轉錄因子CEBPB激活FJX1促進結腸癌細胞的增殖、侵襲、遷移和血管生成能力的研究

滕向龍 朱錫元 鄒武軍

[摘要]?目的?探究CCAAT增強子結合蛋白B（CCAAT?enhancer?binding?protein?beta，CEBPB）與四連接同源基因（four-jointed?box?kinase?1，FJX1）在結腸癌（colon?cancer，CC）中的調控關系及其對CC惡性進展及血管生成的影響。方法?通過生物信息學分析FJX1和CEBPB在CC中的表達情況及二者之間的調控關系。利用實時熒光定量核酸擴增檢測系統（real-time?quantitative?reverse?transcription?polymerase?chain?reaction，qRT-PCR）驗證FJX1與CEBPB在CC細胞中的表達情況，利用染色質免疫沉淀（chromatin?immunoprecipitation，CHIP）與雙熒光素酶實驗驗證FJX1與CEBPB之間的結合關系。利用細胞計數試劑-8（cell?counting?kit-8，CCK-8）、劃痕試驗、Transwell和血管形成實驗檢測FJX1與CEBPB對CC細胞增殖、遷移、侵襲及血管形成能力的影響。結果?本研究發現FJX1在CC中高表達，抑制FJX1的表達會顯著抑制結腸癌細胞的細胞增殖、遷移、侵襲及血管形成能力。CEBPB是FJX1的上游調控基因，且CEBPB在結腸癌中高表達。CHIP與雙熒光素酶實驗結果顯示，CEBPB可與FJX1相結合。細胞實驗結果表明，轉錄因子CEBPB可通過激活FJX1的表達，從而促進CC細胞的增殖、遷移、侵襲及血管生成。結論?CEBPB/FJX1軸在CC的進展中發揮促癌作用，提示CEBPB和FJX1可能是CC的潛在治療靶點。

[關鍵詞]?結腸癌；CCAAT增強子結合蛋白B；四連接同源基因；血管生成；細胞增殖

[中圖分類號]?R735????[文獻標識碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.03.009

The?research?of?transcription?factor?CEBPB?activates?FJX1?to?promote?the?proliferation，?invasion，?migration?and?angiogenesis?of?colon?cancer?cells

TENG?Xianglong，?ZHU?Xiyuan，?ZOU?Wujun

Department?of?Anorectal?Surgery，?Lishui?People’s?Hospital，?Lishui?323000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?regulatory?relationship?between?CCAAT?enhancer?binding?protein?beta?（CEBPB）?and?four-jointed?box?kinase?1?（FJX1）?in?colon?cancer?and?their?effect?on?colon?cancer?（CC）?malignant?progression?and?angiogenesis.?Methods?Bioinformatics?was?used?to?analyze?the?expression?of?FJX1?and?CEBPB?in?CC?and?the?regulatory?relationship?between?them.?Real-time?quantitative?reverse?transcription?polymerase?chain?reaction?（qRT-PCR）?was?used?to?verify?the?expression?of?FJX1?and?CEBPB?in?CC?cells，?and?chromatin?immunoprecipitation?（CHIP）?and?dual?luciferase?assay?were?used?to?verify?the?binding?relationship?;between?FJX1?and?CEBPB.?The?effects?of?FJX1?and?CEBPB?on?the?viability，?migration，?invasion?and?angiogenesis?of?CC?cells?were?detected?by?cell?counting?kit-8?（CCK-8），?scratch?test，?Transwell?and?angiogenesis?test.?Results?This?study?revealed?that?FJX1?was?highly?expressed?in?CC.?Inhibiting?the?expression?of?FJX1?could?significantly?inhibit?the?cell?viability，?migration，?invasion?and?angiogenesis?of?CC?cells.?Subsequently，?we?found?that?CEBPB?was?an?upstream?regulatory?gene?of?FJX1，?and?CEBPB?was?highly?expressed?in?CC.?CHIP?and?dual?luciferase?experiments?showed?that?CEBPB?could?bind?to?FJX1.?The?results?of?cell?experiments?showed?that?the?transcription?factor?CEBPB?could?promote?the?proliferation，?migration，?invasion?and?angiogenesis?of?CC?cells?by?activating?FJX1.?Conclusion?CEBPB/FJX1?axis?played?a?cancer-promoting?role?in?the?progression?of?CC，?suggesting?that?CEBPB?and?FJX1?may?be?potential?therapeutic?targets?for?CC.

[Key?words]?Colon?cancer;?CEBPB;?FJX1;?Angiogenesis;?Cell?proliferation

結腸癌（colon?cancer，CC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均居于癌癥相關疾病的前列[1]。目前CC的治療手段主要有手術切除、放化療及靶向治療等，但仍常發生局部復發和遠處轉移，患者預后并不理想[2-3]。據統計，無轉移、局部轉移和遠處轉移患者的5年生存率分別為90%、70%和10%[3]。因此，尋找CC患者的新型治療靶點已成為當今研究的主要熱點之一。多項研究證明，CC的侵襲能力與血管生成程度密切相關[4]。四連接同源基因（four-jointed?box?kinase?1，FJX1）在CC中低表達，且已有研究證明，FJX1與CC的血管生成相關[5]。本研究進一步探究FJX1在CC細胞惡性進展和人臍靜脈內皮細胞（human?umbilical?vein?endothelial?cells，HUVEC）血管生成中的機制，為CC的治療提供新的治療靶點和思路。

1??材料與方法

1.1??生信分析

利用TCGA中下載CC?mRNA表達量數據（正常樣本：41，腫瘤樣本：480），利用“edgeR”包對mRNA進行差異表達分析（|logFC|>1，FDR<0.05）獲得DEmRNA。隨后，利用hTFtarget數據庫和ChIPBase數據庫預測CC中FJX1上游的潛在轉錄因子，通過Pearson相關性確定轉錄因子。利用JASPAR數據庫預測目標基因與轉錄因子的結合位點，結合生信數據分析目標基因的表達量。

1.2??細胞系培養

從美國菌種保存中心獲取人結腸上皮細胞系（fetal?human?colon，FHC）和3種CC細胞系（Caco-2、LoVo和HCT?116）。所有細胞系在補充10%胎牛血清?（fetal?bovine?serum，FBS）（購自美國Thermo?Fisher?Scientific公司）的RPMI-1640培養基（購自美國Cytiva公司），在含有5%CO2?37℃的培養箱中培養。從中國北納生物科技有限公司購買人臍靜脈內皮細胞（BNCC342247），利用DMEM+10%FBS培養基，在37℃、5%?CO2條件下的恒溫培養箱中培養，24h后，進行后續相關實驗。

1.3??細胞轉染

sh-FJX1、oe-CCAAT增強子結合蛋白B（CCAAT?enhancer?binding?protein?beta，CEBPB）及對應的陰性對照均購自中國銳博生物科技有限公司。使用購自美國Thermo?Fisher?Scientific公司的Lipofectamine?2000試劑盒，并根據試劑盒操作說明書將sh-FJX1、oe-CEBPB及對應的陰性對照轉染到CC細胞中，48h后通過RT-qPCR評估轉染效率。

1.4??CCK-8檢測細胞活力

利用購自中國碧云天生物技術有限公司的細胞計數試劑（cell?counting?kit-8，CCK-8）試劑盒評估細胞活力。轉染24h后，將細胞懸浮液接種至96孔板（8×103細胞/孔），隨后在0、24、48、72h時使用培養基稀釋10μl?CCK-8溶液并加入96孔板中，將細胞在37℃下培養1h。使用購自美國Thermo?Fisher?Scientific公司的分光光度計檢測450nm下的吸光度（A值）。

1.5??劃痕試驗

將細胞接種在6孔板中（1×106細胞/孔），利用無血清培養基培養12h。當細胞的融合率達到80%時，利用20μl的無菌槍頭垂直于細胞平面在細胞層面上進行劃痕，利用顯微鏡進行拍照。在37℃下培養48h后，利用顯微鏡再次進行拍照，并使用購自美國National?Institutes?of?Health公司的ImageJ軟件測量劃痕寬度變化。

1.6??Transwell分析

采用Transwell實驗檢測細胞侵襲能力。將購自美國BD公司的Matrigel涂抹到Transwell上室中。轉染的細胞消化成單細胞后，將細胞（1×105）接種到腔室中并在無血清培養基中培養。然后，將含有10%?FBS的RPMI-1640加入下室中。在37℃、5%?CO2的培養箱中培養24h后，取出培養基。將入侵板上的細胞用4%多聚甲醛固定30min，隨后用PBS清洗3～5次，用0.1%結晶紫染色15min后用自來水洗滌。隨后，在購自日本Nikon公司的顯微鏡下觀察入侵的細胞。

1.7??體外血管形成實驗

利用購自英國Abcam公司的Angiogenesis?Assay試劑盒，根據說明書要求，將細胞外基質（extracellular?matrix，ECM）溶液置于4℃下過夜，將其加入在預冷的24孔板中，隨后置于37℃下孵育固化1h。隨后將CC細胞的濃度調整為2×104細胞/100μl并接種到每孔中，將HUVEC加入培養基中37℃下孵育24h，然后將培養基倒置于顯微鏡下進行拍照。觀察HUVEC血管形成情況，通過對血管形成數量和血管分支數量進行計數，以評估血管形成能力。實驗選取3個不同的視野進行計數[6]。

1.8??實時熒光定量核酸擴增檢測

使用購自日本TaKaRa公司的TRIzol?試劑提取總RNA，具體操作步驟參考Sun等[7]的實驗。引物序列見表1。

1.9??ChIP實驗

利用購自美國Cell?Signaling?Technology公司的SimpleChIP??Enzymatic?Chromatin?IP?Kit，參照試劑盒說明書，根據Sun等[7]的研究方法確定CEBPB與FJX1之間的結合關系。使用購自英國Abcam公司的anti-CEBPB（ab32358）及美國Cell?Signaling?Technology公司的ChIP-Grade?Protein?G?Magnetic?Beads進行免疫沉淀，并通過實時熒光定量核酸擴增檢測系統（real-time?quantitative?reverse?transcription?polymerase?chain?reaction，qRT-PCR）對量化基因表達進行分析。此次研究中的結合位點引物序列見表2。

1.10??雙熒光素酶報告分析

將含有CEBPB結合位點的野生型和突變型FJX1序列插入pGL3熒光素酶報告載體中，構建pGL3-promoter-FJX1-MUT、pGL3-promoter-FJX1-WT。然后分別將oe-NC/oe-CEBPB與上述兩個質粒共轉染到結腸癌細胞培養48h，根據說明書利用購自美國Promega公司的Luciferase?Activity?Assay?Kit檢測各轉染組熒光素酶活性。具體實驗操作參考Liu等[8]的實驗。

1.11??統計學方法

采用GraphPad?Prism?7統計學軟件對數據進行處理分析，以3次獨立測量值的均數±標準差（）表示，采用Student-t和單因素方差分析組間差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??FJX1在CC中高表達

為探究FJX1在CC中的表達情況，本研究使用TCGA數據庫分析發現，FJX1在CC組織中高表達，見圖1A，同時利用生存曲線進行分析，發現FJX1高表達與患者預后不良相關，見圖1B。隨后采用qRT-PCR對CC細胞系中FJX1的表達情況進行檢測，發現與正常人FHC相比，CC細胞系中FJX1的表達水平顯著升高，見圖1C。與其他細胞系相比，HCT?116中FJX1表達量高（2.36±0.12），LoVo中FJX1的表達量低（1.86±0.16），因此，選取HCT?116和LoVo細胞系用于后續細胞功能實驗。綜合以上結果可以看出，FJX1在CC中高表達。

2.2??FJX1過表達促進CC惡性進展

為探究FJX1與CC惡性進展的關系，本研究構建FJX1異常表達細胞系，分別為sh-NC/HCT?116（陰性對照組）和sh-FJX1/HCT?116（敲低FJX1組）、oe-NC/LoVo（陰性對照組）和oe-FJX1/LoVo（過表達FJX1組），利用qRT-PCR檢測細胞轉染效率。結果顯示，在oe-FJX1組細胞中FJX1呈顯著上調表達，在sh-FJX1組細胞中FJX1呈顯著下調表達，見圖2A。CCK-8結果顯示，FJX1過表達可增加腫瘤細胞的細胞活力，而沉默FJX1則表現出相反的結果，見圖2B。劃痕試驗和Transwell實驗結果顯示，過表達FJX1，細胞的遷移和侵襲能力顯著增強；沉默FJX1則會抑制細胞的遷移和侵襲能力，見圖2C～2D。以上結果表明FJX1可促進CC細胞遷移和侵襲能力，進而促進CC的惡性進展。

2.3??FJX1過表達誘導CC血管生成

研究證明，血管生成在CC的發生和轉移中起至關重要的作用[5]。為進一步探究FJX1與CC血管形成的關系，本研究利用不同處理組的細胞上清液與HUVEC細胞共培養。結果顯示，與對照組相比，過表達FJX1顯著刺激血管和分支點的形成；而沉默表達FJX1則表現出顯著抑制血管數量和分支點的形成，見圖3A～3B。綜上表明FJX1過表達誘導CC血管生成。

A.qRT-PCR檢測構建FJX1異常表達細胞系的轉染情況；B.CCK-8檢測不同處理組CC細胞的細胞活性；C.劃痕試驗檢測不同處理組CC細胞遷移情況；D.Transwell實驗檢測不同處理組CC細胞侵襲情況。*P<0.05

2.4??CEBPB是FJX1上游調控因子

為進一步探究FXJ1調控CC惡性進展及血管生成的作用機制，本研究利用hTFtarget數據庫和ChIPBase數據庫對CC中FJX1基因的轉錄因子進行預測，分別獲取343個潛在轉錄因子和33個潛在轉錄因子，將2個數據庫預測得到的轉錄因子與2985個差異上調基因取交集獲取5個差異的潛在轉錄因子，見圖4A。Pearson相關性發現FJX1與CEBPB之間呈正相關（R=0.49，P<0.05），利用t檢驗分析CEBPB在CC中的表達情況，發現CEBPB在CC中顯著高表達，見圖4B～C。此外，本研究發現CEBPB與FJX1轉錄本上游2000bp位置存在潛在結合位點，見圖4D。為驗證結果的準確性，本研究首先利用qRT-PCR檢測CEBPB在CC細胞系中的表達水平，發現CEBPB在CC細胞系中顯著高表達，見圖4E。隨后，通過ChIP實驗驗證CEBPB與FJX1之間的啟動子結合關系，發現CEBPB與FJX1之間存在結合關系，見圖4F。雙熒光素酶實驗也進一步證實兩者之間存在結合關系，過表達CEBPB使野生型FJX1熒光素酶活性提高，而對突變型FJX1熒光素酶活性沒有影響，見圖4G。以上結果證明CEBPB是FJX1的上游轉錄因子。

2.5??CEBPB通過調節FJX1影響CC的惡性進展及血管形成

為進一步探究CEBPB對FJX1的影響，本研究利用HCT?116細胞系構建異常表達細胞，分別為oe-NC+sh-NC、oe-CEBPB+sh-NC、oe-NC+sh-FJX1及oe-CEBPB+?sh-FJX1，并利用qRT-PCR檢測FJX1的表達情況，見圖5A。CCK-8實驗結果顯示，CEBPB過表達可促進CC細胞的細胞活力，進一步沉默FJX1可逆轉CEBPB過表達對結腸癌細胞活性的促進作用，見圖5B。劃痕試驗和Transwell實驗結果顯示，CEBPB過表達促進CC細胞的遷移和侵襲能力，CEBPB過表達的同時沉默FJX1使CC細胞遷移和侵襲情況恢復到oe-NC+sh-NC組水平，見圖5C～5D。血管形成實驗結果顯示，在oe-CEBPB+sh-NC組中，?A.檢測在不同FJX1表達情況下HUVEC血管形成情況，并利用顯微鏡對血管形成情況進行計數，其中虛線圓所指位置代表血管，箭頭所指位置代表血管分支；B.顯微鏡下血管分支計數，*P<0.05A.利用生信篩選FJX1的潛在上游轉錄因子；B.FJX1與CEBPB之間的Pearson相關性分析；C.CEBPB在CC組織和正常組織中的表達水平；D.CEBPB與FJX1的潛在結合位點；E.CEBPB在不同細胞系中的表達情況；F～G.?ChIP實驗和雙熒光素酶實驗驗證CEBPB與FJX1之間的啟動子結合關系；*P<0.05

A.qRT-PCR檢測不同處理組FJX1的表達情況；B.CCK8法檢測不同處理組CC細胞的細胞活性；C.劃痕試驗檢測不同處理組CC細胞遷移能力；D.Transwell實驗檢測不同處理組CC細胞侵襲變化情況；E.血管形成實驗檢測HUVEC血管形成情況，其中虛線圓所指位置代表血管，箭頭所指位置代表血管分支；F.統計不同處理組血管數量形成情況；G.統計不同處理組血管分支情況。與oe-NC+sh-NC組比較，*P<0.05；與oe-NC+sh-FJX1組比較，#P<0.05

HUVEC細胞血管形成情況和分支點數量明顯增加，而oe-CEBPB+sh-FJX1組中HUVEC細胞血管形成數量和分支點數量明顯多于oe-NC+sh-FJX1組，表明過表達CEBPB可逆轉沉默FJX1對CC細胞血管形成的影響，見圖5E～G。由此可見，CEBPB可通過激活FJX1的表達，促進CC細胞的惡性進展及HUVEC細胞血管形成。

3??討論

CC的發展涉及多種生理過程，血管生成在腫瘤的增殖、遷移、侵襲中起重要的作用[9]。同時，血管生成也涉及細胞的增殖、遷移及管腔形成[10]。控制癌癥的血管生成是腫瘤治療的關鍵。目前，已有研究證明FJX1是血管生成的調節因子，且FJX1與腫瘤的惡性進展密切相關。Cheng等[11]研究發現，miR-532-2p可通過抑制FJX1的表達，抑制結腸腺癌的惡性進展。本研究發現FJX1在CC組織和細胞中均高表達，抑制FJX1的表達可減弱腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力和HUVEC細胞的血管形成能力，這與之前的研究報道一致。

本研究通過生信預測發現CEBPB是FJX1的上游轉錄因子，隨后利用分子實驗驗證CEBPB與FJX1之間存在結合關系。已有研究證明CEBPB可調節多種細胞增殖、分化和凋亡。Yang等[12]的研究證實，抑制CEBPB/NF-κB信號軸，可抑制結直腸癌的生長，本研究結果與之一致，同時進一步證實CC中CEBPB可通過調節FJX1的表達，促進血管生成，進一步完善FJX1在CC血管生成的作用機制。

本研究的不足為僅從細胞水平驗證CEBPB與FJX1之間的調控關系及其對CC惡性進展及血管生成的作用。未來仍需在動物水平上對這一結果進一步驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2022–12–21）

（修回日期：2023–12–15）

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