牛蒡子-甘草藥對指紋圖譜的建立及其抗炎活性譜效關系研究

邢耀瑩 ，王姿楊 ，王 露 ，楊苗苗 ，龐 哲 ，趙 寧 ，崔治家 ，邵 晶 ,

1. 甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

2. 西北中藏藥省部共建協同創新中心，甘肅 蘭州 730000

3. 國家中醫藥管理局三級實驗室（中藥化學重點實驗室），甘肅 蘭州 730000

4. 甘肅省中醫藥研究中心，甘肅 蘭州 730000

5. 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

6. 甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，甘肅 蘭州 730000

藥對是中藥配伍組方的基本單位之一，通過組方的配伍分解，從闡釋藥對的藥效物質基礎和作用機制入手，是能有效、全面地闡釋中藥復方的重要途徑之一[1]。牛蒡子、甘草2 藥作為基本藥對配伍歷史悠久，獨立成方使用最早見《太平圣惠方》中記載：“牛蒡子散，牛蒡子1 兩（微炒）、甘草1 分（炙微赤，銼），治口瘡久不愈”[2]。后經《證類治裁》《奇效良方》《本草綱目》等多部中醫藥典籍進行轉載后形成了應用主治各異的新處方，如明代《痘治理辨》中記載“牛蒡子甘草散，牛蒡子（麩炒）1 兩、甘草（炙）1 錢，麻痘初作，服此則稀”[3]；清代《雜病源流犀燭》中記載“甘草鼠粘湯，甘草1 兩、鼠粘根2 兩，主治肺熱，咽喉痛”等[4-5]。現今常用的中藥復方如銀翹散、五福化毒丸、羚羊感冒片等中也多含有牛蒡子-甘草藥對，證明了牛蒡子-甘草藥對配伍使用的廣泛性和臨床有效性[6-7]。其中牛蒡子辛苦而寒，具有疏散風熱、宣肺透疹、解毒利咽之功[8]，甘草甘平，能夠清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛等[9]，2 藥相伍，清補合法。現代研究表明牛蒡子、甘草均具有抗炎、抗病毒、免疫調節等作用，與牛蒡子含有的木脂素類（牛蒡苷、牛蒡苷元）、綠原酸類（綠原酸A、B、C）等成分以及甘草含有黃酮類（甘草素、異甘草素、甘草查耳酮A）和三萜皂苷類（甘草酸、甘草次酸）等成分密切相關[10-11]。

炎癥反應是機體對外界物理、化學或生物刺激及感染、內源組織損傷等做出的防御性免疫反應，廣泛發生于機體的細胞、組織和器官等[12]。依據其發生程度和持續時間的不同分為急性炎癥和慢性炎癥，急性炎癥持續時間較短，如局部組織損傷所致的發熱、紅腫、疼痛等。慢性炎癥持續時間較長，炎癥因子的長期異常分泌會導致關節炎、糖尿病、自身免疫性疾病以及腫瘤等多種炎癥性疾病的發生[13]。當機體處于過度炎癥的環境下，巨噬細胞通過釋放大量炎癥因子來調控炎癥反應，如一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等[14]。脂多糖為革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，能夠刺激巨噬細胞釋放炎癥因子，常作為構建RAW264.7 巨噬細胞炎癥模型的常用試劑，且該模型作為篩選抗炎藥物的經典模型被廣泛應用[15]。目前有關牛蒡子、甘草的報道主要聚焦于各單味藥材的研究，而對于2 藥配伍使用的藥效物質基礎及作用機制研究較少，探討其抗炎活性具有實際意義。

如何全面地反映牛蒡子-甘草藥對抗炎活性成分的關鍵在于探索牛蒡子-甘草藥對的抗炎作用物質基礎。中藥譜效學以中藥指紋圖譜為研究基礎，與藥效評價相結合，并應用生物信息學方法建立譜-效相關性分析，可為揭示中藥藥效物質提供科學依據[16]。本研究基于牛蒡子、甘草藥對臨床應用的歷史有效性和廣泛性，以收集到的18 批樣品研究建立牛蒡子-甘草藥對HPLC 指紋圖譜，以脂多糖刺激RAW264.7 細胞制備炎性細胞，分析HPLC 共有峰與炎性指標間的譜效相關性，以期為牛蒡子-甘草藥對抗炎的有效成分群的闡釋及藥效學機制研究提供科學基礎，為進一步開發利用該藥對提取物的質量評價提供參考，也為含有該藥對的中藥復方藥效物質基礎及作用機制的全面闡釋提供研究基礎和思路方向。

1 材料

1.1 細胞

RAW264.7 細胞株（批號JF4RFYWU3S）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥材

炒牛蒡子、甘草藥材購自不同生產廠家，以同一廠家藥材為原則進行配對，經甘肅中醫藥大學崔治家教授分別鑒定為菊科牛蒡屬植物牛蒡Arctium lappaL.的干燥成熟果實和豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。具體信息見表1。

表1 牛蒡子-甘草樣品信息Table 1 Information of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma samples

1.3 試劑

甲醇（批號20220103）、乙腈（批號20221005）、甲酸（批號20280825）為色譜純，均購自天津市大茂化學試劑廠；95%乙醇（批號20190301）為分析純，購自天津市富宇精細化工有限公司；對照品異甘草苷（批號Y15A10H95344）、異綠原酸B（批號AF20060701）、甘草素（批號C26A10Q87040）、異綠原酸A（批號AF20020302）、甘草查耳酮A（批號 A19GB145817 ）、 牛蒡苷元（ 批號Y26D6Y17483）、甘草酸（批號Y02J11L113432）、甘草苷（批號Z07J12X136344）、牛蒡子苷（批號Z11D6B7394）、異甘草素（批號H03D9Z76567）、綠原酸（批號 B20782）、異綠原酸 C（批號AF20121801）、甘草次酸（批號B31O9D73752）均購自上海源葉生物科技有限公司，質量分數均≥98%；脂多糖（批號820F036）、MTT（批號917Q054）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號1121E0324）、PBS 緩沖液（批號P1020）購自北京索萊寶科技有限公司；RAW264.7 細胞專用培養基（批號WHAA23E072）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.4 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BS110S 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；SB-5200DTD 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AP-01P 型真空泵（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；800Y 型高速多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；OHG-9070B 型智能電熱恒溫鼓風干燥箱（上海瑯實設備有限公司）；Benchmark plus 型酶標儀（上海新振儀器設備有限公司）；CKX41+DP21 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；CPY-180 型CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；IC1000 型Countstar 自動細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱定綠原酸、甘草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、異甘草苷、牛蒡子苷、甘草素、甘草酸、異甘草素、牛蒡苷元、甘草查耳酮A、甘草次酸對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為40、48、36、48、44、40、44、48、44、40、40、44、40 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱定炒牛蒡子、甘草飲片粉末（過3 號篩）各2 g，于具塞錐形瓶中，移液管量取80 mL 95%乙醇加入，稱定質量，45 ℃超聲提取30 min（40 kHz、250 W），補足減失的質量后抽濾，取續濾液5 mL，水浴揮干溶劑，經同體積甲醇復溶后即得供試品溶液；余量濾液揮干溶劑，干浸膏留存。

2.1.3 色譜條件[17]色譜柱為Agilent SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長254 nm；體積流量0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，20%乙腈；5～15 min，20%～25%乙腈；15～20 min，25%～27%乙腈；20～25 min，27%～29%乙腈；25～35 min，29%～31%乙腈；35～40 min，31%～33%乙腈；40～45 min，33%～50%乙腈；45～50 min，50%～52%乙腈；50～70 min，52%～54%乙腈；70～75 min，54%～55%乙腈；75～80 min，55%～57%乙腈；80～95 min，57%～80%乙腈；95～105 min，80%～90%乙腈；105～110 min，90%乙腈。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗 取“2.1.1”項下混合對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣測定6 次，以響應值較大且分離度較好的第7 個峰為參照峰，計算得13 種對照品相對峰面積的RSD 均小于3%，結果顯示所用儀器的精密度較好。

2.2.2 重復性試驗 取同一牛蒡子-甘草藥對（S1），按“2.1.2”項下方法制備6 個平行供試品溶液，依據“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，以響應值較大且分離度較好的第7 個峰為參照峰，計算得13 種成分相對峰面積的RSD 均小于3%，說明所選用的色譜方法具有較好的重復性。

2.2.3 穩定性試驗 取同一牛蒡子-甘草藥對（S1）供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.3”項下方法進樣測定，以響應值較大且分離度較好的第7 個峰為參照峰，計算得13 種成分相對峰面積的RSD 均小于3%，表明所制備的供試品溶液在24 h內質量穩定。

2.3 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.3.1 指紋圖譜的生成 取18 批牛蒡子-甘草藥對樣品（S1～S18），按“2.1.2”項下方法依次制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定。測定結果導出為TXT 格式，依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 年版）軟件，得到18批樣品（S1～S18）的疊加圖譜。采用中位數法，時間寬度為0.2 min，以S1 作為參照圖譜，經多點校正后采用mark 峰匹配，共確定38 個共有峰，生成對照圖譜，見圖1。

圖1 18 批牛蒡子-甘草藥對樣品 (S1～S18) 的指紋圖譜疊加圖及其對照指紋圖譜 (R)Fig. 1 Fingerprint overlay of 18 batches of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair samples (S1—S18) and their control fingerprints (R)

2.3.2 相似度評價 選擇分離度好、含量較高的38個色譜峰作為牛蒡子-甘草藥對的指紋圖譜共有特征峰，以對照指紋圖譜為參照，對18 批牛蒡子-甘草藥對指紋圖譜的相似度評價見表2，從表中可以看出，牛蒡子-甘草藥對的指紋圖譜相似度均＞0.7，表明所建立的指紋圖譜方法可用于牛蒡子-甘草藥對的整體質量控制。

表2 18 批牛蒡子-甘草藥對共有模式相似度Table 2 Similarity of common pattern between 18 batches of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair

2.4 共有峰的指認與分析

2.4.1 共有峰的指認 取“2.1.1”項下的混合對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，得混合對照品溶液色譜圖（圖2）。通過與供試品溶液出峰的保留時間比對，可指認牛蒡子-甘草藥對共有峰F2、F5～F8、F11、F13、F15、F17、F20、F21、F26、F35 分別為綠原酸、甘草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、異甘草苷、牛蒡子苷、甘草素、甘草酸、異甘草素、牛蒡苷元、甘草查耳酮A、甘草次酸。

圖2 混合對照品色譜圖Fig. 2 Chromatogram of mixed control

2.4.2 聚類分析 聚類分析能夠從整體角度分析并比較不同樣品間的相似性，排除相關性較差變量的影響[18]。對18 批牛蒡子-甘草藥對的數據采用聚類分析法[19]進行分析以探索其差異性。使用SPSS 26.0軟件，以18 批牛蒡子-甘草藥對指紋圖譜的38 個共有峰的峰面積作為變量，選擇平方歐式距離為測度，采用組間均聯法進行系統聚類，對其進行聚類分析。結果顯示，當平方歐式距離為10 時，18 批樣品可以被分為3 類，S7、S18、S1、S14、S11、S2、S6、S8 為第1 類，S10、S17、S12、S16、S13、S15、S5、S9、S3 為第2 類，S4 為第3 類，聚類分析樹狀圖見圖3。

圖3 聚類分析樹狀圖Fig. 3 Cluster analysis tree diagram

2.4.3 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA 能將多個指標轉化為少數幾個主成分，這些主成分是原始變量的線性組合，且彼此之間互不相關，可以直觀顯示出不同樣品之間的整體差異性，進一步尋找不同批牛蒡子-甘草藥對質量的差異性變量[20]。將18 批牛蒡子-甘草藥對指紋圖譜的38個共有峰的峰面積作為變量，結合SIMCA 14.1與SPSS 26.0 軟件對其進行PCA，以特征值＞1，自動得到5 個主成分，累積方差貢獻率為92.272%，相關信息見表3，結合總方差解釋結果，觀察碎石圖（圖4），當折線由陡峭突然變得平穩時，陡峭到平穩對應的因子個數即為參考提取因子個數。結果表明，5 個主成分能夠充分體現38 個共有峰的基本特征值和主要信息，可以作為牛蒡子-甘草藥對質量的差異性變量反映其整體質量，具有進一步研究的意義。

圖4 公因子碎石圖Fig. 4 Common factor lithotripsy diagram

表3 主成分特征值和方差貢獻率Table 3 Eigenvalues and variance contribution rates of principal component

主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小和作用方向[21]。依據表4 可以看出38 個共有峰中F2～F4、F7、F22～F25、F27～F30、F32～F34、F36、F37 位于第1 個主成分上有較高的載荷，F3、F4、F7～F10、F12、F13、F14、F16、F17～F19、F33 位于第2 個主成分上有較高的載荷，F12、F14、F19、F21、F22、F26、F31、F38 位于第3 個主成分上有較高的載荷，F1、F6、F8、F15、F20、F35 位于第4 主成分上有較高的載荷，F5、F11、F22 位于第5 主成分上有較高的載荷，主成分含義較清晰，說明影響樣品質量差異的并不是單一成分，而是由多個成分聚集產生作用，對應中藥治療疾病多成分、多靶點的特點。選擇6 個主成分進行PCA，繪制主成分得分圖，結果見圖5，樣品總體可聚為2 類（S4與S13 為離群樣品），與聚類分析結果基本一致，樣品間產生差異可能與采收季節、產地加工和炮制等相關。進一步根據各主成分值及貢獻率分別計算綜合得分，評價18 批牛蒡子-甘草藥對樣品的質量，結果見表5，綜合得分的排名反映出18 批牛蒡子-甘草藥材的質量差異，排名越高質量越好。

圖5 主成分得分圖Fig. 5 Principal component score chart

表4 主成分矩陣Table 4 Principal component matrix

2.5 18 批牛蒡子-甘草對脂多糖所致RAW264.7 細胞炎癥模型的影響

2.5.1 細胞培養 RAW264.7 細胞采用專用培養基，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

2.5.2 樣品制備 取“2.1.2”項下留存干浸膏（樣品S1），加入專用培養基配制成2 mg/mL（含0.1%DMSO）的樣品母液，過0.22 μm 微孔濾膜，備用。

2.5.3 牛蒡子-甘草對RAW264.7 細胞活性的影響取處于對數生長期的RAW264.7 細胞，調整細胞密度為1.5×105～2.0×105個/mL，每孔200 μL 接種于96 孔板中（空白組為200 μL 完全培養基），37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，棄去孔中原培養液，空白組與正常組加入200 μL 完全培養基，給藥組分別加入含2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL 牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物的完全培養基，每組5 個復孔，培養24 h 后，各孔加5 mg/mL MTT 溶液20 μL，置于CO2培養箱中繼續培養4 h，棄去各孔上清液，加入150 μL DMSO，振蕩混勻15～20 min，待各孔中紫色結晶完全溶解，于570 nm 處測定吸光度（A）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(A給藥－A空白)/(A正常－A空白)

采用GraphPad Prism 9 軟件進行統計學分析，結果見表6。當牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物質量濃度高于1.0 mg/mL 時，細胞存活率低于90%；當牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物質量濃度為0.2～0.8 mg/mL 時，細胞存活率大于90%且隨質量濃度變化趨勢小，可以為后續實驗提供依據。

表6 牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物對RAW264.7 細胞活力的影響 (±s, n = 5)Table 6 Effect of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on 95% alcohol total extract on RAW264.7 cell viability (±s, n = 5)

表6 牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物對RAW264.7 細胞活力的影響 (±s, n = 5)Table 6 Effect of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on 95% alcohol total extract on RAW264.7 cell viability (±s, n = 5)

與空白組比較：##P＜0.01；與對照組比較：**P＜0.01。##P ＜ 0.01 vs blank group; **P ＜ 0.01 vs control group.

組別 質量濃度/(mg·mL-1) 細胞存活率/%空白 — 0.00±0.75正常 — 100.00±3.78##牛蒡子-甘草藥對 0.2 119.74±1.40**95%乙醇總提物 0.4 119.84±2.96**0.6 117.00±2.65**0.8 117.35±3.25**1.0 103.88±4.65 1.2 35.26±3.53**1.4 12.88±0.65**1.6 12.84±1.07**1.8 12.17±1.29**2.0 112.50±1.38**

2.5.4 不同質量濃度牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物對脂多糖誘導的RAW264.7 細胞分泌NO 的影響 取處于對數生長期的RAW264.7 細胞，調整細胞密度為1.5×105～2.0×105個/mL，每孔200 μL接種于96 孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，棄去孔中原培養液，正常組加入200 μL 專用培養基，模型組加入200 μL 含脂多糖（1 μg/mL）專用培養基，給藥組分別加入200 μL 0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL 牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物含脂多糖（1 μg/mL）專用培養基，每組設置3 個復孔，5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h，按相關試劑盒說明書操作，檢測細胞分泌NO 水平。采用GraphPad Prism 9 軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。

由表7 可知，與正常組比較，模型組NO 含量明顯上升（P＜0.01）；與模型組比較，牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物干預后在質量濃度0.2～0.8 mg/mL 內NO 含量降低（P＜0.01），并呈劑量相關性。為盡可能準確篩選牛蒡子-甘草藥對抗炎活性有效成分群，設定給藥質量濃度為0.8 mg/mL 進行后續18 批牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物抗炎譜效相關性研究。

表7 牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物對脂多糖誘導的RAW264.7 細胞分泌NO 的影響 (±s, n = 3)Table 7 Effect of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on secretion of NO from lipopolysaccharide-induced RAW264. 7 cells (±s, n = 3)

表7 牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物對脂多糖誘導的RAW264.7 細胞分泌NO 的影響 (±s, n = 3)Table 7 Effect of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on secretion of NO from lipopolysaccharide-induced RAW264. 7 cells (±s, n = 3)

與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01，表8 同。##P ＜ 0.01 vs normal group; **P ＜ 0.01 vs model group, same as Table 8.

組別 質量濃度/(mg·mL-1) NO/(μmol·L-1)正常 — 5.17±0.13模型 — 11.53±0.27##牛蒡子-甘草藥對 0.1 11.13±0.23 95%乙醇總提物 0.2 10.11±0.28**0.3 9.20±0.13**0.4 8.34±0.14**0.5 7.93±0.16**0.6 7.72±0.15**0.7 7.46±0.13**0.8 7.38±0.07**

2.5.5 體外抗炎實驗 按“2.5.2”項下方法制備樣品溶液，得到18 批牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物，按照相關試劑盒說明書操作，檢測細胞NO 水平。結果見表8，與正常組比較，模型組NO 分泌量升高（P＜0.01）；與模型組比較，18 批樣品均能不同程度降低RAW264.7 炎性細胞的NO 分泌量。

表8 18 批牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物對NO 分泌量的影響 (±s, n = 3)Table 8 Effect of 18 batches of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on 95% total alcohol extract on NO secretion (±s, n = 3)

表8 18 批牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物對NO 分泌量的影響 (±s, n = 3)Table 8 Effect of 18 batches of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on 95% total alcohol extract on NO secretion (±s, n = 3)

編號 NO/(μmol·L-1) 編號 NO/(μmol·L-1)正常 5.82±0.09 S9 6.22±0.08**模型 9.54±0.07## S10 6.75±0.06**S1 6.71±0.04** S11 6.33±0.07**S2 5.64±0.03** S12 7.98±0.21**S3 6.98±0.22** S13 5.82±0.04**S4 6.97±0.14** S14 6.66±0.11**S5 6.63±0.09** S15 7.00±0.04**S6 6.47±0.04** S16 6.17±0.07**S7 6.06±0.16** S17 5.62±0.07**S8 6.15±0.12** S18 5.71±0.02**

2.6 灰色關聯度分析（gray correlation analysis，GCA）

GCA 能夠表征各因素間的關聯程度，通過計算關聯度，然后根據關聯的大小進行排序、分析，關聯度值越大，說明關系越密切，對藥效的“貢獻”越大。主要包括定義參考序列和比較序列、處理參考數列和比較數列數據、計算參考數列和比較數列的絕對差值、計算灰色關聯系數和灰色關聯度[22]。

2.6.1 原始數據的無量綱化處理 為消除因變量與各變量之間單位不同的影響，用均值化法對原始數據進行無量綱化處理[23]。將牛蒡子-甘草藥對抗炎作用的藥效指標作為母序列，牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物的共有峰峰面積作為子序列，變換的母序列記為Y(k)（k為18 批樣品編號）、子序列記為Xf(k)（f為峰號）。

2.6.2 序列和子序列絕對差序列及關聯度的計算根據公式計算母序列與子序列的絕對差序列[Δf(k)]和關聯度[Af(k)]。當關聯度大于0.8 時，表明子序列與母序列關聯密切，當關聯度0.6～0.8 時，表明兩者關聯度一般[24]。

ρ為分辨系數，取值為0.5

18 批樣品對RAW264.7 細胞NO 分泌量的影響與其指紋圖譜38 個共有峰的關聯度見表9，結果顯示，除F34、F36 外，其余色譜峰的灰色關聯度均大于0.8，進一步說明牛蒡子-甘草藥對抗炎活性是多種成分共同作用的結果。各共有峰所代表的化學成分對其抗炎活性的影響程度有所不同，與RAW264.7 細胞NO 分泌量有較大關聯性的色譜峰貢獻大小順序為F5（甘草苷）＞F17（甘草酸）＞F1＞F3＞F4＞F9＞F11（異甘草苷）＞F13（牛蒡子苷）＞F19＞F23＞F21（牛蒡苷元）＞F14。

表9 18 批牛蒡子-甘草藥對共有峰峰面積與抗炎藥效的關聯度Table 9 Correlation between peak areas of shared peaks and anti-inflammatory efficacy of 18 batches of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair

2.7 指紋圖譜與抗炎藥效的偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析

PLSR 分析是一種模型擬合度好和預測能力強的數據處理方法，集聚類分析、PCA、多元線性回歸（multiple linear regression，MLR）優勢為一體，且具有無須剔除樣本、預測精度高、計算量小，易于定性解釋等特點，已普遍應用于中藥譜效學[25]。利用SIMCA14.1 軟件，將18 批牛蒡子-甘草藥對38個共有峰的峰面積進行標準化處理，結果作為自變量（X），RAW264.7 細胞NO 分泌量作為因變量（Y），進行PLSR 分析，結果見圖6，結果表明所標示的共有峰中F1、F3、F5、F6、F9、F15、F17、F18、F20～F23、F25、F26、F28、F29、F33～F37 與RAW264.7 細胞NO 分泌量呈負相關，與牛蒡子-甘草藥對抗炎藥效呈正相關。

圖6 回歸系數圖Fig. 6 Regression coefficient graph

基于PLSR 分析變量的選擇方法進行變量重要性投影（variable importance projection，VIP）分析。VIP 值反映了自變量對因變量的解釋能力，值越大（VIP＞1），解釋能力越強[26]。18 批牛蒡子-甘草藥對指紋圖譜的38 個共有峰與RAW264.7 細胞NO分泌量的VIP 圖見圖7，由VIP 圖可知，牛蒡子-甘草藥對38 個共有峰中17 個特征峰（VIP＞1）與其抗炎作用顯著相關且F21（VIP＞1.5）貢獻較大，牛蒡苷元（F21）是引起18 批牛蒡子-甘草藥對抗炎藥效產生差異的最主要變量。

圖7 VIP 分析Fig. 7 VIP analysis

3 討論

中藥復方應在傳統配伍理論和臨床應用基礎上開展繼承創新的現代開發研究，闡釋藥效物質基礎和作用機制是推動中藥復方現代化創新開發研究的科學需求。藥對是中藥配伍組方的基本單位之一，在中醫臨證方劑配伍中起到相輔相成的作用[1]。

本研究以色譜峰信息量最大化、方法穩定為宗旨優化了提取條件；對流動相配比、柱溫、體積流量和波長等進行篩選，以色譜峰分離度和峰面積為考察目標確定了最佳色譜條件，且依據課題組前期文獻信息挖掘及“生信分析-網絡藥理學-分子對接”的相關研究確定牛蒡子和甘草藥材具有抗炎活性研究基礎的有效成分作為對照品。牛蒡子-甘草藥對指紋圖譜共標定38 個共有峰，經混合對照品溶液指認出13 個共有峰，18 批樣品相似度均＞0.7，表明所建立的指紋圖譜方法可用于藥對的整體質量評價。聚類分析結果顯示，當平方歐式距離為10 時，18 批樣品被分為3 類；PCA 得到5 個主成分，累計方差貢獻率為92.272%，能夠充分體現牛蒡子-甘草藥對活性成分的基本信息，選擇6 個主成分繪制主成分得分圖，樣品總體可聚為2 類（S4 與S13 為離群樣品），與聚類分析結果基本一致，樣品間產生差異可能與采收季節、產地加工和炮制等相關。進一步根據各主成分值及貢獻率分別計算18 批樣品綜合得分，來評價收集到的18 批牛蒡子-甘草藥對質量，綜合得分的排名越高說明藥材的質量越好，結果顯示樣品S7 質量最佳。

本研究以脂多糖刺激RAW264.7 細胞制備炎性細胞模型[27]，以NO 分泌量作為藥效學指標考察18批牛蒡子-甘草藥對的抗炎活性。首先以細胞存活率為判定指標對給藥安全劑量進行篩選，當牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物質量濃度為0.2～0.8 mg/mL時，細胞存活率均大于100%，進行3 次重復實驗后結果一致，說明牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物在0.2～0.8 mg/mL 能夠促進細胞活力，但隨質量濃度變化趨勢不明顯，考慮可能與藥物質量濃度設定梯度變化較小和細胞種板均勻度相關。在給藥安全劑量范圍內設定梯度質量濃度考察牛蒡子-甘草藥對95%乙醇總提物的抗炎活性，與模型組比較，給藥組NO 分泌量顯著降低，呈劑量相關性，體外抗炎實驗結果顯示，18 批樣品均能不同程度降低RAW264.7 炎性細胞的NO 分泌量。值得注意的是，實驗過程中空白組NO 分泌量較高，考慮RAW264.7細胞對于培養環境要求嚴格，尤其對于CO2的濃度具有較高的敏感性，在實驗期間不同實驗人員不定期開關培養箱使其培養環境無法長時間穩定，導致細胞活力有所降低，這可能是導致空白組NO 釋放量過高的重要原因。

本研究采用GCA 和PLSR 分析對牛蒡子-甘草藥對的抗炎活性進行譜效相關性分析，GCA 結果表明38 個共有峰中多個成分的關聯度均大于0.8，色譜峰貢獻大小順序為F5（甘草苷）＞F17（甘草酸）＞F1＞F3＞F4＞F9＞F11（異甘草苷）＞F13（牛蒡子苷）＞F19＞F23＞F21（牛蒡苷元）＞F14，說明牛蒡子-甘草藥對的抗炎活性是通過多成分協同作用產生的；其中甘草苷、甘草酸、異甘草苷、牛蒡子苷、牛蒡苷元已明確具有較好的抗炎作用，甘草總皂苷（甘草酸等）能夠通過抑制NO、TNF-α、IL-6的炎癥因子的分泌來達到抗炎作用，牛蒡苷元可以通過抑制Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導與轉錄激活子（signal transducer and activators of transcription，STAT）信號通路發揮抗炎作用[28-29]，牛蒡苷可通過抗炎、解熱等途徑減輕炎癥反應[30]。PLSR 分析結果顯示，牛蒡子-甘草藥對38 個共有峰中有17 個特征峰（VIP＞1）與其抗炎作用顯著相關，且牛蒡苷元（F21，VIP＞1.5）是引起18 批牛蒡子-甘草藥對抗炎藥效產生差異的主要變量。牛蒡子-甘草藥對臨床配伍應用中牛蒡子的炮制加工方法分別為炒制品和生品，相關研究表明，炒制條件的不同使得牛蒡子的抗炎藥效存在差異，高溫炒制使部分牛蒡子苷分解成其抗炎主要活性成分牛蒡苷元[31]。一定程度解釋了可能由于18 批樣品炒制程度不同，導致牛蒡苷元含量差異，使其成為影響牛蒡子-甘草藥對抗炎藥效產生差異的主要變量。

綜上，本研究建立了牛蒡子-甘草藥對HPLC 指紋圖譜的研究方法，通過GCA 與PLSR 分析探討了指紋圖譜共有峰與抗炎活性的譜效相關性，篩選出牛蒡子-甘草藥對抗炎作用的有效成分群，可為牛蒡子-甘草藥對的抗炎藥效物質基礎研究、質量評價及相關制劑開發提供研究基礎。此外，本研究發現，在未指認的化學成分中也有部分與該藥對抗炎藥效具有一定關聯性，后續將采用液質聯用技術進行進一步闡釋研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突