地榆皂苷I 調控IGFL2-AS1/miR-138-5p 抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移

許運巧，剛小清，李金鋒

1. 駐馬店市中心醫院 婦產科，河南 駐馬店 463000

2. 河南省人民醫院 婦產科，河南 鄭州 450000

卵巢癌是死亡率最高的婦科腫瘤，嚴重威脅女性健康。中藥在抗腫瘤治療中發揮重要的作用，能夠直接抑制腫瘤細胞生長，具有多靶點、綜合調節、不良反應少的優點，使用包括植物化學物質在內的天然產品是一種潛在且有用的癌癥治療方法[1-2]。地榆藥材為薔薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL.或長葉地榆S.officinalisL. var.longifolia(Bert.) Yu et Li 的干燥根，是一種常見的草本植物，廣泛分布于我國和其他亞洲國家，具有多種藥用價值，地榆中含有多種皂苷類化合物，主要包括地榆皂苷I、II，其中以地榆皂苷I 含量最高，具有較強的抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性，應用前景廣闊[3]。研究報道，地榆皂苷II 可誘導人結腸癌細胞凋亡[4]；地榆皂苷II 可抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲[5]；地榆皂苷I 可通過激活線粒體通路抑制人甲狀腺乳頭狀癌細胞生長[6]，但其對卵巢癌細胞腫瘤特性的影響尚不清楚。

miR-138-5p在卵巢癌組織和細胞中下調表達，miR-138-5p上調可抑制卵巢癌進展，且其受lncRNATRPM2-AS調控[7]。IGFL2-AS1表達下調限制胃癌細胞增殖及轉移[8]。生物學軟件預測發現miR-138-5p與IGFL2-AS1有結合位點。而IGFL2-AS1對卵巢癌細胞增殖、侵襲遷移的影響及其與miR-138-5p的關系也尚未可知。本研究旨在探討地榆皂苷I 對卵巢癌細胞增殖、侵襲遷移的影響是否涉及IGFL2-AS1和miR-138-5p。

1 材料

1.1 細胞

人卵巢癌A2780細胞購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

地榆皂苷I（質量分數≥98%，批號35286-58-9）購自四川精萃天成藥物科技有限公司；RPMI 1640 培養基（批號R101）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin，批號147301）一抗、N-鈣黏蛋白（N-cadherin，批號350802）一抗、磷酸緩沖鹽溶液（批號CC0005）購自上海雅吉生物科技有限公司；MTT 試劑盒（批號OX01472）、pcDNA3.1（＋）載體（批號MZ0157）購自上海圻明生物科技有限公司；帶有基質膠的Transwell 小室（批號3407）購自美國Corning 公司；胎牛血清（批號AB20180244D）購自上海諾娃醫藥科技有限公司；胰蛋白酶（批號T8150）、二抗（批號SE131、SE134）、qRT-PCR 試劑（批號SR1111）雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號D0011）、RIPA 裂解液（批號R0010）、Trizol 試劑（批號15596018）吉姆薩（批號51811-82-6）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器

CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；TG16 型離心機（上海盧湘儀實驗室儀器有限公司）；Synergy H1 型酶標儀（美國伯騰公司）；XCell4 SureLock 型電泳儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；IQ5 型qRT-PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 MTT 檢測細胞增殖

A2780 細胞用RPMI 1640 培養，收集處于對數生長期的細胞并調整密度，以3×103個/孔接種于96 孔板，分別加入不同濃度（7.5、15.0、30.0 μmol/L）的地榆皂苷I，另設置不含藥物的對照組，培養至鋪滿孔底，每孔加入MTT 溶液20 μL，培養4 h，小心吸去培養液，加入二甲基亞砜，采用酶標儀測定吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率＝1－A實驗/A對照

2.2 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成

將處于對數生長期的A2780細胞重懸成細胞懸液，以500～700 個/孔接種于6 孔板，分別加入不同濃度（7.5、15.0、30.0 μmol/L）的地榆皂苷I，另設置不含藥物的對照組，培養直至出現肉眼可見克隆，甲醇固定，吉姆薩染色，磷酸緩沖液洗滌細胞并晾干，計數＞50 個細胞的集落。

2.3 Transwell 實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

取對數生長期的A2780 細胞，用無血清培養液稀釋，調整細胞密度，接種至Transwell 小室上層，用鑷子將小室置于培養板內，分別加入不同濃度（7.5、15.0、30.0 μmol/L）的地榆皂苷I，另設置不含藥物的對照組，培養24 h，甲醇固定，結晶紫染色，用磷酸緩沖液除去沒有結合的結晶紫，并用棉簽輕輕擦掉上層細胞，顯微鏡下隨機觀察并記數遷移細胞數。用無血清培養基稀釋Matrigel 膠，并涂于上室的聚碳酸酯膜表面，其余步驟同遷移實驗，分析細胞侵襲能力。

2.4 Western blotting 檢測 E-cadherin 和 Ncadherin 蛋白表達

將處于對數生長期的A2780細胞重懸成細胞懸液，以2×105個/孔接種于6 孔板，分別加入不同濃度（7.5、15.0、30.0 μmol/L）的地榆皂苷I，另設置不含藥物的對照組，培養24 h。用細胞刮刮下各組細胞，加入RIPA 裂解液提取蛋白，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于封閉液中緩慢搖蕩1 h，分別加入E-cadherin、N-cadherin 一抗后孵育過夜；加入二抗室溫孵育，滴加化學發光液顯影。

2.5 qRT-PCR 檢測IGFL2-AS1 和miR-138-5p 的表達

將處于對數生長期的A2780細胞重懸成細胞懸液，以2×105個/孔接種于6 孔板，分別加入不同濃度（7.5、15.0、30.0 μmol/L）的地榆皂苷I，另設置不含藥物的對照組，培養24 h。收集細胞，加入Trizol試劑提取RNA，測定RNA 濃度和純度后加入逆轉錄酶合成cDNA，進行qRT-PCR 分析，用2-ΔΔCt法計算相對表達量。以GAPDH和U6為內參，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.6 細胞轉染

將IGFL2-AS1 干擾表達載體及陰性對照轉染至A2780 細胞，記為si-NC 組、si-IGFL2-AS1 組；將IGFL2-AS1過表達載體及陰性對照轉染至A2780細胞，然后用30 μmol/L 的地榆皂苷I 處理，記為地榆皂苷I＋pcDNA-IGFL2-AS1 組、地榆皂苷I＋pcDNA 組。分別檢測細胞活性、增殖、遷移、侵襲、IGFL2-AS1、miR-138-5pmRNA 表達和E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達。

2.7 雙熒光素酶報告實驗

設置miR-138-5p 與MUT-IGFL2-AS1 組、miR-138-5p 與WT-IGFL2-AS1 組、miR-NC 與MUTIGFL2-AS1 組以及miR-NC 與WT-IGFL2-AS1 組。用轉染試劑依據分組情況將載體轉染A2780 細胞中，按照說明書分析熒光素酶活性。

2.8 統計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，本研究相關數據均為計量資料，且符合正態分布，用±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 地榆皂苷I 對A2780 細胞增殖、遷移、侵襲和E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響

如圖1 和表2 所示，不同濃度的榆皂苷I 處理A2780 細胞后，細胞增殖抑制率和E-cadherin 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），克隆形成數、遷移細胞數、侵襲細胞數和N-cadherin 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），呈劑量相關性。

圖1 地榆皂苷I 對A2780 細胞克隆形成、遷移和侵襲以及E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響Fig. 1 Effect of ziyuglycoside I on colony formation, migration, invasion and E-cadherin, N-cadherin protein expressions in A2780 cells

表2 地榆皂苷I 抑制A2780 細胞增殖、遷移和侵襲 (±s, n = 9)Table 2 Inhibit of proliferation, migration and invasion of A2780 cells by ziyuglycoside I (±s, n = 9)

表2 地榆皂苷I 抑制A2780 細胞增殖、遷移和侵襲 (±s, n = 9)Table 2 Inhibit of proliferation, migration and invasion of A2780 cells by ziyuglycoside I (±s, n = 9)

與對照組比較：*P＜0.05；與地榆皂苷I（7.5 μmol·L-1）組比較：#P＜0.05；與地榆皂苷I（15.0 μmol·L-1）組比較：&P＜0.05，表3 同。*P ＜ 0.05 vs control group; #P ＜ 0.05 vs ziyuglycoside I (7.5 μmol·L-1) group; &P ＜ 0.05 vs ziyuglycoside I (15.0 μmol·L-1) group, same as table 3.

組別 劑量/(μmol·L-1) 抑制率/% 克隆形成數/個 細胞數/個 蛋白相對表達量遷移 侵襲 E-cadherin N-cadherin對照 — 0.00±0.00 115.22±5.61 168.44±8.00 135.33±6.09 0.15±0.01 0.65±0.05地榆皂苷I 7.5 18.31±1.12* 92.56±4.14* 136.56±4.25* 103.89±5.66* 0.29±0.04* 0.50±0.04*15.0 31.92±1.66*# 71.00±4.42*# 92.22±4.68*# 81.89±4.28*# 0.48±0.04*# 0.34±0.03*#30.0 55.81±1.99*#& 52.33±2.31*#& 68.22±3.97*#& 57.67±3.92*#& 0.71±0.06*#& 0.15±0.01*#&

3.2 地榆皂苷I 對A2780 細胞IGFL2-AS1 和miR-138-5p mRNA 表達的影響

如表3 所示，與對照組比較，地榆皂苷I 顯著抑制A2780 細胞IGFL2-AS1mRNA 表達（P＜0.05），促進miR-138-5pmRNA 表達（P＜0.05），呈劑量相關性。

表3 地榆皂苷I 對A2780 細胞IGFL2-AS1 和miR-138-5p mRNA 表達的影響 (±s, n = 9)Table 3 Effect of ziyuglycoside I on IGFL2-AS1 and miR-138-5p mRNA expressions in A2780 cells (±s, n = 9)

表3 地榆皂苷I 對A2780 細胞IGFL2-AS1 和miR-138-5p mRNA 表達的影響 (±s, n = 9)Table 3 Effect of ziyuglycoside I on IGFL2-AS1 and miR-138-5p mRNA expressions in A2780 cells (±s, n = 9)

組別 劑量/(μmol·L-1) mRNA 相對表達量IGFL2-AS1 miR-138-5p對照 — 1.00±0.00 1.00±0.00地榆皂苷I 7.5 0.75±0.04* 1.59±0.09*15.0 0.51±0.05*# 2.16±0.13*#30.0 0.25±0.03*#& 3.01±0.16*#&

3.3 IGFL2-AS1 轉染效率的檢測

如表4 所示，與si-NC 組比較，si-IGFL2-AS1組IGFL2-AS1mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與pcDNA 組比較，pcDNA-IGFL2-AS1 組IGFL2-AS1mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05）。

表4 各組IGFL2-AS1 mRNA 表達 (±s, n = 9)Table 4 IGFL2-AS1 mRNA expression in each group(±s, n = 9)

表4 各組IGFL2-AS1 mRNA 表達 (±s, n = 9)Table 4 IGFL2-AS1 mRNA expression in each group(±s, n = 9)

與si-NC 組比較：*P＜0.05；與pcDNA 組比較：#P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs si-NC group; #P ＜ 0.05 vs pcDNA group.

組別 IGFL2-AS1 mRNA 相對表達量si-NC 1.00±0.00 si-IGFL2-AS1 0.34±0.03*pcDNA 1.00±0.00 pcDNA-IGFL2-AS1 3.21±0.06#

3.4 下調IGFL2-AS1 對A2780 細胞增殖、遷移和侵襲的影響

如圖2 和表5 所示，IGFL2-AS1表達下調顯著增加miR-138-5p表達、增殖抑制率以及E-cadherin蛋白表達（P＜0.05），但減少克隆形成數、遷移細胞數、侵襲細胞數和N-cadherin 蛋白表達（P＜0.05）。

圖2 下調IGFL2-AS1 對A2780 細胞克隆形成、遷移和侵襲以及E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響Fig. 2 Effect of down-regulation of IGFL2-AS1 on colony formation, migration, invasion and E-cadherin, N-cadherin protein expressions in A2780 cells

表5 下調IGFL2-AS1 抑制A2780 細胞增殖、遷移和侵襲 (±s, n = 9)Table 5 Down-regulation of IGFL2-AS1 inhibits proliferation, migration and invasion of A2780 cells (±s, n = 9)

表5 下調IGFL2-AS1 抑制A2780 細胞增殖、遷移和侵襲 (±s, n = 9)Table 5 Down-regulation of IGFL2-AS1 inhibits proliferation, migration and invasion of A2780 cells (±s, n = 9)

與si-NC 組比較：*P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs si-NC group.

組別 miR-138-5p mRNA相對表達量 抑制率/% 克隆形成數/個 細胞數/個 蛋白相對表達量遷移 侵襲 E-cadherin N-cadherin si-NC 1.00±0.00 0.00±0.00 114.33±6.31 165.67±4.85 136.44±7.79 0.16±0.01 0.66±0.05 si-IGFL2-AS1 2.62±0.09* 46.51±2.59* 61.44±2.71* 78.67±4.71* 67.22±2.97* 0.59±0.05* 0.24±0.02*

3.5 IGFL2-AS1 和miR-138-5p 的靶向關系

Starbase 在線軟件預測顯示IGFL2-AS1和miR-138-5p有互補序列（圖3）。如表6 所示，miR-138-5p與WT-IGFL2-AS1 共轉染后細胞熒光素酶活性降低，而miR-138-5p 與MUT-IGFL2-AS1 共轉染后細胞熒光素酶活性無顯著變化。

表6 熒光素酶活性分析 (±s, n = 9)Table 6 Analysis of luciferase activity (±s, n = 9)

表6 熒光素酶活性分析 (±s, n = 9)Table 6 Analysis of luciferase activity (±s, n = 9)

與miR-NC 組比較：*P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs miR-NC group.

組別 熒光素酶活性WT-IGFL2-AS1 MUT-IGFL2-AS1 miR-NC 0.95±0.06 1.00±0.09 miR-138-5p 0.38±0.04* 1.02±0.12

3.6 過表達IGFL2-AS1對地榆皂苷I處理的A2780細胞增殖、遷移和侵襲的影響

如圖4 和表7 所示，與地榆皂苷I＋pcDNA 組比較，地榆皂苷I＋pcDNA-IGFL2-AS1 組miR-138-5pmRNA 表達、增殖抑制率和E-cadherin 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），克隆形成數、遷移細胞數、侵襲細胞數和N-cadherin 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。

圖4 過表達IGFL2-AS1 對地榆皂苷I 處理的A2780 細胞克隆形成、遷移和侵襲以及E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of overexpression of IGFL2-AS1 on colony formation, migration, invasion and E-cadherin, N-cadherin protein expressions in A2780 cells treated with ziyuglycoside I

表7 過表達IGFL2-AS1 對地榆皂苷I 處理的A2780 增殖、遷移和侵襲的作用 (±s, n = 9)Table 7 Effect of overexpression of IGFL2-AS1 on proliferation, migration and invasion of A2780 cells treated with ziyuglycoside I (±s, n = 9)

表7 過表達IGFL2-AS1 對地榆皂苷I 處理的A2780 增殖、遷移和侵襲的作用 (±s, n = 9)Table 7 Effect of overexpression of IGFL2-AS1 on proliferation, migration and invasion of A2780 cells treated with ziyuglycoside I (±s, n = 9)

與地榆皂苷I＋pcDNA 組比較：*P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs ziyuglycoside I + pcDNA group.

組別 劑量/(μmol·L-1)miR-138-5p mRNA相對表達量 抑制率/% 克隆形成數/個細胞數/個 蛋白相對表達量遷移 侵襲 E-cadherin N-cadherin地榆皂苷I＋pcDNA 30 1.00±0.00 55.99±2.20 52.22±3.52 70.22±4.13 58.33±3.92 0.69±0.04 0.15±0.02地榆皂苷I＋pcDNAIGFL2-AS1 30 0.37±0.04* 21.21±1.67* 85.22±4.41* 121.22±5.09* 90.33±5.23* 0.35±0.03* 0.43±0.03*

4 討論

中藥抗腫瘤有其獨特的優勢，能改善患者生活質量，延長生存期，或能夠為卵巢癌的維持治療提供新的思路[9-10]。因此，開發可用于防治卵巢癌的中藥及有效成分有助于卵巢癌的治療。研究報道，地榆皂苷II 可抑制肝癌細胞的增殖和轉移[11]；地榆皂苷II 可抑制人舌鱗癌CAL27 細胞的增殖[12]；地榆皂苷I 通過誘導p53 介導的G2/M 細胞周期阻滯和細胞凋亡，抑制乳腺癌MDA-MB-231 細胞的增殖[13]；地榆皂苷I 可以抑制細胞活力并誘導視網膜母細胞瘤WERI-Rb-1 細胞的凋亡[14]。本研究結果顯示，地榆皂苷I 處理A2780 細胞后，細胞增殖、遷移和侵襲能力減弱，E-cadherin 和miR-138-5p表達上調，N-cadherin 和IGFL2-AS1表達下調，呈劑量相關性；表明地榆皂苷I 抑制A2780 細胞增殖、遷移和侵襲。然而，尚未知地榆皂苷I 在卵巢癌的分子機制。

lncRNAIGFL2-AS1可以通過競爭性結合miRNA 來解除靶下游靶點的表達抑制，進而調控人類腫瘤的進展。研究報道，IGFL2-AS1在結直腸癌細胞和組織中顯著上調，敲低IGFL2-AS1抑制了舌鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移、侵襲通過靶向調控miR-433-3p的表達[15]。同時，過表達的IGFL2-AS1可以促進胃癌細胞的生長和轉移通過競爭性結合miR-802調控環磷酸腺苷調節的磷酸蛋白19（cyclic adenosine monophosphate-regulated phosphoprotein 19，ARPP19）[8]。本研究結果表明IGFL2-AS1沉默可抑制A2780 細胞增殖、遷移和侵襲。此外，通過Starbase 預測網站發現，miR-138-5p在IGFL2-AS1上存在結合位點，隨后，本研究證實miR-138-5p是IGFL2-AS1的靶基因。此外，一些研究表明miR-138-5p在人類多種癌癥中發揮抑癌作用。過表達miR-138-5p可通過靶向細胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）使抗性上皮性卵巢癌細胞對紫杉醇敏感[16]。同時，研究報道敲除lncRNA HOTAIR 可以通過抑制miR-138-5p調控的zeste 增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）和沉默信息調節因子1（silent information regulator factor 1，SIRT1）逆轉卵巢癌細胞的順鉑耐藥[17]。本研究發現IGFL2-AS1靶向調控miR-138-5p。提示IGFL2-AS1可能通過調控miR-138-5p影響卵巢癌進展。

本研究用不同濃度的地榆皂苷I 處理A2780 細胞后，IGFL2-AS1表達水平降低，miR-138-5p表達水平逐漸升高，表明地榆皂苷I 可調控IGFL2-AS1和miR-138-5p的表達。且本研究還發現過表達IGFL2-AS1可減弱地榆皂苷I 對A2780 細胞增殖、遷移和侵襲的作用。綜上，地榆皂苷I 可通過抑制IGFL2-AS1的表達來促進miR-138-5p產生，進而抑制卵巢癌細胞腫瘤特性。提示IGFL2-AS1可能是卵巢癌的潛在治療靶點。但本研究僅限于體外實驗，其在體內的作用還有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突