肺癌組織中ERO1L、TNFRSF4的表達與患者免疫功能、炎癥反應因子及預后的關系

戚新新 苗麗君 李曉萍 黃鳳祥

肺部癌變的發生主要由于吸煙和大氣污染,肺癌是全世界高發生率和高死亡率的癌癥[1]。按照組織病理學特征,將其分為小細胞癌癥和非小細胞癌癥[2]。通過手術切除癌變組織是肺癌的首選治療方案,但術后會出現復發和轉移,患者免疫功能也會有所降低,預后達不到理想要求[3]。內質網氧化物蛋白(endoplasmic reticulum oxidoreductin-1-like protein,ERO1L)是一種定位于內質網管腔的糖蛋白,具有氧化還原酶的作用[4-5]。在人類惡性腫瘤中,ERO1L大多都會過度表達,其過度表達與惡性腫瘤的生長、增殖和轉移有關[6]。同時,ERO1L的表達水平與炎癥相關因子IL-10和TGF-β的表達有關[7]。腫瘤壞死因子受體4(TNF receptor super-family member 4,TNFRSF4)是腫瘤壞死因子超家族的一員,作為免疫檢查點可以調節免疫共刺激通路[8]。TNFRSF4與細胞存活和增強細胞毒性有關,TNFRSF4上調表達可以增強T細胞增殖以及殺傷細胞的能力[9]。因此,本研究通過檢測肺癌組織中ERO1L、TNFRSF4 mRNA和蛋白表達水平,以及肺癌患者免疫功能指標和炎癥因子水平,探討ERO1L、TNFRSF4與免疫功能、炎癥因子及患者預后的關系。

資料與方法

一、研究對象

選取2018年7月～2020年7月期間在本院住院手術的108例肺癌患者,年齡50～70歲,平均年齡(60.15±8.95)歲;男59例,女49例,收集手術中切除的肺癌組織及其癌旁組織。

納入標準:①符合肺癌診斷標準[10],并經病理確診。②一般臨床資料及隨訪資料完整。③無其他惡性腫瘤或免疫疾病。

排除標準:①合并其它臟器衰竭。②已進行放療、化療等治療。③有靶向藥治療經歷。納入患者均簽署知情同意書,本研究已被醫院倫理委員會批準(20170716553)。

二、研究方法

1. qRT-PCR法檢測肺癌組織與癌旁組織中ERO1L、TNFRSF4 mRNA表達水平

使用Trizol試劑盒(貨號:SWFZ028,上海信帆生物科技有限公司)提取肺癌組織以及癌旁組織的總RNA,反轉錄試劑盒(貨號:F0202-100T,北京蘭博利德商貿有限公司)將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板采用qRT-PCR法檢測,使用2-ΔΔCt方法計算ERO1L和TNFRSF4的mRNA相對表達量,內參基因為β-actin,引物由擎科生物有限公司合成,引物序列(見表1)。

表1 qRT-PCR所需引物名稱及序列

2. 免疫組化法檢測肺癌組織中ERO1L、TNFRSF4蛋白表達水平

參考免疫組織化學染色試劑盒(貨號:E-IR-R217,武漢伊萊瑞特生物科技股份公司)說明書,檢測肺癌組織和癌旁組織中ERO1L、TNFRSF4蛋白表達水平,ERO1L、TNFRSF4抗體(貨號:ab177156、ab229021)均購自Abcam公司。按照陽性細胞百分比和著色強度評分:陽性細胞百分比<5%計0分,5%≤陽性細胞百分比<25%計1分,25%≤陽性細胞百分比<50%計2分,50%≤陽性細胞百分比<75%計3分,陽性細胞百分比≥75%計4分;陽性著色強度:無色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分。染色指數=陽性細胞百分比×著色強度,根據染色指數分:0分≤低表達≤4分,5分≤高表達≤12分。

3. 免疫功能指標和炎癥因子檢測

采集肺癌患者手術前空腹靜脈血8 mL,使用流式細胞檢測儀檢測免疫T淋巴細胞亞群,包括CD3+,CD4+,CD4+/CD8+等免疫功能指標。使用IL-1β ELISA試劑盒(貨號:XY0323A,上海煊雅生物科技有限公司)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號:IB-E10049,江西艾博因生物科技有限公司)、TNF-α ELISA試劑盒(貨號:B3400,上海名勁生物科技有限公司)檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

二、隨訪

主要采用電話聯系和患者門診復查的方式,對本院進行手術治療的肺癌患者進行為期3年的跟蹤隨訪,本研究的隨訪率為100%,生存時間為術后日期至患者死亡日期或者最終隨訪截止時間(2023年7月)。

三、統計學分析

結 果

一、肺癌組織與癌旁組織中ERO1L、TNFRSF4 mRNA表達水平比較

肺癌組織中ERO1L mRNA(1.29±0.24)表達水平顯著高于癌旁組織(1.06±0.15),TNFRSF4 mRNA(0.85±0.13)表達水平顯著低于癌旁組織(1.08±0.16)(P<0.05)(見表2)。

表2 肺癌組織與癌旁組織中ERO1L、TNFRSF4 mRNA表達情況

二、肺癌組織與癌旁組織中ERO1L、TNFRSF4蛋白表達情況

ERO1L蛋白在肺癌組織中的高表達率為53.70%,顯著高于癌旁組織(37.04%),差異具有統計學意義(P<0.05);TNFRSF4蛋白在肺癌組織的高表達率為54.63%,顯著低于癌旁組織(68.52%),差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖1,表3)。

圖1 免疫組織化學法檢測肺癌組織和癌旁組織中ERO1L、TNFRSF4蛋白的表達情況(×100)

表3 ERO1L、TNFRSF4蛋白在肺癌組織和癌旁組織中表達水平比較[n(%)]

三、肺癌組織中不同ERO1L、TNFRSF4表達水平與患者臨床特征的關系

ERO1L、TNFRSF4的表達水平與肺癌患者的年齡、性別無關(P>0.05),而與患者的腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)(見表4)。

表4 肺癌組織中不同ERO1L、TNFRSF4表達水平與患者臨床特征的關系[n(%)]

四、肺癌組織中不同ERO1L、TNFRSF4表達水平的患者免疫功能和炎癥因子比較

與ERO1L高表達組相比,ERO1L低表達組患者免疫功能指標CD3+、CD4+顯著升高,CD4+/CD8+顯著降低,炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α顯著降低(P<0.05);與TNFRSF4高表達組相比,TNFRSF4低表達組患者免疫功能指標CD3+、CD4+顯著降低,CD4+/CD8+顯著升高,炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α顯著升高(P<0.05)(見表5)。

表5 不同ERO1L、TNFRSF4表達水平的患者免疫功能和炎癥因子指標比較

五、肺癌組織中ERO1L、TNFRSF4表達水平與患者預后的關系

肺癌組織中ERO1L高表達組患者3年累積生存率為37.93%(22/58),低于ERO1L低表達組52.00%(26/50)(Log rank χ2=6.100,P=0.014);肺癌組織中TNFRSF4高表達組患者3年累積生存率為54.24%(32/59),高于TNFRSF4低表達組32.65%(16/49)(Log rank χ2=11.296,P=0.001)(如圖2,3)。

圖2 ERO1L表達水平與肺癌患者3年累積生存率的關系

圖3 TNFRSF4表達水平和肺癌患者3年累積生存率的關系

六、影響肺癌患者生存率的相關因素分析

以患者預后(死亡=1,生存=0)為因變量,以腫瘤大小(≥3cm=1,<3cm=0)、分化程度(低中分化=1,高分化=0)、TNM分期(Ⅲ-Ⅳ期=1,Ⅰ-Ⅱ期=0)、淋巴結轉移(是=1,否=0)以及ERO1L(高表達=1,低表達=0)和TNFRSF4(高表達=1,低表達=0)為自變量,對其進行單因素Logistic回歸分析和多因素Cox回歸分析。

單因素分析顯示:肺癌患者的生存率與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、ERO1L和TNFRSF4表達水平有關(P<0.05),將上述因素進行多因素分析,發現肺癌組織的低分化、淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期、ERO1L高表達、TNFRSF4低表達是影響患者生存率的危險因素(見表6)。

表6 影響肺癌患者生存率的相關因素分析

討 論

近年來,肺癌的死亡率居高不下,嚴重威脅到了人類的生命安全[11],肺癌的發生通常伴隨免疫功能指標和炎癥因子水平的改變,深入研究肺癌的發病機制,對肺癌患者的早期診斷及治療方案的制定具有重要意義[12]。

ERO1L是一種內質網上的氧化酶,其生物學功能是調節缺氧誘導的氧化蛋白質折疊[13]。研究表明,ERO1L的上調表達與免疫抑制細胞的浸潤密切相關,在腫瘤免疫抑制、腫瘤血管生成以及腫瘤的轉移過程中發揮重要作用[14]。本研究檢測肺癌患者癌組織中ERO1L的表達水平,結果發現,肺癌組織中ERO1L mRNA表達水平顯著高于癌旁組織;免疫組織化學法觀察發現,ERO1L蛋白在肺癌組織中的高表達率顯著高于癌旁組織,提示肺癌組織中ERO1L上調表達。通過檢測肺癌患者免疫功能指標和炎癥因子水平發現,肺癌組織中ERO1L蛋白高表達組患者CD3+,CD4+顯著低于低表達組,IL-1β、IL-6、TNF-α顯著高于低表達組。提示ERO1L表達可能與肺癌患者的免疫功能和炎癥反應因子有關。另有研究顯示,ERO1L還可以促進肝細胞癌的轉移和血管生成,與肝細胞癌患者的生存率和預后不良具有顯著相關性[15],本研究采用Kaplan-Meier法分析ERO1L蛋白表達水平與肺癌患者預后的關系,發現ERO1L高表達組患者3年累積生存率低于ERO1L低表達組,提示ERO1L上調不利于肺癌患者預后。

TNFRSF4又稱OX40,其已知配體為TNFSF4,TNFRSF4與TNFSF4相互作用可以成功抵御乙肝病毒,并增強免疫強度[16]。本研究檢測肺癌患者癌組織和癌旁組織中TNFRSF4表達水平,結果發現,肺癌組織中TNFRSF4 mRNA表達水平顯著低于癌旁組織,免疫組織化學法檢測發現,肺癌組織中TNFRSF4蛋白高表達率低于癌旁組織,提示TNFRSF4表達可能與肺癌的發生有關系。TNFRSF4可以穩定維持腫瘤微環境的免疫調節特性,使得腫瘤患者預后良好[17]。TNFRSF4也作為刺激分子信號,有效促進T細胞的活化、增殖以及分化[18],在人類細胞免疫中發揮重要作用[19]。本研究中,肺癌組織TNFRSF4蛋白高表達組患者的免疫功能指標CD3+、CD4+高于低表達組,炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著低于低表達組,提示TNFRSF4上調表達可提高肺癌患者免疫功能,抑制炎癥反應因子表達。采用Kaplan-Meier法分析TNFRSF4蛋白表達水平與肺癌患者預后的關系,發現TNFRSF4高表達組患者3年累積生存率高于TNFRSF4低表達組,提示TNFRSF4上調有利于肺癌患者預后。

通過Cox多因素分析發現,肺癌組織的低分化、淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期、ERO1L高表達、TNFRSF4低表達是影響患者生存率的危險因素。

綜上所述,肺癌組織中ERO1L上調表達,TNFRSF4下調表達,ERO1L和TNFRSF4表達水平與肺癌患者的免疫功能和炎癥反應因子水平存在一定的關系,且ERO1L和TNFRSF4的表達水平與肺癌患者的生存率相關,檢測肺癌組織中ERO1L和TNFRSF4表達水平,對改善患者預后生存情況具有重要價值。本研究的不足之處在于納入的樣本量較少、僅收集同一醫院的病例,后續會通過多中心研究,擴大樣本量,深入探究并驗證ERO1L、TNFRSF4與肺癌患者免疫功能、炎癥反應及預后的關系。