基于HPLC 指紋圖譜及多成分定量對刺五加的質(zhì)量評價

宋 娟，張晶玉，呂重寧，路金才

沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016

刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr. et Maxim.) Harms 的干燥根和根莖或莖，具益氣健脾、補腎安神之效[1]。是重要的藥食同源藥材，有著“寧得一把五加，不用金玉滿車”之盛譽，自20 世紀(jì)70 年代起，我國對刺五加的需求日漸增長，大量無節(jié)制地采挖地下部分使其資源量急劇減少。由于野生資源的劇減，刺五加混淆品開始出現(xiàn)， 其主要混淆品為無梗五加Eleutherococcussessiliflorus(Rupr. & Maxim.) S. Y.Hu，同時人們已開始大力發(fā)展刺五加的人工栽培，以緩解供需矛盾。

在古代本草中未有刺五加相關(guān)記載，大多僅載五加皮，“刺五加”一詞始見于《中藥大辭典》，其明確指出刺五加為五加皮的來源植物之一[2]。現(xiàn)代研究表明，刺五加中主要含有苷類、黃酮類、多糖類、香豆素、木脂素及多種微量元素和氨基酸等成分，具有改善心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降血糖、抗輻射、抗腫瘤、抗疲勞等藥理作用，其中酚苷類化合物是刺五加根及根莖的主要活性成分[3-13]。

目前《中國藥典》2020 年版將紫丁香苷作為刺五加化學(xué)成分含量測定的唯一內(nèi)容，但中藥的藥理藥效是源自其復(fù)雜的化學(xué)成分，而非某一單一成分，故僅以紫丁香苷作為其質(zhì)量評價指標(biāo)，難以準(zhǔn)確地控制其質(zhì)量[14-16]。本研究對32 批市售刺五加飲片進(jìn)行HPLC 指紋圖譜研究，并同時測定原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E 及丁香樹脂酚7 種主要成分的含量，旨在通過多指標(biāo)、多成分含量測定，以更精確、更科學(xué)的方法綜合評價刺五加的質(zhì)量；此外，結(jié)合多元綜合分析對其進(jìn)行綜合評價，旨在找出對其質(zhì)量影響較大的關(guān)鍵性成分，為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20 高效液相色譜儀（SPD-M20A 光電二級管陣列紫外可見光檢測器、LabSolutions 色譜工作站，島津中國有限公司），萬分之一BS124S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），十萬分之一MS105DU 型電子天平（瑞士梅特勒托利多儀器有限公司），潔盟牌JP-040 超聲波清洗機（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司），磷酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），甲醇（分析純，山東禹王和天下新材料有限公司），水為娃哈哈純凈水。原兒茶酸（批號110809-201906，中國食品藥品檢定研究院）；紫丁香苷（批號111574-201605，中國食品藥品檢定研究院）；綠原酸（批號PU0100-0025，成都普斯生物科技股份有限公司）；刺五加苷E（批號PU1120-0025，成都普斯生物科技股份有限公司）；松柏苷、刺五加苷B1、丁香樹脂酚、丁香樹脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷4 種成分均為實驗室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于95.0%。

32 批市售刺五加飲片信息見表1，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院路金才教授鑒定其基原植物為刺五加A.senticosus(Rupr. et Maxim.) Harms。

表1 市售刺五加飲片信息Table 1 Information on commercially available A. senticosus decoction pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 刺五加HPLC 指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件 色譜柱（Diamonsil 5 μm C18（2），250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（B）-0.1%磷酸水（A）；梯度洗脫（0～1 min，7%～8% B；1～10 min，8%～10% B；10～23 min，10%～15% B；23～53 min，15%～30% B；53～63 min，30%～45%B；63～73 min，45% B）檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；體積流量0.8 mL/min。

2.1.2 對照品溶液的制備 取原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香樹脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、丁香樹脂酚對照品適量，加50%甲醇溶解，分別配制成含原兒茶酸2 μg/mL、松柏苷8 μg/mL、紫丁香苷40 μg/mL、綠原酸100 μg/mL、刺五加苷B1 20 μg/mL、刺五加苷E 30 μg/mL、丁香樹脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷3 μg/mL、丁香樹脂酚2 μg/mL 的溶液，過0.22 μm 有機濾膜，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取刺五加粗粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用提取溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.22 μm 有機濾膜，即得。

2.1.4 精密度試驗 取同一批刺五加粉末（編號AS30）1 份，按照“2.1.3”項下的方法進(jìn)行供試品溶液的制備，按照“2.1.1”項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算其色譜峰相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明：相對保留時間的RSD 小于0.08%，相對峰面積的RSD 小于2.98%。

2.1.5 重復(fù)性試驗 取同一批刺五加藥材粉末（編號AS30），按照“2.1.3”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明：各共有色譜峰相對保留時間的RSD 均小于0.12%，相對峰面積的RSD 均小于3.19%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批刺五加藥材粉末（編號AS30）一份，按照“2.1.3”項下的方法進(jìn)行供試品溶液的制備，按照“2.1.1”項下的色譜條件分別于0、3、6、9、12 h 進(jìn)樣分析，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明，相對保留時間RSD 小于0.09%，相對峰面積的RSD 小于2.85%，結(jié)果表明該供試品溶液在12 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.1.7 刺五加HPLC 指紋圖譜的建立

（1）共有峰及內(nèi)參照峰的確定：所建立的刺五加HPLC 指紋圖譜，共確定18 個共有峰（內(nèi)參照峰為紫丁香苷），HPLC 色譜圖如圖1 所示。并指認(rèn)了8 個色譜峰，分別為原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香樹脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和丁香樹脂酚，對照品色譜圖如圖2 所示。

圖1 刺五加HPLC 色譜圖Fig. 1 HPLC fingerprint of A. senticosus

圖2 混合對照品色譜圖Fig. 2 Chromatogram of mixed control substance

（2）HPLC 指紋圖譜的建立：取32 批市售刺五加飲片，按照“2.1.3”項下方法進(jìn)行供試品溶液的制備，按照“2.1.1”項下的色譜條件進(jìn)樣分析，將所得色譜數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》進(jìn)行處理分析。以AS30 作為參照圖譜，經(jīng)多點校正進(jìn)行自動匹配，生成指紋圖譜，結(jié)果見圖3；對其匹配結(jié)果進(jìn)行相似度評價，結(jié)果表明：32 批市售刺五加樣品的相似度范圍為0.945～0.999，均大于0.945，說明各批次市售刺五加樣品間主要化學(xué)成分較為一致，符合中藥指紋圖譜的研究要求，可用于刺五加的質(zhì)量評價，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)，相似度結(jié)果見表2。

圖3 市售刺五加指紋圖譜Fig. 3 Fingerprint of commercially available A. senticosus

表2 市售刺五加相似度值Table 2 Similarity value of commercially available A.senticosus

2.1.8 指紋圖譜結(jié)果分析 本研究對32 批市售刺五加飲片進(jìn)行了指紋圖譜分析，32 批樣品指紋圖譜相似度結(jié)果均在0.945 以上，說明各批次刺五加間主要化學(xué)成分較為一致，符合中藥指紋圖譜的研究要求，可用于刺五加的質(zhì)量評價，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。此外與對照品對比，指認(rèn)了8 種成分，分別為原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香樹脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和丁香樹脂酚。

2.2 刺五加HPLC 多成分含量測定

2.2.1 色譜條件及溶液的制備 同“2.1.1”“2.1.2”和“2.1.3”項下。

2.2.2 線性關(guān)系考察 取原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香樹脂酚對照品適量，加50%甲醇分別配制成含原兒茶酸111 μg/mL、松柏苷104 μg/mL、紫丁香苷197 μg/mL、綠原酸498 μg/mL、刺五加苷B1 106 μg/mL、刺五加苷E 150 μg/mL、丁香樹脂酚115 μg/mL 的溶液，作為對照品母液，備用。分別精密吸取各對照品適量，分別配制成6 個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按照“2.1.1”項下的色譜條件進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，如表3 所示。

表3 線性回歸方程Table 3 Linear regression equation

2.2.3 精密度試驗 取同一批刺五加粉末（編號AS30）1 份，按照“2.1.3”項下的方法進(jìn)行供試品溶液的制備，按照“2.1.1”項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算各待測色譜峰面積RSD 值，結(jié)果表明，原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香樹脂酚峰面積的RSD 分別小于2.89%、0.68%、0.27%、0.27%、2.79%、0.32%、0.28%，說明儀器的精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗 取同一批刺五加藥材粉末（AS30），按照“2.1.3”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算各待測成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD 值，結(jié)果表明，原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、刺五加苷B1、刺五加苷 E、丁香樹脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別小于2.26%、3.11%、3.38%、2.97%、3.70%、2.92%、2.80%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批刺五加藥材粉末（AS30）一份，按照“2.1.3”項下的方法進(jìn)行供試品溶液的制備，按照“2.1.1”項下的色譜條件分別于0、3、6、9、12 h 進(jìn)樣分析，計算各待測色譜峰面積RSD 值，結(jié)果表明，原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香樹脂酚的峰面積RSD 分別小于2.59%、0.60%、0.27%、0.25%、2.77%、0.32%、0.29%。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的同一批次（AS30）刺五加樣品0.5 g，分別精密加入適量對照品，按照“2.1.3”項下的方法平行制備供試品溶液6 份，按照“2.1.1”項下的色譜條件進(jìn)樣分析，計算得到原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香樹脂酚平均加樣回收率分別為92.51%、97.63%、95.11%、101.08%、105.29%、98.92%、94.89%，RSD 分別為2.69%、3.44%、2.42%、2.24%、1.32%、2.71%、2.99%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.7 樣品測定 取32 批市售刺五加飲片，按照“2.1.3”項下方法進(jìn)行供試品溶液的制備，按照“2.1.1”項下的色譜條件進(jìn)樣分析并計算樣品中7 種成分的含量，結(jié)果見表4。

2.2.8 含量測定結(jié)果分析 以指紋圖譜方法為基礎(chǔ)，對其中7 種成分進(jìn)行了含量測定，結(jié)果表明32批樣品中各成分含量分別為原兒茶酸為0.003%～0.016%；松柏苷為0.032%～0.005%；紫丁香苷為0.027%～0.120%；綠原酸為0.236%～0.624%；刺五加苷 B1 為 0.022%～0.146%；刺五加苷 E 為0.055%～0.096%；丁香樹脂酚為0.002%～0.010%；由上可知不同批次市售刺五加飲片中各成分含量波動較大。

（1） 主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，PLSADA）：在進(jìn)行PCA 之前，使用IBM SPSS Statistics 26 軟件對32 批市售刺五加飲片中7 種成分的色譜峰面積進(jìn)行KMO 和巴特利特檢驗，得到KMO 度量值為0.574，P為1.150 6×10-13，雖然KMO 值相對較小，但是其值大于0.5，此外P值小于0.05，提示可以進(jìn)行PCA 分析，故利用上述軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到特征值及方差貢獻(xiàn)比例，見表5。以特征值及方差累計貢獻(xiàn)率作為確定主成分個數(shù)的選擇依據(jù)，共有2 個主成分的特征值大于1，其方差累計貢獻(xiàn)率為66.920%，從碎石圖（圖4）可知，所提取的主成分中，前2 個主成分的斜率較大，而后各主成分的斜率相對較小，說明前2 個主成分在一定程度上可以用來表示刺五加的質(zhì)量。對所選擇的2 個主成分進(jìn)行分析及得分計算，結(jié)果見表5。通過SIMCA 14.1 軟件對32 批樣品中7 種成分的色譜峰面積進(jìn)行主成分分析并繪圖，所得PCA 的Biplot 圖（圖5）；此外對數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA，可得VIP 值，結(jié)果見圖6。

圖4 主成分碎石圖Fig. 4 Scree plot of principal components

圖6 OPLS-DA VIP 值Fig. 6 VIP value of OPLS-DA

表5 主成分得分、綜合得分及排序Table 5 Principal component score, composite score and ranking

由表5 和圖4 可知，2 個主成分所反映的信息和主成分分析所得結(jié)果相符，可以得到以下相關(guān)信息：（1）可以將32 批樣品分成2 類，第1 類：AS1、AS5、AS10、AS11、AS13、AS14、AS15、AS16、AS18、AS20、AS22、AS24、AS26、AS27、AS29、AS30；第2 類：AS2、AS3、AS4、AS6、AS7、AS8、AS9、AS12、AS17、AS19、AS21、AS23、AS25、AS28、AS31、AS32。（2）圖5 中每個圓點代表1 個成分，其離原點越遠(yuǎn)表示組間差異性越大，從圖中可知紫丁香苷、刺五加苷B1、松柏苷及綠原酸明顯偏離原點。（3）通過圖6 中VIP 值大于1，可以篩選出2 個差異成分（紫丁香苷、刺五加苷B1），該結(jié)果和主成分分析結(jié)果較為一致，表明這2 個成分可能是對刺五加質(zhì)量差異影響較大的成分。

（2）Pearson 相關(guān)性分析：Pearson 相關(guān)性分析是用來衡量2 個變量之間是否存在線性關(guān)系的分析方法，其衡量標(biāo)準(zhǔn)用相關(guān)系數(shù)（r）來表示，其數(shù)值為±1，可表示2 個變量間的線性關(guān)系強度及方向。使用IBM SPSS Statistics 26 軟件對32 批刺五加中7種成分含量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見表6。由r可知紫丁香苷、綠原酸與刺五加苷B1 與其他成分的相關(guān)性最強，其中紫丁香苷與原兒茶酸、松柏苷、刺五加苷B1 呈顯著正相關(guān)，與綠原酸呈顯著負(fù)相關(guān)；綠原酸與原兒茶酸、紫丁香苷、刺五加苷B1 和丁香樹脂酚呈顯著負(fù)相關(guān)；刺五加苷B1 與原兒茶酸、松柏苷和紫丁香苷呈顯著正相關(guān)，與綠原酸呈顯著負(fù)相關(guān)。

表6 Peaeson 相關(guān)性分析結(jié)果Table 6 Peaeson correlation analysis results

3 討論

該實驗研究前期進(jìn)行色譜條件優(yōu)化時，對刺五加供試品溶液在190～400 nm 紫外-可見光全波長掃描，結(jié)果表明210 nm 下的色譜峰數(shù)目、峰形、分離度較好，較為適宜指紋圖譜的研究，故該研究選擇210 m 作為檢測波長；此外該研究為了尋求較優(yōu)的色譜條件，先后考察了不同提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇、無水乙醇）、提取方式（加熱回流提取，超聲提取）、提取時間（15、30、45 min）、料液比（1∶10、1∶25、1∶40）、不同流動相體系（甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸水，乙腈-0.1%磷酸水）、柱溫（25、30、35 ℃）、體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min），結(jié)果表明選擇柱溫30 ℃，體積流量0.8 mL/min，流動相體系為乙腈-0.1%磷酸水，50%甲醇超聲提取30 min時，所得色譜結(jié)果的色譜峰數(shù)目、峰形以及分離度較好。

通過HPLC 法建立了刺五加指紋圖譜，并基于該方法同時測定了7 種成分的含量。基于刺五加含量測定結(jié)果，以7 種主要成分進(jìn)行了PCA 分析、OPLS-DA 分析和Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果表明紫丁香苷、綠原酸和刺五加苷B1 可能為刺五加質(zhì)量差異的關(guān)鍵性成分，其中Pearson 相關(guān)性分析表明綠原酸與各成分多呈負(fù)相關(guān)，紫丁香苷和刺五加苷B1 除了與綠原酸呈負(fù)相關(guān)外，與其他成分均呈正相關(guān)，說明這3 種成分對其他組分存在較為緊密的聯(lián)系，綜合各分析方法結(jié)果，說明紫丁香苷、綠原酸和刺五加苷B1 在一定程度上可代表刺五加的質(zhì)量。

我國現(xiàn)有的中藥質(zhì)量評價模式多采取傳統(tǒng)鑒別（性狀鑒別、顯微鑒別）和化學(xué)成分分析相結(jié)合的方式[14-15]。但中藥的化學(xué)成分十分復(fù)雜，不同于成分單一、療效及機制相對明確的化藥，故該評價方式并不能十分準(zhǔn)確的評價中藥材或中藥復(fù)方的質(zhì)量。因此，對指標(biāo)成分的選取原則以及選擇的指標(biāo)成分能否有效地反映中藥的質(zhì)量，能否代表整個中藥或復(fù)方，成為當(dāng)前中藥分析研究的重點與難點。本研究結(jié)果表明刺五加中紫丁香苷、綠原酸和刺五加苷B1 對刺五加質(zhì)量聯(lián)系緊密，故在其質(zhì)量控制中可綜合考慮這3 種成分；此外，本實驗通過色譜優(yōu)化以及方法學(xué)考察建立了刺五加指紋圖譜和含量測定的方法，該方法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好；可用于刺五加的質(zhì)量評價，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突