飼料中谷氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸鈉對鱖攝食、生長、胃腸及肝功能的影響

方攬月 許耀升 劉天驥 李洪琴 劉 匆 李 虹 翟旭亮 薛 洋沈子偉 陳擁軍 羅 莉

(1. 西南大學水產學院, 西南大學淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 重慶 400716; 2. 四川新希望六和科技創新有限公司, 成都 610000; 3. 重慶市水產技術推廣總站, 重慶 400400; 4. 中國水產科學研究院長江水產研究所西南漁業研究中心, 重慶 400400)

谷氨酸(Glutamate, Glu)和谷氨酰胺(Glutamine,Gln)是水產飼料和魚體中含量豐富的氨基酸[1], 在蛋白質代謝過程中占重要地位, 參與動物機體中的許多重要化學反應[2]。谷氨酸鈉(Monosodium Glutamate, MSG)由Glu (78%)、鈉和水(22%)組成, 能增加飼料鮮味, 有誘食效果。對哺乳動物的研究發現,Glu和Gln是功能性氨基酸[3], 可以調節代謝途徑和細胞信號通路[4], 提高抗氧化和免疫能力[5], 改善腸道生長發育和健康[6]; MSG可以提高日增重和飼料效率, 增加腸道絨毛高度和抗氧化能力[7]。目前, 國外針對部分養殖魚類飼料中Glu、Gln和MSG的需求已開展研究, 如Glu在鯉(Cyprinus carpio)飼料中需求量為7.11%—8.20%[8]、Gln在半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevisGünther)幼魚飼料中的需求量為0.63%[9]、MSG在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)飼料中的適宜添加量為0.5%[10], 這3種添加劑在鱖飼料中的應用效果均未有報道。

鱖(Siniperca chuatsi)是我國特有的淡水名貴魚類, 俗稱“桂花魚”, 屬于鱸形目、鱖亞科、鱖屬。其肉質細嫩, 無肌間刺, 膽固醇低, 營養價值高, 深受國內外消費者青睞, 市場需求大。目前, 我國鱖產量已增至37.4萬噸, 產值超200億元, 是最具發展潛力的養殖品種之一[11]。然而, 隨著配合飼料替代幼雜魚行動的推進, 鱖馴化轉食及飼喂過程中仍存在飼料適口性、胃腸和肝功能欠佳的問題[12], 飼料配方有待優化。基于此, 本實驗在鱖飼料中添加不同含量的Glu、Gln和MSG, 探討其對鱖生長性能,胃腸消化吸收和屏障功能, 以及肝功能等的影響差異, 為鱖飼料配方的優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗所需鱖購于重慶市潼南區名優魚養殖基地, Glu、Gln和MSG由四川新希望畜牧科技有限公司提供。以鱖基礎飼料為對照組(實測Glu含量為7.47%, 檢驗方法為GB/T 18246-2019酸水解法; 采用Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高效液相色譜進行色譜分離, 實測游離Gln含量為0.03%, LCMS法檢測), 在其基礎上分別添加兩個濃度梯度(0.2%和0.4%)的Glu、Gln和MSG, 組成1個對照組和6個試驗處理組: CON、Glu-0.2、Glu-0.4、Gln-0.2、Gln-0.4、MSG-0.2和MSG-0.4。飼料配方及營養水平見表1。飼料原料在粉碎機(四川簡陽棉豐農業機械制造廠3Z-110F型)粉碎后過40目篩, 混勻機(山東慧晨機械有限公司HC-50型)混合后, 經膨化制粒機(河北邢臺裕工科技開發有限公司DGP40-C型)制成3 mm的浮性飼料(膨化加工溫度為150℃),經過自然風干后, -20℃冰箱保存備用。

表1 實驗飼料組成及營養水平(風干基礎)Tab. 1 Composition and nutrient level of test diet (air-dry basis; %)

1.2 飼養管理

實驗用鱖基礎飼料(CON)馴化15d后, 隨機選擇健康、規格整齊, 初始體質量(17.60±0.53) g的鱖分為7組, 每組3個重復, 每個重復15尾鱖, 飼養于農業農村部長江中上游漁業資源環境科學觀測北碚實驗站玻璃養殖缸中, 缸體規格: 長90 cm, 寬30 cm,高60 cm。每日投喂2次(8:30和18:30), 投飼量為魚體重的3%—5%。養殖水源為曝氣自來水, 在養殖期間, 每天早晚各換水80%, 水溫為23—29℃, pH為6.7—7.2, 溶解氧＞7.0 mg/L, 氨氮＜0.5 mg/L, 亞硝酸鹽＜0.05 mg/L, 硫 化 物 濃 度＜0.05 mg/L, 光 周 期(L∶D)為12∶12。

1.3 樣品的制備與分析

樣品采集在鱖養殖試驗結束后饑餓24h,每組每個重復隨機選取6尾鱖用適量MS-222麻醉,稱重用以計算生長性能指標, 計算公式參照徐杭忠等[13]的方法。用肝素鈉處理過的1 mL一次性無菌注射器在尾靜脈處取血, 4500 r/min離心10min制備血漿后, 轉入-80℃冰箱內保存, 用于血液指標測定。后將鱖于冰上解剖, 分離肝臟, 在肝中部同一位置取1 cm3大小的組織放入裝有多聚甲醛的離心管中, 分離胃、腸, 液氮速凍后, 轉入-80℃冰箱備用。每組每個重復隨機選取4尾鱖在無菌條件下取腸道, 液氮速凍后, 轉入-80℃冰箱保存, 用于腸道菌群的高通量分析。

常規營養成分的測定水分采用105℃烘干恒重法測定; 粗蛋白質含量采用凱式定氮法測定;粗脂肪含量采用索式抽提法測定; 粗灰分含量采用550℃馬弗爐煅燒法測定。

血漿轉氨酶及抗氧化指標測定谷草轉氨酶(AST)活性(比色法)、谷丙轉氨酶(ALT)活性(賴氏法)、總抗氧化能力(T-AOC)活性(比色法)和丙二醛(MDA)含量(TBA法), 均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定, 具體測定方法參照試劑盒說明書進行。

肝臟HE染色切片由重慶博諾恒生物科技有限公司代制。

消化酶指標測定胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定。

腸黏膜通透性指標測定血漿D-乳酸(Dlactate) 、內毒素 (ET)含量、二胺氧化酶(DAO)活性均采用上海優選生物科技有限公司的Elisa試劑盒測定。

腸道微生物組成由上海派諾森生物科技有限公司代測。

1.4 數據處理

實驗結果用SPSS 22.0對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 用Duncan氏多重比較分析組間差異顯著性程度, 當P＜0.05時認為差異顯著。結果數據用平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結果

2.1 Glu、Gln和MSG對鱖生長性能及飼料利用的影響

在飼料中添加Glu、Gln和MSG后, 增重率(WGR)指標, Glu-0.2組較CON組顯著升高了27.01% (P＜0.05),Gln-0.2組較CON組顯著升高了21.08% (P＜0.05),MSG-0.4組較CON組顯著升高了23.53% (P＜0.05),Glu-0.4、Gln-0.4、MSG-0.2較CON組差異不顯著(P＞0.05); 尾均攝食量(FI)指標各實驗組較CON組,分別升高了7.27%、16.53%、11.35%、8.71%、19.98%和24.41% (P＜0.05); 飼 料 轉 化 率(FER)指 標, Glu-0.2和Gln-0.2組較CON組差異顯著, 分別升高了11.54%和9.62% (P＜0.05) , 其他組較CON組均無顯著差異(P＞0.05; 表2)。

2.2 Glu、Gln和MSG對鱖胃、腸消化吸收能力的影響

在飼料中添加Glu、Gln和MSG后, 各實驗組鱖胃蛋白酶活性較CON組均顯著上升(P＜0.05); Glu組和Gln-0.2組的胃H+-K+-ATP酶活性較CON組顯著提高, 分別提高了46.88%、50.08%和24.48% (P＜0.05)。腸道胰蛋白酶指標, Glu-0.2組較CON組顯著上升了39.35% (P＜0.05)。腸道淀粉酶活性, 各實驗組均顯著高于CON組(P＜0.05); Na+-K+-ATP酶活性, Glu組、Gln-0.2、MSG組較CON組顯著提高了24.77%、12.84%、10.09%、11.92%和20.18% (P＜0.05; 表3)。

表3 Glu、Gln和MSG對鱖胃、腸消化吸收能力的影響Tab. 3 Effects of Glu, Gln and MSG on gastrointestinal digestion and absorption of mandarin fish (U/mgprot)

2.3 Glu、Gln和MSG對鱖腸屏障功能的影響

在飼料中添加Glu、Gln和MSG后, 各實驗組鱖血漿ET、D-LA含量較CON組均顯著下降(P＜0.05);Glu組、Gln-0.2組、MSG組血漿DAO活性顯著低于對照組(P＜0.05; 表4)。

表4 Glu、Gln和MSG對鱖腸道屏障功能的影響Tab. 4 Effects of Glutamate family on intestinal barrier function of mandarin fish

2.4 Glu、Gln和MSG對鱖腸道微生物組成的影響

CON到MSG-0.4組共21個腸道微生物樣本, 測序覆蓋率均在95%以上, 測序結果可信度高。各組間的Chao1、Shannon和Simpson指數無顯著性差異(P＞0.05) , 但Gln組的Chao1、Shannon指數與CON組相比均有下降趨勢(表5)。物種組成方面, 門水平上優勢菌群均為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes) , Glu-0.2組的軟壁菌門(Tenericutes)豐度顯著高于CON組, 且為所有組中最高(P＜0.05); Glu和Gln組的梭桿菌門(Fusobacteria)豐度較CON組有降低趨勢, 而MSG組相反(P＞0.05; 圖1) 。屬水平Glu-0.2組的索氏鯨桿菌屬(Cetobacterium)豐度顯著高于CON組(P＜0.05; 圖2)。

圖1 鱖腸道菌群物種組成分布圖(門水平)Fig. 1 Species distribution map of mandarin fish intestinalis(phylum level)

圖2 鱖腸道菌群物種組成分布圖(屬水平)Fig. 2 Species distribution map of mandarin fish intestinalis(genus level)

表5 Glu、Gln和MSG對鱖腸道微生物組成的影響Tab. 5 Effects of Glutamate family on Microbiome of mandarin fish

2.5 Glu、Gln和MSG對鱖肝臟功能和組織結構的影響

血漿AST活性, Glu組與CON組差異不顯著(P＞0.05), Gln組和MSG組較CON組顯著升高(P＜0.05);血漿ALT活性, Glu組與CON組差異不顯著(P＞0.05),Gln組和MSG組較CON組顯著升高(P＜0.05; 圖3)。

圖3 Glu、Gln和MSG對鱖血漿轉氨酶的影響Fig. 3 Effects of Glu, Gln and MSG on mandarin fish plasma aminotransferase

對鱖肝臟組織的石蠟切片進行顯微觀察后發現, 與CON組相比, Glu、 MSG組鱖肝細胞變化不顯著, 排列相對更加緊密; Gln-0.2、Gln-0.4組鱖肝臟細胞腫脹、空泡化現象明顯增多(圖4)。

圖4 Glu、Gln和MSG對鱖肝臟組織結構的影響Fig. 4 Effects of Glu, Gln and MSG on the liver tissue structure of mandarin fish

2.6 Glu、Gln和MSG對鱖抗氧化能力的影響

血漿T-AOC, Glu組與CON組相比無顯著差異(P＞0.05), Gln組較CON組顯著下降(P＜0.05), MSG-0.4組較CON組顯著升高(P＜0.05); Glu組 、MSG組的血漿MDA較CON組均顯著降低, Gln組較CON組均顯著升高(P＜0.05; 圖5)。

圖5 Glu、Gln和MSG對鱖抗氧化能力的影響Fig. 5 Effects of Glu, Gln and MSG on antioxidant capacity of mandarin fish

3 討論

3.1 Glu、Gln和MSG對鱖攝食和生長性能的調控

Glu和Gln是魚類腸、肝、肌肉和腎臟的主要能量來源, 也是合成谷胱甘肽和 6-磷酸氨基葡萄糖的底物, 可以保護細胞免受氧化損傷, 改善腸道對營養物質的吸收能力, 有助于提高飼料轉化率[14]。前人研究表明, 建鯉飼料中Glu 含量8.34%時顯著提高其攝食量及增重率, 而較低含量(基礎飼料5.34%)則無顯著影響[8]。本實驗對照組飼料中Glu含量為7.47%, 其主要存在于蛋白質, 鮮味不明顯。本實驗添加的Glu為游離態, 具有鮮味, 可以增加魚飼料的風味和吸引力, 促進魚類攝食。

Gln雖無鮮味, 但可促進腸道黏膜細胞的生長和修復, 增強腸道消化酶活力, 提高魚類對飼料的消化吸收效率, 從而增加攝食量。在草魚(Ctenopharyngodon idella)飼料中添加0.3%—1.2%的Gln顯著提高其增重率和特定生長率, 顯著降低飼料系數[15]。在本研究中Gln添加組中僅0.2 組飼料轉化率提高, 其原因可能是因為飼料加工過程中的高溫導致Gln分解產生毒性。

MSG是Glu的鈉鹽形式, 因含有Na+, 具有較強的鮮味和誘食效果, 能夠直接刺激魚類的味覺增強魚類的攝食欲。MSG在水產動物飼料中的研究鮮見, 虹鱒飼料中的適宜添加量為0.5%[10]。本研究中MSG0.2%和0.4%兩個添加水平均促進攝食并提高增重, 但FER無顯著變化。

綜上, 飼料中添加Glu、Gln和MSG對鱖生長均具有促進作用, Glu和Gln適量添加(0.2%)可提高飼料利用率, 0.4%屬于過量添加; MSG主要起到誘食作用, 對飼料利用率影響不明顯, 最佳添加水平有待進一步研究。

3.2 Glu、Gln和MSG對鱖胃腸功能的改善

腸道是魚類消化吸收的主要場所, 也與魚體內各種免疫、應激和新陳代謝息息相關, 因此保護腸道屏障對魚體的生長和健康極為重要[16]。動物胃腸上皮黏膜中具有特定的Glu識別系統[17], 據報道攝入Glu可通過刺激迷走神經增強胃酸分泌[18,19]。已有研究證明Glu 和Gln均可提高草魚腸道消化酶活性[15,20], 而MSG對魚類消化酶是否有影響還未見研究。本實驗結果表明Glu、Gln可提高鱖胃的泌酸能力, Glu、Gln和MSG均可以提升鱖胃腸消化吸收酶活力。D-LA和ET由腸道細菌產生, DAO是腸黏膜絨毛上皮層內的高活性酶, 當腸黏膜屏障功能受損時, D-LA、ET和DAO會進入血液, 導致血內濃度升高。本實驗添加Glu、Gln和MSG后, 鱖血漿ET、D-LA含量和DAO活性均有所降低, 說明3種添加劑均可提高鱖腸道的屏障功能, 對腸道健康均有促進作用。綜合來看, Glu的胃腸促進作用最好。

已有研究表明, 在斷奶仔豬飼糧中添加Glu, 可以改善腸道菌群結構, 有利于將腸道中不可消化的多糖發酵成短鏈脂肪酸, 從而減少仔豬腹瀉的風險[21]。本實驗中Glu-0.2組屬水平上顯著增多的索氏鯨桿菌(Cetobacterium), 可產生多種氨基酸、合成B族維生素、通過代謝產物乙酸激活副交感神經系統, 從而促進魚類胰島素表達和糖利用能力, 在魚類營養中起著重要作用[22]。Glu-0.2組能夠增加腸道菌群的豐富度(Chao1), 提升潛在有益菌(Cetobacterium)豐度, 說明添加一定濃度的Glu可促進腸道內有益菌增殖, 優化鱖腸道菌群結構。Gln組Cetobacterium豐度下降且腸道菌群的Chao1、Shannon指數下降可能是因為飼料制作過程中高溫膨化導致的毒性作用影響了菌群的物種數量和分布均勻度。

3.3 Glu、Gln和MSG對鱖抗氧化能力的影響

Glu是合成谷胱甘肽(GSH)的底物, 谷胱甘肽有抗氧化性, 屬于機體抗氧化系統, 與T-AOC等指標密切相關, 其活性的高低直接反映著機體對于應代償能力和清除自由基(ROS)能力的強弱[23]。脂質過氧化反應的最終產物為MDA, 其濃度反映氧化應激誘導的機體細胞損傷程度[24]。Jiang等[25]對體外培養魚腸道細胞的研究表明, 細胞中的 GSH 濃度和抗氧化能力會隨著細胞外 Glu 水平的增加而增加, 而MDA含量和細胞蛋白羰基含量則相反, 其原因是適量的體外Glu補充顯著提高了腸細胞中Nrf2的表達水平, Glu通過調節抗氧化相關信號分子的表達, 起到增強魚體抗氧化能力的作用。本實驗結果說明Glu、MSG具有提高鱖機體抗氧化能力的作用, 這與Jiang等[26]在草魚飼料中添加Gln以及王一冰等[27]在清遠麻雞飼料中添加MSG的研究一致; 而Gln則使鱖的抗氧化能力下降, 這可能與高溫導致的Gln產生毒性作用有關。

3.4 Gln對鱖肝功能的負面影響

魚類肝臟是魚體內代謝和解毒的中心, 它具有多種生理和生化功能, 其對魚類生長代謝和健康非常重要。在正常狀態下魚類血中氨基轉移酶活性很低, 當肝臟組織受損或者功能減弱時, AST和ALT易進入血液中[28]。本實驗中Gln組鱖血漿AST和ALT指標顯著高于CON組, 說明添加Gln對肝臟造成了一定程度的損傷。從本實驗結果來看, Gln使肝功能變差, 可能是因為飼料制作過程中的高溫環境使Gln分解產生焦谷氨酸和氨[29]。焦谷氨酸被認為是一種具有潛在毒性的代謝產物, 過量堆積易導致氨基酸和蛋白質的氧化損傷, 其毒性受到暴露時間和濃度、生物體的種類和生理狀態等多種因素的影響[30]; 在一些硬骨魚體內, 部分氨在肝臟通過尿素循環排除, 而氨的積累會對魚體的肝臟和神經系統產生毒性影響, 影響肝臟功能和健康[31]。因此, 鱖飼料不建議添加Gln, 后續研究可以選擇使用Gln的最佳二肽替代物Ala-Gln[32], 其較Gln更為穩定, 不易降解產生氮, 機體內的肽鍵剪切二肽即可釋放Gln, 生物利用度更高。

4 結論

在本實驗條件下, Glu、Gln和MSG促進鱖攝食、生長、胃腸消化吸收功能和腸道物理屏障。Glu-0.2%、Gln-0.2%的促生長作用是攝食量和飼料轉化率共同增加的結果, MSG則主要表現為促進攝食效果顯著。Glu、MSG對鱖肝臟健康無明顯影響, Gln則會使鱖肝功能下降、抗氧化能力降低、腸道微生物失調。三種添加劑相比較, Glu-0.2%對鱖的營養效應最佳, 能增強腸道物理屏障, 提高胃酸分泌和胃腸消化吸收能力, 改善腸道菌群, 促進鱖生長和飼料轉化。