代謝組學在中藥復方制劑領域的研究進展及面臨的挑戰

徐 楊 ，何芷綺，劉曉鳳，蘇 杰，馬錦雯，向宇陽，劉 濤

1. 成都大學藥學院，四川 成都 610100

2. 成都大學張瀾學院，四川 成都 610100

3. 四川天一學院，四川 德陽 618000

4. 成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610100

中醫學是中國古代在“陰陽五行”理論指導下對人體生理病理進行研究的學科，強調整體觀和辨證論治，在臨床應用中多以復方給藥[1-2]，然而，中藥成分復雜，各成分間相互作用，具有多成分、多靶點、多途徑的特點。在“整體調控”的認知模式下，中藥復方制劑的作用機制大多尚不明確。代謝組學技術最早由Nicholson 教授[3]提出，是對不同生物體、樣本或組織的所有代謝物進行定性和定量分析，并尋找代謝物與生理、病理、表型變化相對關系的研究方式，研究藥物進入機體后對體內內源性代謝物的影響，是系統生物學的重要組成部分。代謝組學的主要目的是測量生物系統對生物刺激或基因操縱的全局動態代謝變化。區別于傳統研究中“自下而上”的方法，其通過對復雜生物體中內源性小分子代謝物進行定性分析和定量監測，篩選具有明顯濃度變化的代謝產物作為機體接受生理刺激后相關代謝變化的生物標志物，進而研究其在生物系統內的作用途徑。代謝產物的濃度通常伴隨著相應疾病的傳變而變化，因此，代謝組學動態分析生物體代謝情況變化的整體性、系統性特點與中醫“整體觀”的基本特點相吻合，與中醫藥多靶點、多途徑的特點相契合[4]，近年來在中藥研究中應用廣泛。將代謝組學運用在中醫藥研究的過程中，建立“藥物-代謝物-代謝途徑”網絡，能夠更好地闡述中藥“辨證論治”過程的作用機制。本文通過對近年來代謝組學的研究思路、在中藥復方制劑研究中的應用和目前面臨的挑戰進行綜述，為進一步完善代謝組學研究方法并闡明中藥復方制劑作用機制提供參考。

1 代謝組學簡介

代謝組學關注的對象通常是相對分子質量1 000以下的小分子化合物，包括脂質、核酸、氨基酸、肽、有機酸和碳水化合物等[5]，其研究的經典樣本為血樣、尿液及特定的細胞或組織提取液等，近年來也出現了一些基于疾病特異性的新樣本研究方法，如腸道代謝組學、單細胞代謝組學、外周血單個核細胞代謝組學、細胞器代謝組學（溶酶體、線粒體）、微生物代謝組學[6]等，這些新樣本研究方法更貼切疾病本身的層面，更能夠準確反應出機體用藥后的代謝波動情況，為精確的代謝組學研究提供思路，楊瀾等[7]以大鼠糞便為樣本，研究脈絡舒通丸對股骨折后后肢腫脹大鼠糞便代謝物的調節作用，并將其腸道代謝組學與腸道菌群聯合分析，結果顯示糞便代謝中顯著差異代謝物石膽酸、脫氧膽酸、膽酸與Papilibacter、Intestinimonas、Turicibacte、葡萄球菌呈顯著正相關，表明腸道代謝物與腸道菌群密切相關，進一步說明代謝研究中樣本選擇的重要性。

代謝組學根據研究的目標和方法，可分為非靶向和靶向代謝組學。結合中藥、中藥復方制劑成分繁多、作用機制復雜的特點，代謝組學圍繞中醫藥核心，聯合多技術、新手段發展出很多分支，如脂質代謝組學、空間代謝組學、序貫代謝組學[8]、功能代謝組學等。

1.1 非靶向代謝組學

非靶向代謝組學是指全面檢測和分析生物樣本中的所有代謝物，可以全面了解機體受藥物干預后代謝物的變化，而不局限于已有的研究結論。非靶向代謝組學研究利用高通量的分析方法，如核磁共振和質譜等，全面分析樣本代謝譜以發現未知代謝物和代謝通路，同時也面臨著大量的復雜數據需要處理和解釋的問題。在其“全局性”的指導下，非靶向代謝組學發展出了脂質代謝組學、揮發物代謝組學、空間代謝組學等新技術[6]，這些新技術在不同方向上彌補了典型非靶向代謝組學的缺點。如典型代謝組學中關于代謝物空間分布的全部信息丟失問題可以通過空間代謝組學解決，空間代謝組學還可更好地反映結構多樣的小分子物質，展示差異代謝物在機體內的代謝分布，幫助研究者深入了解中藥復雜成分和作用機制。作為一種新型的分子影像技術，空間代謝組學能夠直接從生物組織中獲得大量已知或未知的內源性代謝物和外源性藥物等分子的結構、含量和空間分布信息[9]，采取的研究技術為空氣動力輔助離子化解吸電噴霧電離質譜成像，基于此技術，空間代謝組學具有免標記、無需基質、周期短的優勢[10]，Fox 等[9]發現寬帶相干反斯托克斯拉曼散射（broadband coherent anti-stokes Raman scattering，BCARS）光譜成像技術可提供靈敏度和空間分辨率，以至在亞細胞水平上區分不同的密切相關的化學物質，BCARS 與解吸電噴霧電離質譜技術聯用可以更好地表征代謝物空間和時間模式，且BCARS 可以持續研究活體、完整的標本，以提供直接觀察代謝過程的動力學解釋。

1.2 靶向代謝組學

靶向代謝組學是對選定的特定代謝物或代謝通路進行檢測和分析，以對其進行深入分析，深度闡釋藥物在特定代謝途徑的作用機制。靶向代謝組學通過專門的代謝物提取技術和檢測手段用于開展研究，用于分離研究者感興趣的代謝物，從而減少其他高豐度代謝物的干擾[11]，故靶向代謝組學較非靶向代謝組學更能準確地對代謝物進行定量分析，并為其生物學解釋提供更好定義和補充的數據集。靶向代謝組學發展出了功能代謝組學、糖代謝、脂質代謝、酶代謝和基于特定小分子代謝物或代謝途徑研究等的各類靶向代謝組學（特定脂質、特定核苷酸代謝）等。其中，功能代謝組學可通過精確捕捉疾病反應代謝物生物標志物和功能性化合物（次級代謝物）間的分子相互作用，揭示中藥衍生物阻斷疾病相關決定性分子的生物合成，調節病原致病時的生化相互作用過程，實現對疾病的發現和治療，從而表征中醫“系統治療”的特點[12]。

非靶向和靶向代謝組學在中藥研究中都具有重要作用，非靶向代謝組學可應用在中藥質量評價、藥效研究、藥物相互作用和中藥毒性研究等方面，靶向代謝組學則基于其“靶向性”被用于中藥活性成分、代謝途徑、代謝酶及中藥藥效重要標志物等方面。需要指出的是，靶向和非靶向代謝組學并非嚴格對立，實際研究中往往結合二者的方法和策略，以全面了解代謝物的變化和對機體的影響。一些代謝組學研究技術依據研究焦點和目的，既可劃分為非靶向代謝組學，也可以被視為靶向代謝組學，如序貫代謝[8]、腸道代謝等。在腸道非靶向代謝組學中，通過全面分析腸道微生物與宿主的相互作用，揭示腸道代謝的變化與其宿主健康的聯系[7]。而在腸道靶向代謝組學中，研究者可能選擇少數特定的代謝物或代謝通路，如短鏈脂肪酸、膽汁酸、氨基酸等，研究腸道代謝的特定方面；出于不同研究目的，即使對同類物質進行研究（如脂質），當研究者關注機體內全部脂質的代謝水平變化時，通常采用非靶向代謝組學工具，如果關注的是特定的某一脂質小分子或途徑，則以靶向代謝組學方法展開研究。

2 代謝組學在中藥研究中的研究流程和方法

在中藥研究中，代謝組學研究可以分為中藥樣品前處理、濕法實驗和干法實驗3 個階段共5 個流程。中藥樣品前處理是指對中藥樣品進行一系列處理步驟，以提取和制備樣品中的代謝產物，去除可能干擾分析的雜質以便進行后續的分析和研究；濕法實驗階段包括代謝樣本采集和樣品分析2 個流程；干法實驗階段包括代謝物數據分析和生物內涵解釋2 個流程，見圖1。

圖1 中藥復方制劑研究的代謝組學基本研究流程Fig. 1 Basic metabolomics research flow of traditional Chinese medicine compound preparation

2.1 中藥樣品前處理

中藥鮮品藥材一般需液氮冷凍后研磨成粉后進行冷凍干燥，再選擇甲醇或乙腈等有機溶劑進行提取；中藥飲片則根據其所含化合物的類別，采用對應的溶劑進行飲片中有效成分的提取[4]；中藥復方制劑則應結合中藥復方制劑的理化性質選擇合適的溶媒，并采用合適的配制方法，建立供試品的配制規程，并記錄實驗中完整的配制過程及關鍵參數。中藥復方給藥制劑一般多采用現用現配的方式。

2.2 樣品采集

在代謝組學研究中，研究目的不同，動物代謝測定樣本有異，可為血液、尿液、糞便等，采集過程中應避免樣本受到污染，采集后應及時處理，避免樣本理化性質發生明顯變化，從而影響實驗結果和結論。此外，同類疾病的造模方式不同也會影響對同藥物治療后機體代謝水平變化，徐霞[13]對脾虛濕困型潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）大鼠進行代謝組學研究時，將大鼠造模分為脾虛濕困型UC 和單純UC，研究結果顯示，參苓白術散治療過程中，2 組不同造模方式大鼠共存在3 個潛在生物標志物，亦分別存在顯著變化的潛在生物標志物11、9 個，說明對于同類疾病，造模方法不同，其給藥后的代謝變化可能會出現同中有異的情況。此外，對于相同疾病，采集分析的樣品種類不同，代謝組學的研究結果也會有所差異，Liu 等[14]在對抑郁癥小鼠進行代謝組學研究時，制備和分析的樣品為腎組織提取液，代謝組學結果表明精氨酸代謝途徑是抑郁癥小鼠受干擾最明顯的代謝途徑，而Chen 等[15]在研究抑郁癥小鼠代謝紊亂時，使用分析的樣品則是慢性輕度應激（chronic mild stress，CMS）小鼠嗅球，其代謝組學結果表明色氨酸異常代謝是CMS 抑郁模型嗅球的核心發病機制。此類因分析樣品不同而代謝組學結果不同的研究對比不在少數，提示后續研究者在代謝組學研究過程中，對代謝樣品選取中需要多加考察和辨證擇取，更要考慮特定疾病的病灶和藥物作用靶點等。

2.3 樣品分析

該流程主要包括樣品前處理、代謝物色譜分析和代謝物質譜分析。目前，代謝組學對生物樣本常用的處理方法為溶劑沉淀、液液萃取、固相萃取和超臨界萃取等[16]。液相色譜和氣相色譜是代謝物色譜分析過程中運用最廣泛的工具，二者能夠有效地實現代謝物分離。在這2 種技術基礎上，根據不同的研究需求已發展出了更具針對性的研究方法，如高效液相色譜法、毛細管高效液相色譜法、超高效液相色譜法等[17]。檢測方面，質譜和核磁共振是其中的主流檢測手段。質譜常常與液相或氣相色譜聯用而作為一種定量測定代謝物濃度的工具；而核磁共振則作為另一種獨立的檢測方法，具有不損壞分析物，可有效觀察代謝物動力學和螯合作用的特點，二者各有優劣[18]。

2.4 數據分析

此步驟將樣本上機分析處理后，將質譜數據進行降噪、峰提取、歸一化、中心化等處理后得到代謝組學數據集，通過多元統計方法處理數據集，其統計方法包括無監督方法和監督方法。無監督方法包括主成分分析（principal component analysis，PCA）和層次聚類分析，在不使用任何類別成員的情況下，根據所使用的算法研究全局變化。這種類型的方法是挑選數據集中主要變異的理想模式。在監督形式的模式識別中，如許多形式的判別分析，類別成員關系會被用來驅動聚類[19]。完成多變量分析后通過將關鍵變量投影重要性指標（variable importance in projection，VIP）、樣本間代謝物濃度的差異倍數、某代謝物在比較分組間的表達差異顯著與否等作為評價指標，篩選出差異代謝物，常用的代謝物鑒定平臺為人類代謝組數據庫、MetLin 數據庫、生物磁共振庫等[6]。

2.5 生物內涵解釋

生物內涵解釋即生物功能挖掘，尋找藥物進入機體后，機體內受顯著影響的代謝途徑，以此連接藥物作用和生物體的代謝變化，常用的生物功能挖掘平臺為京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、MetaboAnalyst 等。

為了滿足定向研究的需求，更多新興的代謝組學方法出現，如空間代謝組學研究，該方法對樣品的處理要求較典型代謝組學更高，在完成組織樣品處理后，還需要進行切片處理和質譜數據采集，有利于研究者獲取樣品內不同位置的代謝物信息，以進一步了解生物體內代謝的空間分布特征。樣本獲取和切片制備是空間代謝組學研究質譜成像結果準確性和真實性的關鍵環節，對于中藥材樣本處理，也發展出了相應的包埋處理冷凍切片分析和轉印法間接分析等適應中藥材研究的技術[20]。

3 代謝組學在中藥復方制劑中的應用

傳統的藥動學定量研究藥物在生物體內的過程（吸收、分布、代謝和排泄），往往專注于評估藥物的全身暴露和相關處置[21]，由于中藥所含化學成分復雜，體內代謝過程尚不完全清楚，加之中藥復方制劑由多味藥物組成，各藥材在體內的協同或拮抗關系尚不明晰，因此，采用傳統的藥動學無法闡釋中藥復方制劑在體內的過程。而代謝組學立足機體代謝變化，通過研究機體給藥后的差異代謝物，揭示中藥復方制劑的作用途徑，為中藥復方配伍科學性提供了實驗證明。

3.1 對生物體內生物代謝途徑的影響

中藥復方制劑進入生物體內，其藥效物質將影響生物各類物質的代謝水平，代謝組學通過研究和比較這些代謝物的變化情況，篩選出具有指導意義的顯著變化代謝物（差異代謝物），是揭示中藥復方制劑作用機制的前提，為研究中藥復方制劑的關鍵藥效成分提供了實驗依據，為研究中藥質量標志物（quality marker，Q-Marker）[4]的篩選提供參考。

代謝組學通過分析獲得的差異代謝物富集相關代謝途徑，為揭示中藥復方制劑作用機制提供了新方法。Cui 等[22]使用代謝組學方法研究芪桂銀方對感染碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌小鼠的代謝變化，以小鼠血液作為樣本研究對象，發現芪桂銀方可以顯著逆轉小鼠體內由于感染碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌而發生異常表達的代謝物，主要包括乳酸D1、10S-EpOME、苯丙氨酸等，揭示了芪桂銀方可通過苯丙氨酸代謝、維生素K1 表達、DL-乳酸表達等代謝途徑逆轉小鼠異常代謝、調節腸道菌群紊亂的作用。Li 等[23]采用非靶向代謝組學研究對比柴胡桂枝干姜湯與匹維溴銨治療腸易激綜合征的療效，證明柴胡桂枝干姜湯對血漿代謝的影響大于匹維溴銨，其治療結果顯示患者血漿中L-肉堿和酰基肉堿水平升高，患者體內肉堿介導的脂質代謝顯著增強，研究還預測柴胡桂枝干姜湯作用于腸易激綜合征時最有效活性成分可能是黃芩苷，為柴胡桂枝干姜湯后續活性物質基礎和作用機制研究提供了方向。Chen 等[24]通過液質聯用技術檢測大鼠血清的全局代謝組學圖譜，分析得到了特定的血清代謝產物和相應的代謝途徑，闡述了人參附子對中79 種化合物通過提高細胞色素P450 家族2 亞家族D 成員6、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2 的表達和降低環氧化物水解酶2、單胺氧化酶B 靶蛋白的表達，直接調節下游特異性血清代謝產物，在心力衰竭的治療中發揮關鍵作用。

經典名方是我國中醫藥精華，具有歷史悠久、療效佳等特點，桃紅四物湯是傳統中醫經典名方之一，已被收錄在中華人民共和國國家醫藥產品管理局和國家中醫藥管理局發布的《古方目錄（第一批）》中。Tao 等[25]通過非靶向超高效液相色譜-串聯質譜法對冠心病患者的血清代謝譜進行分析，研究證實桃紅四物湯可通過上調脂肪酸代謝，下調葡萄糖代謝、花生四烯酸代謝和甘油磷脂代謝及調節氨基酸代謝實現其活血化瘀、調脂等藥效。He 等[26]基于超高效液相色譜-質譜聯用技術，以血虛血瘀證大鼠為研究模型，在其血漿代謝產物中尋找和篩選桃紅四物湯治療血虛血瘀證的潛在作用代謝途徑，共篩選出23 種潛在的差異代謝物，證明桃紅四物湯主要通過干預氨基酸代謝、牛磺酸和低牛磺酸代謝等8條代謝途徑改善血虛血瘀證。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，是治療“痰濕證”的基礎方，被譽為“天下理氣第一方”。Chen 等[27]采用液質聯用代謝組學技術研究二陳湯對血脂異常痰濕內阻征小鼠的影響，由代謝譜分析獲得64 種差異代謝物，富集后獲得34 種差異代謝途徑，其中三羧酸循環和色氨酸、絲氨酸、血清谷氨酰胺、嘧啶及丙酮酸的代謝途徑是二陳湯在血脂異常痰濕內阻征治療過程中降低小鼠體內氧化應激水平的最相關代謝途徑。Gu 等[28]通過超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用與血漿非靶向代謝組學分析相結合，闡明了高尿酸癥導致大鼠體內嘌呤、脂質和氨基酸等代謝紊亂，而二妙丸可能通過苯丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝和色氨酸代謝等代謝途徑對高尿酸癥大鼠產生治療作用，同時該研究首次建立了能同時定量高尿酸癥大鼠體內9 種嘌呤代謝產物的血漿靶向代謝組學方法，為后續的靶向代謝研究提供了新啟發。

3.2 闡釋中藥復方制劑配伍內涵

“藥有個性之特長，方有合群之妙用”，中藥復方配伍具有目的性、動態性、環境適應性等特點[29]，體現了中醫辨證施治。中藥復方配伍的科學內涵解釋一直是中醫藥研究領域的重要問題，研究者運用代謝組學等方法對中藥復方的各藥材間協同作用進行研究，進一步發現復方中某一味或少數幾味藥材在復方中發揮的作用，一定程度揭示了中藥復方配伍原理，有望進一步全面評價中藥復方配伍科學性。

Liu 等[14]根據“功效組”策略將“逍遙散”拆方為“健脾組”和“疏肝組”，通過腎臟代謝組學聯合腸道微生物群分析發現逍遙散可通過調節腎組織中精氨酸、牛磺酸和低牛磺酸及谷氨酸和谷氨酰胺代謝等代謝途徑發揮其抗抑郁和調節腸道微生物群穩定的作用，而疏肝組和健脾組分別調節4 和5 種差異代謝產物，表明2 個功效組協同表現出抗抑郁作用，驗證了“疏肝組”“健脾組”中藥材配伍的合理性、有效性。Chen 等[30]使用代謝組學和血清藥物化學結合，揭示了柴胡-白芍藥對可通過提高大鼠體內苯甲酸和柴胡皂苷元F 的濃度以影響D-氨基酸氧化酶和順烏頭酸脫羧酶的活性，從而發揮其抗抑郁作用。該研究采用代謝組學和血清藥物化學結合的這種方法被稱為“中藥組學”，可以有效發現中藥入血成分，探索中醫證候生物標志物和藥效機制，為進一步闡明中藥配伍機制提供可靠的方法。

代謝組學可通過“藥物-差異代謝物-代謝途徑”進一步探索中藥復方的作用機制，Hu 等[31]在對補中益氣湯調脾氣虛的療效進行評價和活性成分篩選中，創造性提出了基于“內源性-靶點-外源性”關聯網絡的代謝組學、網絡藥理學和血清藥理學相結合的策略。整體代謝組學契合中醫理論多系統、多靶點的整體觀，是研究中醫科學的最佳方法之一。《傷寒論》中記載：“病者氣血俱見于面，病已血先見”，機體血液變化與病情的發生和恢復密切相關，對機體進行代謝變化檢測有利于對病情診斷和藥效評價。通過分析和驗證疾病的特定早期生物標志物，可以更好地了解病理過程和物質代謝途徑，以確定中藥復方制劑的Q-Marker 和作用機制。與傳統的診斷方法相比，即使是微小的代謝物變化也有助于更敏感地發現早期病理變化。代謝組學在中藥復方作用機制研究中的應用見表1。

表1 代謝組學在中藥復方制劑研究中的應用Table 1 Application of metabolomics in study of traditional Chinese medicine compound preparations

4 代謝組學的發展

代謝組學研究可以有效地表示藥物進入生物體，機體受擾動后其內源性代謝物水平的動態變化情況，以確定該藥物治療特定疾病過程中作用的機體代謝途徑，但單一代謝組學只能定性、定量地從化合物到代謝途徑對中藥的作用機制進行闡述，無法很好回答關于中藥復方中與藥效直接關聯的指標性化合物在對機體的代謝調節過程中起何作用，及中藥復方除了對機體代謝影響外，還對哪些生理過程產生影響等問題。為了更好地闡明上述問題，研究過程中需要多組學結合研究。腸道微生物與機體代謝密切相關，而中藥制劑普遍為口服，這使消化道成為機體代謝中藥的主要途徑[50]，將腸道微生物組學與代謝組學聯合應用，或許更能厘清中藥復方制劑在生物體內的變化及其作用后的機體代謝變化，He 等[26]通過代謝組學研究發現桃紅四物湯治療氣滯血瘀證的23 種差異代謝物后，聯合腸道微生物群研究，指出經桃紅四物湯干預后，大鼠腸道微生物有益菌豐度增加，致病菌豐度減少。腸道微生物群與差異代謝產物的相關性分析表明，二者通過相互調節影響大鼠血液系統，改善血虛血瘀證，進一步解釋了桃紅四物湯作用機制。Wang 等[43]對四妙丸在治療類風濕性關節炎過程中的作用代謝途徑進行研究，發現四妙丸主要通過影響大鼠機體花生四烯酸代謝和色氨酸代謝來調整其體內代謝物質水平，又通過網絡藥理學、蛋白質組學和代謝組學多組學結合分析，最終確定了四妙丸通過炎癥途徑發揮治療作用，黃柏堿是其藥效物質之一。多組學技術彌補了單一代謝組學的部分局限，近年來，計算機技術的引入為代謝組學研究提供了啟示，如網絡藥理學、分子對接技術等方法，通過“理論預測-試驗驗證”相印證，為更全面的揭示中藥“辨證論治”的核心過程提供科學依據。如網絡藥理學常用于建立“藥物-靶點-疾病”網絡，并結合系統生物學等方法以研究中藥作用機制[51]，為代謝組學研究差異代謝物和顯著代謝途徑提供理論預測，而代謝組學的結合則為其提供了實驗驗證。代謝組學聯合多方法研究在中藥復方制劑研究中的情況見表2。

表2 代謝組學聯合多方法研究在中藥復方制劑研究中的情況Table 2 Metabolomics combined with multi-method study in study of traditional Chinese medicine compound preparations

5 代謝組學面臨的挑戰

代謝組學已經廣泛運用于中醫藥研究并取得了諸多進展，進一步揭示了中藥和中成藥的Q-Marker及作用機制，還為中醫“辨證施治”思想提供了現代醫學角度的理解啟發，但仍面臨一些挑戰。

5.1 多數代謝分析結果缺乏實驗驗證

代謝組學研究基于數據庫開展研究，目前常用的數據庫有KEGG、人類代謝組數據庫等，由于各數據庫收錄容量和范圍、各實驗室對數據庫的選擇等原因，可能導致研究過程中因為無法完全篩選出藥物作用的全部生物標志物，使得研究結果出現局限甚至重要代謝途徑遺漏問題；數據的篩選標準亟待優化。在對代謝數據進行PCA、偏最小二乘判別分析或正交偏最小二乘判別分析等分析中，關鍵變量篩選標準的科學性還有待考察，如VIP 值、樣本間代謝物濃度的差異倍數、代謝物在對比的2 組中是否存在顯著差異的表達量，很多研究采用VIP＞1、P＜0.05、差異倍數＞1[35-36]結合進行分析。在實踐中，有時會根據篩選出的差異代謝物數量進行自主調整篩查標準，如Liang 等[45]在對黃芪-郁金抗腫瘤轉移作用進行代謝組學研究時，血清差異脂質代謝物篩選過程選用的標準為P＜0.05、差異倍數≥1.2或≤0.83，但這些限定范圍還缺乏一定文獻支撐。

5.2 代謝分析結果不可回溯

中藥成分復雜，且不同中藥材間存在許多交叉有效成分，代謝組學研究雖然可以揭示中藥復方在治療特定疾病過程中的差異代謝物和其作用的代謝途徑，但其篩選出的差異代謝物無法具體回溯到中藥復方某一個或少數幾味中藥材中。有研究者通過“功效組”研究策略解決上述問題，將中藥復方拆解為幾個中藥材組合作為多個藥效組進行研究[38]，“拆方”思路或許為更好地將代謝組學研究運用在對中藥復方中某一味或幾味中藥材的物質基礎和作用途徑研究提供啟示。

5.3 研究結果存在“萬能途徑”現象

代謝組學從代謝途徑上表征藥物作用后的差異代謝物和其作用的一些特定代謝途徑，但由于已知的代謝途徑及其研究仍有限，現有研究中基于代謝組學的中醫藥研究結果通常指向幾個普遍的代謝途徑，如能量代謝[34,37]、牛磺酸和低牛磺酸代謝[14,26,34,42]等，且由表1 可見大部分中藥復方制劑均作用了患病動物的各類氨基酸代謝，難以更深層次闡釋藥物的作用機制，譬如藥物如何影響生物體細胞中mRNA 轉錄、基因表達等更微觀層次。

5.4 差異代謝物存在部分缺失的可能

代謝組學研究通常基于單分析技術展開，但單個分析技術最多只能表征幾百種代謝物，低覆蓋率較低，同時非靶向代謝組學中常見代謝物鑒定的不確定性使得非靶向代謝組學面臨檢測結果是否可靠和所得差異代謝物數量是否足夠的問題[52-53]，而靶向代謝組學強調特定代謝途徑或代謝產物，無法全面覆蓋整個代謝網絡。可能導致遺漏重要的代謝途徑或產物，限制了對整體代謝調控的理解。值得注意的是，靶向代謝組學用的生物樣本的選擇和處理過程可能會產生一些變異性和誤差，從而導致所關注的代謝物流失，影響研究結果。靶向代謝研究主要關注代謝物的變化和代謝途徑的調控，缺乏對代謝物功能和代謝途徑的深入研究，此外，某些樣本（如靶向病灶樣本）的獲取可能具有一定的困難，限制了靶向代謝研究的范圍和可行性。因此，將代謝組學結果與生物學功能和疾病機制相結合仍然充滿挑戰。

5.5 其他

由于動物活體的代謝本身就保持動態變化，實驗過程中動物的飼養環境、飼養過程、飼料的飼喂量和種類、實驗過程的操作方法等均有可能對動物產生刺激而導致其體內代謝水平發生明顯波動，研究所用動物類別及其性別也可能對研究結果產生影響。在代謝組學濕法實驗階段，應當盡量保證飼養條件一致，嚴格遵照《實驗動物管理條例》等規定科學飼養實驗動物，以避免非用藥因素導致的顯著動物代謝變化。

6 結語與展望

代謝組學研究在中醫藥領域研究方興未艾，但仍面臨一些挑戰，可以通過以下方式完善研究方案。（1）整合和更新眾多代謝研究數據庫，形成更完備的數據庫基礎，避免研究中重要代謝物和代謝途徑的遺失；（2）合理引入更多的系統生物學方法或技術，完成多組學、多方法、多技術整合應用，擴大代謝物鑒定覆蓋面，深度挖掘中藥復方制劑中復雜的衍生物和研究對象代謝物間的關系，深入探究代謝物生物功能，從而達到理論預測與試驗驗證相互印證的目的[54]；（3）基于中藥復方制劑配伍的多樣性和復雜性，合理運用“中藥組學”和“功效組”等研究策略，將中藥復方“拆方分組”，揭示與某一條代謝途徑直接相關的藥材，溯本清源；（4）開展非靶向與靶向代謝組學結合研究，既可以更大程度理解機體受擾動后的整體代謝變化，還可以將變化顯著的差異代謝物進行靶向代謝研究，關注其變化和對特定代謝途徑的調控影響，避免研究中出現偏頗和遺漏。

代謝組學研究藥物作用于機體后、生物體內發生的代謝變化，從而實現對藥物作用機制的追蹤。可以通過簡便獲取生物流體樣品的方式，評估整體代謝譜，發現和區分病變與非病變組織[55]，回答了“中藥進入生物體內后，如何影響和調控機體代謝物水平”的問題，使中藥“整體調控”的認知和研究走向更精微的水平，為揭開中藥內涵的神秘本質提供新的思路和研究工具。中藥研究與代謝組學相結合，有望在中藥質量評價、中藥藥效研究、中藥復方配伍內涵和作用機制闡釋及推進中藥復方制劑臨床運用等方面取得重要進展。代謝組學自興起的十余年內發展如火如荼，成為研究者研究藥物作用機制的熱點工具，在利用代謝組學進行研究的同時，還存在實驗驗證不足、研究質量良莠不齊、范圍覆蓋不全等問題，亟須修訂科學規范、嚴謹統一的代謝組學研究規程和評價標準，出臺相關技術指導原則，以促進該學科的健康發展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突