一測多評法聯合化學計量學及熵權優劣解距離分析綜合評價青錢柳藥材質量

張富麗 ，管海波 ，戶軍燕 ，王志斌，趙明霞

1. 鄭州大學第五附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450000

2. 鄭州大學第五附屬醫院 精準用藥實驗室，河南 鄭州 450000

3. 鄭州大學第五附屬醫院 處方前置審核中心，河南 鄭州 450000

4. 河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046

青錢柳為胡桃科植物青錢柳Cyclocarya paliurus(Batal.) Iljinsk.的干燥葉[1-2]，分布于貴州、湖南、安徽、江西、浙江、福建、四川等地[3]。主要含有黃酮化合物、酚類、多糖、常量及微量元素等物質[4-6]。具有生津止渴、祛風止癢、消腫止痛之功，研究發現其通過保護胰島細胞、調節胰島素信號通路、促進葡萄糖利用等發揮改善糖代謝的作用，并通過調控脂質代謝通路、抑制脂質過氧化等發揮改善脂代謝的作用[7]；青錢柳三萜可降低Akt 和內皮型一氧化氮合酶的磷酸化水平及Rho 激酶和精氨酸酶2 的表達水平，從而改善腎內皮功能，緩解H2O2誘導的內皮損傷[8]，還可通過PI3K/Akt/m TOR 依賴性自噬抑制NLRP3 炎癥小體的表達，從而改善由高尿酸引起的痛風[9]；青錢柳多糖可逆轉糖尿病組小鼠體內尿酸水平的升高[10]，進而改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病；其提取物還可通過脂肪自噬途徑清除肝臟脂肪，改善非酒精性脂肪肝病[11]；青錢柳還是“天然抗氧化劑”，其黃酮類成分與體內自由基結合成的化合物，可清除自由基而達到抗氧化的效果[12]。總之青錢柳的藥用價值非常高。青錢柳未收錄于中國藥典，曾被一些地方標準收錄[13-16]，但這些標準的質量控制僅局限于顯微鑒別、薄層鑒別及其他一般的檢查項目，涉及的含量測定也僅有1到2 個成分的檢測，均不能全面科學地評價青錢柳整體質量，因此開展對青錢柳整體質量控制和品質評價研究對確保臨床應用療效一致性具有重要意義。本實驗收集貴州、湖南、安徽、江西、浙江、福建、四川等7 省18 批次青錢柳藥材，采用一測多評（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）法同時測定青錢柳中金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、異槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、齊墩果酸、熊果酸、阿江欖仁酸、青錢柳苷H、科羅索酸、白樺脂酸、山楂酸和α-乳香酸的含量，借助主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析等方法對14 個成分測定結果進行分析，再結合熵權TOPSIS 法對其質量優劣性進行排序，旨為青錢柳的質量評價及全面有效建立青錢柳的質量標準提供依據。

1 試藥與儀器

1.1 主要藥品與試劑

對照品熊果酸、槲皮素、異槲皮苷、齊墩果酸和金絲桃苷（批號分別為110742-201823、100081-201610、111809-202205、110709-202109 和111521-202310，質量分數依次為99.9%、99.1%、96.3%、95.8%和94.7%）源于中國食品藥品檢定研究院；對照品白樺脂酸、山楂酸、阿福豆苷、科羅索酸、山柰酚、α-乳香酸、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷和阿江欖仁酸（批號分別為PRF8010444、PRF908292、PRF9092622 、 PRF8092102 、 PRF23101326 、PRF8052701、PRF9113022 和PRFM2305301，質量分數依次為99.9%、99.8%、99.6%、99.6%、99.3%、99.2%、98.0%和98.0%）源于成都普瑞法科技開發有限公司；青錢柳苷H（批號WQK2204095，含量98.0%）源于四川省維克奇生物科技有限公司；青錢柳藥材采集地信息見表1；乙腈、磷酸、配流動相用甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑為分析純。

表1 青錢柳藥材信息Table 1 Medicinal materials information of C. paliurus

1.2 主要儀器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司），2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XS205Du 型電子分析天平（瑞士梅特勒公司），4020P 型超聲波清洗器（韓國JAC 公司）；色譜柱Venusil MP C18、Waters Xbridge C18、Boston Boschrom C18，規格均為（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取14 個對照品各適量，用75%甲醇制備金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、異槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、齊墩果酸、熊果酸、阿江欖仁酸、青錢柳苷H、科羅索酸、白樺脂酸、山楂酸和α-乳香酸質量濃度分別為4.812、6.190、1.128、2.870、0.412、0.158、0.104、1.470、0.048、0.232、0.890、0.072、0.630 和0.308 mg/mL 的混合對照品母液，精密吸取該母液1 mL，置20 mL 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取粉碎的青錢柳粉末約1 g，精密稱定，于25 mL 量瓶中，加溶劑20 mL，超聲處理45 min，放至常溫，溶劑定容，搖勻，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18柱，柱溫30 ℃；流動相乙腈（A）-0.2%磷酸梯度洗脫（0～11 min，17.0%A；11～34 min，17.0%～40.0% A；34～66 min，40.0%～65.0% A；66～75 min，65.0%～17.0% A）；檢測波長360 nm（0～35 min 檢測金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、異槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素和山柰酚）、210 nm（35～43 min 檢測齊墩果酸、熊果酸、阿江欖仁酸、青錢柳苷H、科羅索酸、白樺脂酸、山楂酸和α-乳香酸），體積流量1.0 mL/min，進樣量10 μL。

2.4 HPLC 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 取“2.1”和“2.2”項下2 種溶液，按上述色譜條件測定。曲線圖譜（圖1）顯示供試品溶液中14 種成分的出峰位置與對照品基本一致，且色譜峰對稱性好，與相鄰色譜峰分離度符合《中國藥典》2020 年版要求，理論板數按各成分計均大于5 000。

圖1 混合對照品 (A) 和青錢柳樣品 (B) 的HPLC 色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed control substance (A) and C. paliurus sample (B)

2.4.2 線性回歸試驗 精密吸取混合對照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和5.0 mL，分別用上述溶劑定容至20 mL 量瓶，搖勻制得系列濃度從低到高的混合對照品溶液1～6。精密吸取溶液1～6 各10μL，分別注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品質量濃度對峰面積進行線性回歸，得標準曲線、相關系數及回歸方程。詳見表2。

表2 青錢柳中各成分的線性回歸結果Table 2 Results of linear regression of each constituent in C. paliurus

2.4.3 精密度試驗 取青錢柳（S1）樣品制成的供試品溶液1 份，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，結果金絲桃苷等14 個成分峰面積的RSD 值依次為0.66%、0.52%、1.06%、0.83%、1.38%、1.54%、1.67%、0.71%、1.68%、1.46%、1.15%、1.65%、1.22%和1.39%，表明儀器精密度良好，可以滿足試驗檢測。

2.4.4 穩定性試驗 取青錢柳（S1）樣品按“2.2”項下方法制成的供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、5、9、14、20 和24 h 時，按2.3 項下色譜條件進樣，結果金絲桃苷等14 個成分峰面積的RSD 值依次為1.01%、0.95%、1.58%、1.05%、1.61%、1.55%、1.85%、1.12%、1.91%、1.78%、1.46%、1.63%、1.55%和1.71%，表明青錢柳供試品溶液24 h 內穩定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取青錢柳（S1）樣品6 份，分別按“2.2”項下方法制成供試品溶液，各精密吸取10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄金絲桃苷等14個成分的峰面積，加載2.4.2 項的標準曲線，用外標法計算14 個成分的含量，計算各成分含量的RSD值依次為1.09%、0.91%、1.28%、1.16%、1.76%、1.85%、1.79%、1.32%、1.96%、1.76%、1.27%、1.85%、1.67%和1.80%，表明重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知14 個成分含量的青錢柳（S1）細粉9 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別按已知各成分含量的80%、100%、120% 3 個水平加入混合對照品溶液（每mL 含3.192 mg 金絲桃苷、4.503 mg 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、0.814 mg異槲皮苷、1.957 mg 阿福豆苷、0.218 mg 槲皮素、0.084 mg 山柰酚、0.059 mg 齊墩果酸、0.997 mg 熊果酸、0.027 mg 阿江欖仁酸、0.138 mg 青錢柳苷H、0.482 mg 科羅索酸、0.041 mg 白樺脂酸、0.359 mg山楂酸和0.168 mg α-乳香酸），每個水平各3 份，再按“2.2”項方法制得加樣供試品溶液，各精密吸取10 μL，分別注入液相色譜儀，計算14 種成分的平均加樣回收率100.08%、100.14%、99.46%、99.74%、97.59%、97.89%、96.94%、99.56%、97.16%、98.63%、99.52%、96.97%、99.03%和98.42%；RSD分別為0.63%、0.87%、1.29%、0.68%、1.32%、1.03%、1.44%、1.27%、1.48%、1.51%、0.99%、1.36%、1.52%和1.55%，表明本實驗方法具有良好的回收率。

2.5 一測多評法的建立[17]

2.5.1 相對校正因子（f）的計算 取“2.4.2”項6個混合對照品溶液，以熊果酸為參照物，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，依公式計算，結果見表3。

表3 青錢柳中各種成分的f 值Table 3 f value of each component in C. paliurus

f為相對校正因子、ρi和Ai分別為內參物質量濃度和峰面積、ρs和As為其他待測成分質量濃度和峰面積

2.5.2f耐用性考察 精密吸取混合對照品溶液，選用Thermo Ultimate 3000 型和2695 型HPLC 系統與和Venusil MP C18色譜柱、Waters Xbridge C18色譜柱、Boston Boschrom C18色譜柱，體積流量為（1.0±0.2）mL/min，柱溫（30±5）℃等條件，分別考察色譜系統及色譜柱、體積流量和柱溫的改變對f的影響。每次進樣10 μL，記錄峰面積。結果見表4～6，表明儀器與色譜柱、體積流量和柱溫的改變對所建立的f均無較大影響。

表4 不同色譜柱對f 的影響Table 4 Effect of different chromatographic columns on f

表5 不同體積流量對f 的影響Table 5 Effec of different volume flow rates on f

表6 不同柱溫對f 的影響Table 6 Effect of different column temperatures on f

2.5.3 相對保留時間的測定 記錄“2.5.2”項下不同HPLC 儀與不同色譜柱時14 個成分的保留時間，以熊果酸為內參物，采用相對保留時間值（t）法對色譜峰進行定位。結果各成分t值的RSD均≤1.87%（表7），表明各待測成分的t值波動較小，無顯著差異，可以對青錢柳中多組分色譜峰進行準確定位。

表7 各待測成分的相對保留時間值Table 7 t of each component to be tested

2.6 含量測定

取18 批青錢柳（S1～S18），按“2.2”項下方法制備供試品溶液（每批平行制備3 份），取各供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定金絲桃苷等14 個成分的峰面積，加載“2.4.2”項標準曲線，采用外標法計算青錢柳中14 種成分的含量；再以熊果酸為內參物，運用“2.5.1”項下所得f的均值，采用QAMS 法計算各組分含量。對每一成分2 種方法所得含量數據進行t檢驗（表8）。結果P＞0.05，表明2 種方法差異不明顯。

表8 青錢柳中14 種成分含量測定結果及比較 (n＝3)Table 8 Content determination results and comparison of 14 components in C. paliurus (n＝3)

2.7 化學計量學方法的建立[18]

2.7.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） 以18 批青錢柳中14 個成分QAMS 法計算的含量數據為變量構建14×18 階矩陣，采用SPSS 26.0 統計軟件提取主成分，得各主成分方差分析表（表9）和成分矩陣表（表10）。選取特征值大于1的公因子為主成分，結果前2 個主成分的方差貢獻率分別為69.443%和20.155%，特征值分別為9.722和2.822，累積方差貢獻率為89.598%，表明前2 個主成分因子能夠解釋14 個成分89.598%的原始變量。由表10 可知，第1 主成分主要反映金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、異槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、熊果酸、青錢柳苷H、科羅索酸、山楂酸和α-乳香酸等成分的綜合信息，第2 主成分則集中了齊墩果酸、阿江欖仁酸和白樺脂酸的信息。為查找18 批青錢柳的相關性與差異性，將14×18階矩陣導入SIMCA 14.1 軟件構建PCA 模型（圖2），結果18 批樣品被分為3 類，其中S1～S8 為一組，S9～S12 為一組，S13～S18 為一組，表明不同產地青錢柳的質量存在差異。

圖2 18 批青錢柳的PCA 得分圖Fig. 2 PCA score chart of 18 batches of C. paliurus

表9 18 批青錢柳主成分分析結果Table 9 Results of principal component analysis of 18 batches of C. paliurus

表10 青錢柳中14 種成分的初始因子載荷矩陣Table 10 Primary factor loading matrix of 14 components in C. paliurus

2.7.2 正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLSDA） 為挖掘14 個指標成分中哪些成分是引起青錢柳產品質量差異的主要潛在標志物，繼續運用SIMCA 14.1 軟件建立OPLS-DA 模型（圖3），結果18 批樣品聚類更明顯，其中S9、S10、S11 和S12位于得分圖右方；S3、S2、S5、S7、S4、S8、S6 和S1 位于得分圖中上方；S18、S13、S17、S15、S14和S16 位于得分圖左下方。結合變量重要性投影（VIP）法，以1 為VIP 的閾值為篩選標準[19]，篩選引起青錢柳樣品質量差異的主要潛在標志物，VIP值越大，表明該成分對青錢柳組間質量差異的影響越大，18 批青錢柳各成分VIP 圖見圖4。其中VIP槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷＝1.869 0、VIP金絲桃苷＝1.720 9、VIP熊果酸＝1.352 4、VIP阿福豆苷＝1.269 5、VIP異槲皮苷＝1.010 9，表明這5 個成分是影響青錢柳產品質量的主要潛在標志物。

圖3 18 批青錢柳樣品的OPLS-DA 模型得分圖Fig. 3 Score chart of OPLS-DA model of 18 batches of C.paliurus samples

圖4 18 批青錢柳的VIP 圖Fig. 4 VIP image of 18 batches of C. paliurus

2.8 熵權TOPSIS 法（entropy weight-TOPSIS，EW-TOPSIS）分析[20]

以18 批青錢柳中14 種成分QAMS 法含量檢測數據為變量建立初始化決策矩陣，采用越大越優型指標計算公式，對原始含量數據進行歸一化處理（表11）。

表11 18 批青錢柳中各指標歸一化處理結果Table 11 Results of normalization treatment for each index of 18 batches of C. paliurus

Xij和Yij分別為原始含量數據和數據歸一化后數據，max(xj)和min（xj）分別為各成分含量數據的最大值和最小值

再以“2.7.2”項中各成分的VIP 值作為各指標權重（Wj），運用公式Zij＝Yij×Wj構建加權決策矩陣（表12），得最優方案Zj+＝1.720 9、1.869 0、1.010 9、1.269 5、0.488 8、0.378 1、0.543 0、1.352 4、0.445 8、0.833 6、0.673 5、0.583 2、0.663 3 和0.527 9，最劣方案Zj-均為0。采用評價指標與正負理想解距離計算公式，計算理想解方案（Di+）和負理想解方案（Di-）及各評價指標的評分（Ci），結果見表13。

表12 18 批青錢柳加權矩陣Table 12 Weighting matrix of 18 batches of C. paliurus

表13 18 批青錢柳藥材質量評價排序Table 13 Relative ordering of quality evaluation of 18 batches of C. paliurus medicinal materials

EW-TOPSIS 分析結果顯示，Ci排名前6 位的依次為S16、S14、S15、S13、S17 和S18，分別來自貴州和四川，Ci值均大于0.6，表明這2 個產區所得青錢柳整體質量最佳。

3 討論

3.1 供試品提取方法的確定

本實驗在制備供試品溶液時，同時以色譜峰豐度、峰形、分離度、雜質數量為評價指標，分別考察了不同濃度的甲醇溶液采用超聲或加熱回流，提取30、45、60 min 時的提取效果，結果顯示75%甲醇超聲提取45 min 時得到的14 種成分色譜峰響應值較大、峰形、分離度較好，雜質較少。

3.2 色譜條件的確定

本實驗通過對14 個指標成分溶液進行全波長掃描，觀察各成分光譜曲線中的最大吸收，結合中國藥典及相關文獻報道[21-22]，最終確定采用360 nm檢測金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、異槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素和山柰酚，210 nm 檢測齊墩果酸、熊果酸、阿江欖仁酸、青錢柳苷H、科羅索酸、白樺脂酸、山楂酸和α-乳香酸，各成分在該條件下響應值較大，峰形尖銳，青錢柳供試品溶液在該條件下檢測時基線相對平穩，且各成分分離度良好。本實驗在篩選流動相時，首先考察了基礎流動相系統：甲醇-水和乙腈-水，結果乙腈-水系統洗脫效果較好，但金絲桃苷色譜峰與槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷不能完全分離，遂加入磷酸溶液（0.05%、0.1%、0.2%）進行調節，結果以乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動相系統時，洗脫效果最佳。

3.3 質量分析結果評價

本實驗采用HPLC-QAMS 法對18 批青錢柳中14 個成分進行定量測定，再結合化學計量學中常用的PCA 和OPLS-DA 法對檢測結果進行分析，結果18 批不同產地青錢柳明顯聚為3 類，呈現一定的產區差異。OPLS-DA 分析發掘出影響青錢柳產品質量的主要潛在標志物為槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、金絲桃苷、熊果酸、阿福豆苷和異槲皮苷。EW-TOPSIS結果顯示貴州和四川地區所得青錢柳整體質量較好，其次為湖南、江西和安徽。

4 結論

本實驗建立的方法可操作性強，有效降低了檢驗成本，有利于多指標成分定量控制模式的普及應用，也為該藥材的道地性研究提供了基礎，有助于青錢柳優質種源的研究與開發。同時中藥材質量受產地土壤、氣候、海拔、水質、生態環境等多因素影響[23]，后續將擴大樣品采集地，收集土壤、氣候、海拔等參數，進一步挖掘影響產品質量差異性因素。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突