響應面法優(yōu)化枸杞發(fā)酵工藝

劉靜鳳，孔維波，陳思敏，劉春秀，付丹陽，梅青剛，姜立春*

（1.綿陽師范學院資源環(huán)境工程學院，四川綿陽 621000；2.綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川綿陽 621000）

0 引言

寧夏枸杞（LyciumbarbarumL.）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）落葉灌木［1-2］，由于其富含人體所需的32種微量元素和18種氨基酸［3］，以及枸杞多糖、甜菜堿、類胡蘿卜素等多種活性成分，具有抗氧化、抗疲勞、增強免疫力等功效［4-8］，有較高的藥用保健功能和營養(yǎng)價值，廣泛應用于泡酒、泡茶、煮粥［9-11］.

枸杞果酒是以枸杞為原料經發(fā)酵制成的含酒精的飲料，由于其具有較低的酒精度、濃郁的果香味并且還保留了枸杞原有的多糖、氨基酸和礦物質等天然活性成分，且符合當今酒類消費所倡導的以低酒精度取代高酒精度、果酒取代糧食酒的潮流，在酒種的發(fā)展中具有很大的潛力［12-13］.目前市售枸杞果酒大多采用干枸杞進行發(fā)酵，而對于新鮮枸杞果酒加工工藝優(yōu)化的報道相對較少.且常用感官評分作為評價指標優(yōu)化發(fā)酵工藝，對于酒香與口感評判具有較強的主觀性，缺乏生物活性物質含量作為客觀的品質指標來指導工藝優(yōu)化過程.

本試驗以寧夏新鮮枸杞為原料，以枸杞發(fā)酵后的酒精度和感官評分值為指標，在單因素試驗的基礎上結合響應面法優(yōu)化選取枸杞發(fā)酵工藝的最優(yōu)參數條件，使發(fā)酵液酒精度和感官評分值達到最佳水平，從而為枸杞發(fā)酵產品的研制與開發(fā)提供試驗依據與理論支持，對進一步改善枸杞果酒的酒體品質具有一定的借鑒價值.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞（杞利元寧夏枸杞店）、酵母菌（安琪酵母股份有限公司）、果膠酶（河南萬邦實業(yè)有限公司）、NaOH（天津市致遠化學試劑有限公司）、濃鹽酸溶液（天津市致遠化學試劑有限公司）.

1.2 儀器

SW-CJ-1FD 超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、MLS-3020 高壓蒸汽滅菌鍋（上海旦鼎國際貿易有限公司）、SC-3610低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）、LKTC-B1恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）.

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞發(fā)酵工藝 將枸杞剪碎，按照液料比利用蒸餾水浸提以制備枸杞混懸液，而后加入果膠酶并調節(jié)pH，進行高壓蒸汽滅菌后，再接種活化酵母菌液，進行恒溫發(fā)酵處理.發(fā)酵一段時間后進行過濾、高速離心，取發(fā)酵上清液進行指標檢測.

1.3.2 單因素試驗 在不改變其他發(fā)酵參數的前提下，依次選取不同發(fā)酵時間（3、5、7、9、11 d）、發(fā)酵溫度（27、29、31、33、35 ℃）、接種酵母質量分數（0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%）、液料比（10：1、15：1、20：1、25：1、30：1）和pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）進行單因素發(fā)酵試驗，以酒精度、感官評分為評價指標，確定各因素對枸杞發(fā)酵液酒精度、感官評分的影響.

1.3.3 酒精度的測定 參考國標《GB/T 15038—2006 葡萄酒、發(fā)酵液通用分析方法》的乙醇體積百分數的測定方法，為酒精測度法.

1.3.4 感官評定 離心分離后的枸杞發(fā)酵液，參照國標《GB/T 15038—2006 葡萄酒、發(fā)酵液通用分析方法》進行感官評定，感官評分標準見表1.

表1 發(fā)酵液感官評分標準Tab.1 The standard for sensory evalution of fermentation broth

1.3.5 響應面優(yōu)化試驗 基于單因素試驗結果，選取發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）以及接種酵母質量分數（C）為考察變量，-1、0、1分別代表變量的水平，并以酒精度（Y1）和感官評分（Y2）作為響應值，利用Design-Expert 13 軟件設計三因素三水平的響應面試驗，試驗設計因素和水平見表2.

表2 響應面試驗因素及水平Tab.2 Response surface test factors and levels

1.4 數據處理

使用Excle、Origin 2021 軟件進行繪圖和數據統(tǒng)計分析，Design-Expert 13 軟件進行響應面優(yōu)化分析.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發(fā)酵時間對枸杞發(fā)酵的影響 隨著發(fā)酵時間的延長，接種的酵母菌逐漸從有氧呼吸增殖過程轉化為無氧呼吸產生酒精，由圖1 可知，發(fā)酵時間為5 d 時，枸杞發(fā)酵液的酒精度及感官評分達到峰值，分別為2.2% vol 和68 分.當發(fā)酵時間低于5 d 時，由于酵母菌的生長時間短，代謝過程中產生酒精的積累量較少，導致酒精度較低，發(fā)酵液風味不佳，感官評分值偏低；當發(fā)酵時間較長，超過5 d 時，發(fā)酵液中其他菌類的繁殖會爭奪所需要的營養(yǎng)為食，從而抑制酵母菌的生長，導致其他代謝物雜質的積累量增加，酒精積累量減少，且隨著發(fā)酵時間的延長發(fā)酵液中的苦澀味越明顯，導致酒精度和感官評分值均呈現(xiàn)下降趨勢.因此，確定最佳發(fā)酵時間為5 d.

圖1 發(fā)酵時間對枸杞發(fā)酵液酒精度、感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.2 發(fā)酵溫度對枸杞發(fā)酵的影響 枸杞多糖經過糖化轉變?yōu)槠咸烟枪┙o酵母菌利用，發(fā)酵溫度與糖化速率成正相關，即發(fā)酵溫度越高糖化速率越快.于酵母菌而言，當發(fā)酵溫度較低時，其生長繁殖和代謝不旺盛，從而導致發(fā)酵液的酒精度偏低，且酒香味不醇厚，導致感官評分值較低；當發(fā)酵溫度偏高時，雖然對酵母菌的生長繁殖有促進作用，但高溫會導致發(fā)酵液中易于揮發(fā)的香氣成分加速流失，影響整體香氣，導致感官評分值降低，所以需要尋找合適的溫度來優(yōu)化發(fā)酵產品效果.因培養(yǎng)瓶中已添加了酵母生長繁殖所需的各類營養(yǎng)物質［14］，在此均衡條件下，適宜溫度的選擇對酵母耐受性和發(fā)酵性能得到較好體現(xiàn)密切相關，且更有利于發(fā)酵產物積累［15］.由圖2 可知，在31 ℃時發(fā)酵液以酒精度2.4%vol 和感官評分值72 分達到最高點，當溫度低于或高于31 ℃時都酒精度曲線呈現(xiàn)出明顯下降的趨勢.因此確定31 ℃為枸杞發(fā)酵最適溫度.

圖2 發(fā)酵溫度對枸杞發(fā)酵液酒精度、感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.3 接種酵母質量分數對枸杞發(fā)酵的影響 隨著接種酵母質量分數的增加，酵母菌之間競爭營養(yǎng)物質來滿足自身生長繁殖的狀況越發(fā)激烈，可能會產生拮抗作用，反而使糖的利用率降低，導致酒精度積累量減少.由圖3 曲線的變化趨勢可知，接種酵母質量分數對酒精積累量有著顯著影響，當接種量為1.5%時，此時酒精的積累量和感官評分均處于最高水平，分別為2.3%vol 和75 分，營養(yǎng)成分溶出相對較高，當接種量低于1.5%時，酵母菌代謝產物累積量較少，發(fā)酵液整體風味不佳，導致酒精度和感官評分值偏低；當接種量超過1.5%后，由于酵母菌對營養(yǎng)物質的競爭作用，使得各自發(fā)酵的底物減少，導致酒精度和感官評分值降低［16］.因此確定最佳接種酵母質量分數為1.5%，能夠得到較好的發(fā)酵結果.

圖3 接種酵母質量分數對枸杞發(fā)酵液酒精度、感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculated yeast mass fraction on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.4 液料比對枸杞果酒發(fā)酵液質量的影響 喬博鑫［17］的研究表明，液料比對酵母菌體的增殖存在影響，當液料比較低時，發(fā)酵液過于黏稠，可能會因為料液體積較小導致溶氧量不足，使酵母菌繁殖速度減慢，不利于其生長，使發(fā)酵液酒精度和感官評分低.而液料比偏大即過度稀釋，可能會因為初始糖濃度不足，也不利于酵母菌的增殖和發(fā)酵，會導致酒精積累量較少，且過高的液料比會導致發(fā)酵液的口感較差、色澤偏淡，香味物質的辨識度下降，酒精度和感官評分值降低.由圖4 可知，枸杞發(fā)酵液的酒精度及感官評分受液料比的影響不顯著，整體呈現(xiàn)較為平穩(wěn)的狀態(tài).在液料比為20：1時，發(fā)酵液的酒精度及感官評分值分別為2.1%vol和77分，因此確定最佳液料比為20：1.

圖4 液料比對枸杞發(fā)酵液酒精度、感官評分的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.5 pH 對枸杞果酒發(fā)酵液質量的影響 當枸杞發(fā)酵液的pH 較低時，酵母菌不易在此過酸的條件下生長繁殖，此時其代謝產物累積量較少，導致酒精度偏低；而當pH 偏高時，發(fā)酵液中的酸味不足且不利于酵母菌生長.由于酵母菌的代謝繁殖，初期會導致酸性中間產物大量產生，致使發(fā)酵液的pH 有所下降，而后中間產物在發(fā)酵過程中作為能量物質繼續(xù)被利用消耗，pH 值緩慢回升［18］.由圖5 可知，pH 的改變對酒精度和感官評分的影響并不明顯.本試驗與李彩霞［19］等人研究結果相似，酵母菌生長最適pH4.0～5.0 左右，此階段的酒精度與感官評分值均處于較高水平.當pH=5.0 時，枸杞發(fā)酵液香氣濃郁，口感良好，酸甜適中，色澤均勻，此時的酒精度為2.0%vol、感官評分為80分，故枸杞發(fā)酵最適pH=5.0時可以得到較好結果.

圖5 pH對枸杞發(fā)酵液酒精度、感官評分的影響Fig.5 Effect of pH value on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

利用Design-Expert13 軟件，應用Box-Behnken 試驗原理，根據試驗方法1.3.5 進行響應面試驗設計，設計結果見表3.并對其試驗數據采用多元回歸分析，分別獲得Y1、Y2的回歸模型方差分析結果（見表4），再經多元線性回歸方程擬合，所得結果如下：

表3 響應面試驗設計及結果Tab.3 Response surface test design and results

表4 枸杞發(fā)酵酒精度及感官評分回歸模型方差分析Tab.4 Variance analysis of regression model for alcohol content and sensory evaluation of Lycium barbara fermentation broth

Y1=2.56+0.150A+0.112 5B+0.237 5C-0.050AB-0.050AC+0.075BC-0.392 5A2-1.07B2-0.517 5C（2R2=0.998 2，P<0.000 1）

Y2=80.40+3.75A+4.13B-0.125C-0.750AB+0.250AC-1.50BC-24.95A2-9.70B2-9.20C（2R2=0.999 6，P<0.000 1）

由響應面的方差分析結果可知，酒精度（Y1）和感官評分（Y2）的回歸模型顯著性結果均顯示為P<0.000 1，均為極顯著，具有統(tǒng)計學意義.且二者的R2值分別為0.998 2、0.999 6，都接近1，可見模型與試驗呈現(xiàn)出高度擬合狀態(tài).失擬項通常用以評估方程的可靠性，若不顯著則方程模擬的較好，反之較差，酒精度（Y1）和感官評分（Y2）的失擬項均 >0.05，均為不顯著，由此可應用本試驗所得擬合回歸方程來替代試驗真實點對枸杞發(fā)酵過程中酒精度和感官評分進行推測和分析.根據回歸模型顯著性結果顯示：對于酒精度（Y1），一次項和二次項均為極顯著，其影響酒精度的強弱程度為：B>C>A；交互項BC具顯著性，其余為不顯著，則能夠說明B、C兩者之間的交互作用顯著，因此，在采用該擬合回歸方程模型時應考察二者之間的交互作用.對于感官評分（Y1），一次項C不顯著，其余均為極顯著，二次項又均為極顯著性，其影響酒感官評分的強弱程度為：A>B>C；交互項AB、AC間交互作用極顯著，由此在應用該模型時需要考慮到AB、AC間的交互作用.

2.3 響應面三因素交互作用分析

響應面圖能直觀地反映出兩因素之間的交互作用的大小，其傾斜度程度越大，且對應的等高線圖愈接近橢圓形，說明兩個因素之間的交互作用越顯著［20］，對響應值的影響程度越大；反知當曲面圖的坡度越平緩，對應的等高線越近似于正圓形，則說明這兩個因素之間的交互作用就越弱，對響應值的影響程度越小.由圖6可見，AB、BC間響應面圖的等高線均近于橢圓形，相較而言BC間曲面圖的傾斜程度更大；AC間曲面圖較為平緩，其等高線接近正圓形.結合表4方差分析的結果可知，各交互作用中的F值分別為AB=AC=4.83，BC=10.86，綜上，影響枸杞發(fā)酵的酒精度的各因素之間的交互作用大小為BC>AB>AC.

圖6 三因素交互作用對枸杞發(fā)酵液酒精度的影響Fig.6 Interaction of the three factors on the alcohol content of Lycium barbara fermented liquor

由圖7可知，AB間響應曲面坡度最為陡峭，且等高線近似于橢圓形，其次AC間曲面傾斜度較高；而BC曲面圖最為平緩，且等高線近正圓形.據表4 可得，兩兩因素交互作用對應的F值分別為AB=10.86，BC=43.45，AC=1.21，故而影響枸杞發(fā)酵的感官評分的各因素之間的交互作用大小為AB>AC>BC.

圖7 三因素交互作用對枸杞發(fā)酵液感官評分的影響Fig.7 Interaction of the three factors on the sensory evaluation of Lycium barbara fermented liquor

3 驗證試驗

在單因素試驗基礎上，確定枸杞發(fā)酵最佳的液料比為20：1 和pH 為5.0.結合響應面試驗進行優(yōu)化分析，確定了枸杞發(fā)酵液的最佳發(fā)酵參數分別為發(fā)酵時間5.5 d、發(fā)酵溫度為31.17 ℃、接種酵母質量分數為1.56%.實際操作中，將各參數條件進行略微調整，實際參數條件及5 次重復驗證試驗，試驗結果見表5.

表5 參數優(yōu)化后枸杞發(fā)酵液酒精度與感官評分值Tab.5 The alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor after parameter optimization

優(yōu)化發(fā)酵條件下，回歸模型所預估的發(fā)酵液酒精度為2.56%vol，感官評分為76.3 分；而實際試驗條件下，5 次重復試驗所得到的酒精度與感官評分平均值分別為2.53%vol 和79.7 分.這與回歸方程所得的酒精度與感官評分預測值較接近，表明該回歸方程與實際情況擬合度高，能夠比較準確真實地反映各因素對枸杞發(fā)酵液酒精度與感官評分的影響.

4 結論

本研究以枸杞為原料，基于單因素試驗探究五因素對枸杞微生物發(fā)酵（酵母菌）的影響，并以響應面分析法加以優(yōu)化，確定了枸杞發(fā)酵制備的最優(yōu)參數為：發(fā)酵時間5.5 d、發(fā)酵溫度為31 ℃、接種酵母質量分數為1.6%.在結合液料比20：1、pH5.0條件下，重復進行5次驗證試驗，所測得的實際酒精度和感官評分均值分別為2.53%vol和79.7分，與回歸方程所得的預測值，即酒精度2.56%vol與感官評分76.3分很接近，因此采用響應面法優(yōu)化枸杞發(fā)酵工藝條件合理可靠，可為枸杞以及其他植物資源的果酒制備，實現(xiàn)綜合利用提供一定的借鑒價值.