枸杞葉綠體基因組密碼子偏好性分析

杜 雨，李效雄，賈西貝，胡曉桐，劉 筠，馬彥軍*

1. 甘肅農業大學，甘肅 蘭州 730070

2. 蘭州資源環境職業技術大學，甘肅 蘭州 730030

葉綠體是一種存在于高等植物和藻類中含有光合色素的質體，同時葉綠體基因組也為植物系統發育研究提供了重要作用[1-2]。與核基因組相比，葉綠體基因組具有序列高度保守和進化速率適中等優勢，可用于研究物種的起源和進化等方向[3-7]。目前，因為高通量測序具有比較高的準確性，因此可以較為準確的研究生物體的系統發育和進化等[8-10]。通常來說，發育關系越密切的物種，其密碼子使用模式越相近[11]。如白羊草BothriochloaischaemumL.[12]、刺柏屬JuniperusL.[13]、煙草NicotianatabacumL.[14]及其近緣種利用葉綠體基因組同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）構建聚類分析圖，分析其與近緣種的系統發育關系。

mRNA 上相鄰的3 個堿基構成了密碼子，且密碼子是連接核酸與蛋白質的紐帶，在生物遺傳信息傳遞時具有重要作用[12]。密碼子的簡并性是指在編碼過程中一種氨基酸可以由2 個或2 個以上的密碼子編碼，而這些密碼子則被稱為同義密碼子。在自然界中存在的氨基酸有20 種，其中甲硫氨酸和色氨酸由一個密碼子編碼外，剩余氨基酸則由2～6 個同義密碼子編碼[15]。由于同義密碼子的使用頻率有所差異，形成了密碼子使用的偏好性（codon usage bias，CUB）。而密碼子使用的偏好性在不同物種或同一物種中也有所差異[16]，如杜仲Eucommia ulmoidesOliv.密碼子主要以G/C 結尾[17]，唐古特白刺NitrariatangutorumBobr.密碼子則主要使用A/U結尾[18]等。影響CUB 的因素主要有突變和自然選擇等。目前對密碼子偏好性的研究主要集中在分子進化、翻譯調控等方面[19-20]。研究表明，密碼子偏好性可以通過改變蛋白質結構、核苷酸序列等方式影響外源基因的表達[21-22]。因此，研究密碼子的偏好性不僅可幫助了解物種的分子進化、環境適應和基因組特征，還可以用來判斷未知基因的表達以及預測一些未知功能基因[23-24]。

枸杞屬LyciumL.植物為多年生灌木，隸屬于茄科（Solanaceae）。枸杞屬植物約有80 種，以離散型方式隨機分布在各地，其中南美洲和北美洲分布較廣。我國枸杞屬植物分為7 個種和3 個變種[25]。在野外調查時發現枸杞果實顏色較為豐富，主要有紅果、黃果、黑果和白果等。其中，中國枸杞具有長橢圓形或卵狀披針形的葉片，并且果實呈紅橘黃色，其直徑在5～10 mm，葉片單葉互生或2～4 枚簇生。中國枸杞的色素主要是類胡蘿卜素。黃果枸杞的葉片較為狹窄，呈條形或狹披針形，果實呈橙黃色，其直徑為4～8 mm，是寧夏枸杞的1 個變種，被稱為“黃金枸杞”，種植面積較小。白果枸杞的條形或條狀披針形的葉片在短枝上2～6 枚簇生，果實為球狀漿果，呈白色或表皮略帶紫色斑點，其直徑在4～9 mm。枸杞的花期均為5～10 月[26]。目前，在野外調查時發現存在中國枸杞、黑果枸杞、黃果枸杞和白果枸杞等，其中中國枸杞、黑果枸杞和黃果枸杞的分類學地位已經清晰，并且也應用于研究中，而對白果枸杞的分類地位尚不清楚。因此，本研究以中國枸杞、黃果枸杞和白果枸杞的葉綠體基因組為研究對象，分析枸杞的密碼子使用的特征及其影響因素，闡明枸杞葉綠體基因組密碼子使用模式，為枸杞屬植物的系統發育關系提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

進行枸杞種質資源調查時在青海采集中國枸杞、黃果枸杞和白果枸杞的植株并栽植到甘肅農業大學校內實習基地（地理坐標：38°28′N，106°16′E）。經甘肅農業大學馬彥軍教授鑒定為茄科中國枸杞LyciumchinenseMill.、黃果枸杞L.barbarumLinn.var.auranticarpumK. F. Ching.和白果枸杞L.ruthenicumMurray。

1.2 儀器

S220 型超聲波DNA 破碎儀（美國Covaris 公司），Thermo Qubit 4.0 熒光定量儀（Q33226），臺式高速低溫離心機（ Thermo Scientific Sorvall LegendMicro 21R），DE13805054 型Agilent 2100 Bioanalyzer（美國Agilent 公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

通過Illumina 高通量測序（上海生工生物公司測）獲得高質量數據（clean data），然后進行葉綠體全基因組序列拼接、組裝與注釋，最終匯總整理為完整的注釋結果。注釋完成后，提交到NCBI 數據庫（https://www. ncbi. nlm.nih. gov/genbank/）。其中國枸杞、黃果枸杞和白果枸杞的葉綠體基因組登錄號為OP866962、OP846044 和OP846050。中國枸杞、黃果枸杞和白果枸杞的葉綠體基因組大小分別為155 655、154 978、154 976 bp，其中中國枸杞和黃果枸杞含有83 個蛋白編碼基因（protein-coding genes，CDS），白果枸杞含有81 個蛋白編碼基因（protein-coding genes，CDS）。根據注釋信息剔除長度小于300 bp 和重復的蛋白質編碼序列，篩選起始密碼子為ATG，且終止密碼子為TAA、TGA 或TAG 的序列。

2.2 數據分析

2.2.1 密碼子組成分析 利用CodonW 1.4.2 軟件（http://codonw. sourceforge.net）對中國枸杞、黃果枸杞和白果枸杞的有效密碼子數（effective number of codons，ENC）、同義密碼子相對使用（relative synonymous codon usage，RSCU）以及密碼子GC 值進行分析，并利用SPSS24.0 和Chiplot（https://www.chiplot.online/#Bubble-plot）進行顯著性分析。其中GC值包括第1、2、3 位堿基以及三堿基中的平均含量。

2.2.2 ENC-plot 繪圖分析 ENC 值是了解密碼子偏好性的重要參數，可以判斷內源基因的表達量，ENC 越小，密碼子偏好性強，為高表達基因。使用Python 軟件繪制以ENC 值為縱坐標，GC3 含量（密碼子第3 位堿基的GC 含量）為橫坐標的曲線圖（終止密碼子、甲硫氨酸和色氨酸除外）。同時，根據ENC 的比值頻數可以糾正ENC-plot 分析可能存在的錯誤，按照以下公式計算ENC。

ENC＝2＋GC3＋29/[(GC3)2＋(1－GC3)2]

2.2.3 PR2-plot 和中性繪圖分析 以G3/(G3＋C3)為X 軸，A3/(A3＋T3)為Y 軸繪制PR2-plot 散點圖。其中PR2-plot 圖的中心點位置表明堿基含量為A＝T、G＝C，即密碼子不具有偏好性，其余點與中心點的矢量距離則代表其偏倚程度和方向。

以第1、2 位堿基上的GC 平均含量為縱坐標，GC3 為橫坐標繪制中性分析（neutrality plots）散點圖。通過直線擬合分析圖進行分析。利用二者的相關性，推斷影響密碼子偏好性的因素。當密碼子受突變影響時，直線斜率接近1，二者呈顯著相關；反之，則受自然選擇影響，無顯著相關，GC 含量高度保守。

2.2.4 最優密碼子的確定及聚類分析 利用ENC值和CodonW 軟件構建高、低表達基因庫和同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）值和ΔRSCU 值（ΔRSCU＝RSCU 高表達－RSCU 低表達）的計算。最優密碼子的確定則是需要同時滿足高表達密碼子和高頻密碼子的條件。

利用NCBI 數據庫下載茄屬秘魯茄Solanum peruvianumL.、智利番茄S.chilense(Dunal) Reiche.、多毛番茄S.habrochaitesS. Knapp & D. M. Spooner、契斯曼尼番茄S.cheesmanii、栽培番茄S.lycopersicumL.、黑果枸杞LyciumruthenicumMurray.的葉綠體基因組序列并計算密碼子的RSCU 值，通過聚類分析驗證3 種枸杞葉綠體基因組密碼子偏好性。

3 結果與分析

3.1 密碼子偏性分析

分析結果（表1）顯示，3 種枸杞植物的RSCU比較接近，其中有30 個密碼子的RSCU 值大于1，且以U、A 和G 結尾的密碼子分別有16、13 和1；而3 種植物RSCU 值小于1 的密碼子中只有3 個密碼子以A 結尾，表明3 種枸杞植物的密碼子中主要以A/U 結尾。中國枸杞（OP866962）、黃果枸杞（OP846044）和白果枸杞（OP846050）的密碼子GC含量、ENC 值分析結果顯示（表2、3）：在3 種枸杞植物的GC1 平均含量均為49.80%，GC2 平均含量為39.83%～39.85%，GC3 平均含量為25.68～25.77%，GC 總含量（GCall_s）平均值為38.44～38.47%，ENC 平均值為48.05～48.06，表明3 種枸杞植物的GC 值和ENC 無明顯差異。同時3 種枸杞植物密碼子的GC 含量均表現為GC1＞GC2＞GCall_s＞GC3，且GC1、GC2、GC3 平均含量都小于50%，表明3 種枸杞不同位置的密碼子GC 含量有所差異且更偏好使用以A/U 結尾的密碼子。

表1 枸杞葉綠體基因組中各氨基酸的RSCU 分析Table 1 RSCU analysis of amino acids in chloroplast genomes of L. chinense

表2 枸杞植物葉綠體基因組Table 2 Chloroplast genomes of L. Chinese plants

枸杞的相關分析表明GCall_s 和GC1、GC2、GC3具有極顯著（P＜0.01）相關性（0.361～0.848），與ENC不相關；GC3 與GC1、GC2 不具有相關性，表明密碼子的第3 為堿基組成與第1 位和第2 位有所差異，而GC3 與GCall_s（0.361～0.362）、ENC（0.431～0.438）有顯著（P＜0.05）相關性，表明枸杞密碼子的使用主要是受GC3 含量變化的影響（圖1）。

圖1 枸杞葉綠體基因組密碼子參數的相關性分析Fig. 1 Correlation analysis of codon parameters in chloroplast genomes of L. Chinese

3.2 ENC-plot 分析

根據ENC 值和GC3 的關聯分析以及標準曲線的距離來判斷對密碼子偏好性起主要作用的因素。當突變起主要作用時，數值主要分布于曲線附近，反之選擇壓力則起主導作用。根據ENCplot 分析圖（圖2），發現3 種枸杞植物的ENC值均大于30，且多數數值分布于曲線附近。結合ENC 比值頻數分布表（表3）顯示，3 種枸杞葉綠體基因組分別有20、21、21 個基因位于標準曲線附近，分別有31、30、30 個基因遠離標準曲線，表明影響大部分密碼子偏好性的要素是自然選擇。

圖2 ENC-plot 分析圖Fig. 2 Analysis of ENC-plot

3.3 PR2-plot 和中性繪圖分析

當影響密碼子偏好性的因素僅為突變時，因突變具有隨機性的特點會使第3 位堿基A/T（U）或C/G 具有相等的概率，而自然選擇則會使A/T（U）或G/C 使用不均等。由圖2 可知，4 個區域內的點分布不均勻：在垂直方向上多數基因在中線的下方；在水平方向上基因稍微偏向于中線右側，垂直方向分布差異較大。（圖3）。因此，枸杞植物的密碼子第3 位堿基C 頻率低于G，T（U）頻率大于A，表明了枸杞植物多數基因受到自然選擇的影響。

圖3 PR2-plot 分析Fig. 3 Analysis of PR2-plot

密碼子第3 位堿基的改變通常不會引起編碼氨基酸的改變，對密碼子偏好性的研究有重要意義。可根據枸杞植物的中性繪圖分析判斷影響密碼子偏好性的因素。當基因沿對角線分布且斜率接近1 時，堿基在3 個位置的差異不明顯，說明影響密碼子偏好性的主要因素是突變，反之則受自然選擇。如圖4 所示，回歸系數在-0.003 97～-0.001 74，兩者呈負相關關系。其中黃果枸杞的回歸系數為-0.003 97，受自然選擇影響最小；中國枸杞的回歸系數為-0.001 74，自然選擇的影響較大。中性繪圖分析表明影響枸杞密碼子偏好性的主要因素是自然選擇，與ENC-plot 的結果相同。

圖4 中性繪圖分析Fig. 4 Analysis of neutrality plot

3.4 最優密碼子的確定及聚類分析

同時滿足RSCU＞1 且ΔRSCU 值＞0.08 的密碼子即為枸杞的最優密碼子。結果顯示（表4）：枸杞葉綠體基因組中絕大多數密碼子以A 和U 結尾，且以U 結尾的密碼子較多。其中中國枸杞有17 個最優密碼子，黃果枸杞和白果枸杞具有18 個相同的最優密碼子。此外，3 種枸杞植物的共同最優密碼子有13 個，分別是UGU、UAA、UUG、CCU、CGA、AUU 等。

表4 枸杞植物葉綠體基因組密碼子RSCU 值Table 4 RSCU values of codons in chloroplast genomes of L. Chinese plants

對3 種枸杞植物葉綠體基因組密碼子RSCU進行聚類分析，使用SPSS 24.0 進行聚類分析（圖5）。在歐氏距離為5 時，9 個物種分為3 大類：黑果枸杞、黃果枸杞和白果枸杞聚為一類，栽培番茄單獨聚為一類，中國枸杞與其余近緣物種聚為一大類；在歐式距離為10 時，黑果枸杞、黃果枸杞和白果枸杞與栽培番茄聚為一類，中國枸杞與其余近緣物種聚為一大類；在歐式距離為25 時，所有茄科植物聚為一類。由此可知，中國枸杞未與白果枸杞、黃果枸杞聚為一類，這表明在密碼子的使用模式上它們存在一定的差異。同時從枸杞植物的RSCU 聚類結果來看白果枸杞與黃果枸杞的遺傳關系較近。

圖5 基于RSCU 值的樹狀聚類Fig. 5 Cluster tree based on RSCU values

4 討論

由于物種和基因的演化，造成了密碼子的使用偏性現象。并且密碼子使用偏性在不同物種或同一物種的不同基因中有明顯的差異[27]。目前由于物種基因組測序的廣泛使用，使人們對密碼子使用模式的研究產生了的興致[27]。本研究通過對3 種枸杞植物的密碼子使用偏性和影響因素進行分析，為枸杞種質資源的開發和遺傳育種提供參考。

在進化時遺傳關系較近的物種，它們的第3 位密碼子堿基組成比較相同。如大多數雙子葉植物的密碼子偏好使用以A/T（U）堿基結尾，單子葉植物則以G/C 堿基結尾[28]。通常密碼子第3 位堿基受到較小的選擇壓力，對氨基酸的對應關系影響較小，因此密碼子偏好性的研究對遺傳育種具有重要意義[29]。密碼子偏性和氨基酸的組成受GC 含量影響。目前研究發現，大部分植物的密碼子使用偏性會隨著物種的進化而降低，并且單細胞藻類的GC 含量最高，雙子葉植物的GC 含量最低[27]。3 種枸杞植物的密碼子 GC 平均含量為 38.44%～38.47%，且主要以A/T（U）堿基結尾，這與大部分被子植物的密碼子偏好性相同[9,29-30]。此外，本研究中3 種枸杞植物的密碼子偏好性均有較弱的表達（ENC 值＞48），推測與葉綠體基因的保守性有關。

遺傳密碼子變異的主要進化力量包括2 個因素，即堿基突變和自然選擇。在具有極高核苷酸含量的基因組中，影響同義密碼子使用模式的一個重要因素是突變[31]。通過對枸杞ENC-plot、中性繪圖和PR2-plot 分析發現，GC3 和GC1、GC2 表現為不顯著相關性，且GC3＜GC1、GC2，說明第3 位堿基與第1、2 位堿基存在差異性，且A/T（U）堿基有較高的使用頻率，與雙子葉植物的密碼子偏好使用結果一致[32-33]，這表明對枸杞密碼子偏性影響較小的是堿基突變，可能更多地取決于物種進化和人工選擇作用。

在高表達基因組中，最優密碼子的使用可以提高翻譯效率，而除最優密碼子外，低表達基因可以降低翻譯效率[34]。宿主細胞通過密碼子堿基的組成影響外源基因的表達，也可通過優化密碼子來提高基因表達的水平[8]。在不同植物中，最優密碼子的種類也存在巨大差異。在單子葉植物中，如水稻OryzasativaL.、玉米ZeamaysL.等通常以G/C 結尾，而擬南芥、煙草等主要以A/T 結尾，也有一些以G/C 結尾的植物，南方菟絲子的高表達基因主要以G/C 結尾[31]。在物種的進化過程中，遺傳密碼子的偏性逐漸減少，低等植物需要更多的密碼子優化，而高等植物的密碼子優化較少[30]，其主要原因是高等植物的基因表達受到順式作用元件等多種因素的調控[34]。枸杞的ENC 平均值為48.05～48.06，說明大多數基因在序列水平上表達潛力較低，但也有部分ENC 值高的基因有相對高的組織表達，表明高等植物的基因表達受多種因素調控，由此可知，僅通過ENC 值來預測基因表達水平是不準確的。從3 種枸杞密碼子中篩選出71 個最優密碼子，其中13 個為共有最優密碼子，大部分最優密碼子以A 或U 結尾，尤其以A 結尾，這與部分雙子葉植物一致，說明高等植物葉綠體基因組的進化相對保守。

研究表明，根據RSCU 值構建聚類分析圖可能與其系統發育樹不相同。前者只能在一定程度上支持系統分類，而不能真實反映物種的系統發育位置，這種現象一般是因為篩選的RSCU 值缺少CDS 序列的中低偏好密碼子信息造成的；而后者包含位點突變和基因組非編碼區序列等相關遺傳信息，使種間關系更真實可靠。由于葉綠體基因在進化時受到的外界影響較小，因此可用于研究物種進化的進程[8]。物種間的遺傳關系越近，密碼子的偏性越類似，歐式距離則越小[35]。聚類圖可以反映出某些物種的遺傳關系在一定程度上與其密碼子偏好性有關。聚類結果顯示，黃果枸杞和白果枸杞遺傳關系較近，單獨聚為一類，而中國枸杞則與近緣物種聚為一類，與木蘭科（Magnoliaceae）[36]、玉米[37]、番茄[38]等研究結果相似，進一步說明了3 種果色枸杞的遺傳關系，也為異源基因表達載體的設計和基因工程的應用和研究提供數據基礎。

綜上所述，3 種枸杞植物的葉綠體基因組的密碼子堿基組成位置特征顯示GC1＞GC2＞GCall_s＞GC3；3 種枸杞植物的葉綠體基因組密碼子的使用模式主要以A/T（U）堿基結尾；密碼子的使用偏好性ENC-plot、PR2-plot 和中性分析顯示枸杞植物的密碼子使用模式主要受自然選擇的影響；最優密碼子分析顯示枸杞材料共有密碼子有13 個；聚類分析表明3 種枸杞的密碼子使用存在一些差異，其中黃果枸杞和白果枸杞無明顯差異，說明其遺傳關系較近。3 種枸杞植物的葉綠體基因組特征為改良枸杞植物重要性狀和探究枸杞的系統發育提供基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突