少[20]，而AMPK激動劑能夠誘導WAT 棕色化發生，上調UCP1 的表達[21]。此外，研究發現，AMPK 可通過作用于腎上腺素能神經系統影響BAT 產熱，也可通過促進PRDM16 啟動子區的去甲基化促進PRDM16 表達，進而促進 BAT 生成[22]。給予去甲腎上腺素或CL316243 刺激后，AMPKβ1 促進PGC-1α 的表達同時增加PRDM16 的活性[20]。本研究中，在大黃素的作用下，iWAT 中p-AMPK/AMPK、PGC-1α、PRDM16 表達上調，表明大黃素可激活AMPK，促進WAT 棕色化，從而改善肥胖。

綜上，本研究基于脂肪可塑性探討了大黃素改善肥胖癥的作用及相關機制，證實了大黃素可在給藥4 周后有效抑制肥胖模型小鼠的肥胖程度，改善糖脂代謝紊亂，其機制與激活BAT，誘導WAT 棕色化有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突