基于生物信息學的子宮內膜癌預后模型構建

林鵬 孫培 許淑霞

[摘要]?目的?篩選與子宮內膜癌（endometrial?carcinoma，EC）預后相關的差異基因并構建預后模型。方法?從癌癥基因圖譜（The?Cancer?Genome?Atlas，TCGA）數據庫和基因表達譜數據庫（Gene?Expression?Omnibus，GEO）的數據集GSE63678中下載EC和正常對照樣本的基因表達數據，篩選出共有差異基因。采用LASSO回歸分析篩選出具有預后意義的基因，并構建預后特征。從TCGA數據庫中獲取具有完整信息的EC患者，按1∶1的比例隨機分為訓練組和驗證組。對訓練組患者基于預后特征構建生存曲線；采用基因本體論（gene?ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）對預后特征進行功能注釋和通路富集分析；結合預后特征及臨床危險因素構建列線圖，采用校準曲線和C指數評估列線圖性能。最后使用驗證組加以驗證。結果?從TCGA和GEO數據庫分別篩選出4800個和257個差異基因，其中共表達的上調基因73個，下調基因52個；LASSO回歸分析篩選出6個預后基因，分別為ORMDL2、BNC2、TTK、MAMLD1、KCTD7、DCLK2；生存曲線結果表明高風險組患者的總生存率顯著低于低風險組（P<0.01）；GO分析和KEGG結果顯示預后特征與細胞周期相關。列線圖在訓練組與驗證組中均顯示出良好的預測能力。結論?本研究構建一種基于預后特征的預測模型，可準確預測EC患者的預后，為臨床診療提供新的理論支持。

[關鍵詞]?子宮內膜癌；生物信息學；預后；預測模型

[中圖分類號]?R737.3????[文獻標識碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.03.011

Construction?of?prognostic?model?for?endometrial?carcinoma?based?on?bioinformatics

LIN?Peng1，?SUN?Pei2，?XU?Shuxia2

1.Department?of?Pathology，?Fujian?Children’s?Hospital?（Fujian?Branch?of?Shanghai?Children’s?Medical?Center），?College?of?Clinical?Medicine?for?Obstetrics?&?Gynecology?and?Pediatrics，?Fujian?Medical?University，?Fujian?Fuzhou，?350000，?China;?2.Department?of?Pathology，?Fujian?Maternity?and?Child?Health?Hospital，?College?of?Clinical?Medicine?for?Obstetrics?&?Gynecology?and?Pediatrics，?Fujian?Medical?University，?Fuzhou?350000，?Fujian，?China

[Abstract]?Objective?Differential?genes?related?to?prognosis?of?endometrial?carcinoma?（EC）?were?screened?and?prognostic?models?were?constructed.?Methods?Gene?Expression?data?of?EC?and?normal?control?samples?were?downloaded?from?The?Cancer?Genome?Atlas?（TCGA）?database?and&nbsp;Gene?Expression?Omnibus?（GEO）?dataset?GSE63678?to?screen?out?common?differential?genes.?LASSO?regression?analysis?was?used?to?screen?out?the?genes?with?prognostic?significance?and?construct?prognostic?characteristics.?EC?patients?with?complete?information?were?obtained?from?the?TCGA?database?and?randomly?divided?into?the?training?group?and?the?validation?group?in?a?ratio?of?1：1.?In?the?training?group，?survival?curves?were?constructed?based?on?prognostic?characteristics.?Functional?annotation?and?pathway?enrichment?analysis?were?conducted?using?gene?ontology?（GO）?analysis?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）?analysis.?Combined?with?prognostic?features?and?clinical?risk?factors，?a?calibration?curve?and?C-index?were?used?to?evaluate?the?performance?of?the?histogram.?Finally，?use?a?verification?group?for?validation.?Results?A?total?of?4800?and?257?differentially?expressed?genes?were?screened?from?TCGA?and?GEO?databases?respectively，?of?which?73?up-regulated?genes?and?52?down-regulated?genes?were?co-expressed.?6?prognostic?genes?（ORMDL2，?BNC2，?TTK，?MAMLD1，?KCTD7?and?DCLK2）?were?screened?out?by?LASSO?regression?analysis.?The?survival?curve?showed?that?the?overall?survival?of?patients?in?the?high-risk?group?was?significantly?lower?than?that?in?the?low-risk?group?（P<0.01）.?GO?analysis?and?KEGG?results?exhibited?that?prognostic?signature?was?associated?with?cell?cycle.?The?nomogram?showed?powerful?predictive?ability?in?the?training?and?validation?groups.?Conclusion?We?constructed?a?predictive?model?based?on?prognostic?genes，?which?can?accurately?predict?the?prognosis?of?patients?with?EC?and?provide?new?theoretical?support?for?clinical?diagnosis?and?treatment.

[Key?words]?Endometrial?carcinoma;?Bioinformatics;?Prognosis;?Predictive?model

子宮內膜癌（endometrial?carcinoma，EC）是發達國家最常見的婦科惡性腫瘤之一，發病率每年穩定增長約1.3%[1-2]。我國的發病數也在增加，尤其是在年輕女性中[3]。EC患者一般預后較好，總生存率在80%左右，其預后因素主要包括年齡、疾病的分期和組織學類型等[4]。國際婦產科聯盟（Federation?International?of?Gynecology?and?Obstetrics，FIGO）Ⅰ～Ⅱ期EC患者的5年生存率為74%～91%，而FIGO?Ⅲ～Ⅳ期的患者5年生存率為20%～57%[5]。手術和輔助治療可顯著提高EC患者的生活質量，這些治療也可顯著延長患者的生存時間。然而，對于晚期及復發轉移患者的治療方法有限，缺乏有效的預后評估方法，導致患者預后不佳甚至死亡[6]。目前，用于評估EC患者的預后主要依靠臨床分期和術后的病理分期，但因其局限于腫瘤解剖范圍的分期，難以準確預測EC患者的預后[7]。因此，需要挖掘新的生物標志物并構建更加可靠的預測模型，來提高EC患者的生存率。本研究收集癌癥基因圖譜（The?Cancer?Genome?Atlas，TCGA）數據庫中EC患者的測序、臨床和長期隨訪數據及基因表達譜數據庫（Gene?Expression?Omnibus，GEO）中EC數據集GSE63678的測序數據，為EC個體化預測模型構建提供可能性。

1??材料與方法

1.1??研究對象與數據的收集

從TCGA數據庫下載553個EC組織和23個正常對照樣本的基因表達數據及對應的553例患者的臨床數據，將具有完整可用的基因表達數據和臨床信息的541例患者納入后續分析。從GEO數據庫下載數據集GSE63678的基因表達信息，包括7個EC組織樣本及5個正常組織樣本。

1.2??差異基因的篩選

分析從TCGA和GEO數據庫中獲取的基因表達數據，篩選出EC差異基因。本研究的差異基因篩選標準：若EC組織基因表達量與正常對照樣本基因表達量的倍性變化（fold?change，FC）>1，且P<0.001，則為上調基因；若FC<1，且P<0.001，則為下調基因。使用R語言的ggplot2包繪制差異基因火山圖，并用韋恩圖篩選交叉差異表達的基因。

1.3??預后模型的構建

采用R語言的glmnet和survival包對差異基因進行LASSO回歸分析，將篩選出的非零系數基因視為與患者預后相關的基因。將具有完整基因表達和臨床信息的541例患者按1∶1的比例隨機分為訓練組（n=270）和驗證組（n=271），使用篩選出的預后基因及其相應的λ值計算每組患者的風險評分（風險評分=表達值ORMDL2×λORMDL2+表達值BNC2×?λBNC2+表達值TTK×λTTK+表達值MAMLD1×λMAMLD1+表達值KCTD7×λKCTD7+表達值DCLK2×λDCLK2）。以訓練組患者風險評分的平均數作為臨界值，分為低危組和高危組。采用Kaplan-Meier方法繪制兩組患者生存曲線。

1.4??功能富集分析

通過Pearson相關分析篩選出與風險評分最相關的基因（Cor>0.5，P<0.05），并將其上傳至DAVID數據庫中進行生物功能注釋和通路富集分析。本研究選擇官方的基因符號作為標識符，并選擇智人作為物種，最后獲得GO分析和KEGG通路分析的富集結果。本研究顯示P值按升序排列的前5個結果（P<0.05）。

1.5??列線圖建立

采用R語言中的Rms包進行列線圖的建立與分析，上部為評分系統，下部為預測系統。EC患者的1、2、3、5、10年生存率和復發率通過總分、各因素的總和來準確預測，并使用校準曲線和C指數值顯示生存預測的準確性。

1.6??統計學方法

使用R4.2.2和SPSS?26.0軟件進行統計分析。總生存期為自確診到死亡或末次隨訪的時間。風險評分與總生存期的關系用Kaplan-Meier生存曲線分析。在DAVID數據庫上進行GO分析和KEGG通路分析。采用t檢驗分析風險評分與臨床病理特征之間的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??差異基因的篩選

通過對TCGA數據進行處理分析，篩選出4800個差異基因，其中上調基因910個（19%），下調基因3890個（81%），見圖1A；對GEO數據進行處理分析，篩選出257個差異基因，其中上調基因153個（60%），下調基因104個（40%），見圖1B。用韋恩圖取交集獲得共同表達的上調差異基因73個，見圖1C，共同表達的下調差異基因52個，見圖1D。

2.2??LASSO回歸篩選

將篩選出的125個差異基因進行LASSO回歸分析，見圖2，最后篩選出6個非零系數的基因及其λ值（ORMDL2：?0.0000189298687888065；BNC2：0.0000890777237690712；TTK：0.00013570127002083；MAMLD1：0.000199877136208518；KCTD7：0.000275026231175745；DCLK2：0.0003987957428?90722）。根據每個基因的表達值及其相應的λ值計算每例患者的風險評分，以訓練組中風險評分的平均數（0.2845）作為臨界值。

2.3??風險因素與EC患者的預后關系

在熱圖中，根據不同的風險水平，顯示訓練組和驗證組中每例患者的臨床特征及預后基因的表達情況，見圖3A、3B。生存曲線圖顯示，在訓練組中高風險組患者的總生存率顯著低于低風險組（P<0.01），見圖3C；在驗證組中，得到了一致的結果（P<0.01），見圖3D。

2.4??風險評分與臨床因素的關系

進一步檢測風險評分與臨床因素之間的關系。在訓練組中，FIGO?Ⅳ～Ⅳ期患者的風險評分顯著高于FIGO?Ⅰ～Ⅱ期患者（P<0.05），高風險組患者年齡顯著高于低風險組患者（P<0.05），見圖4A。在驗證組中，FIGO?Ⅳ～Ⅳ期患者的風險評分也顯著增加（P<0.05），然而高風險組患者年齡與低風險組患者年齡差異無統計學意義（P>0.05），見圖4B。

2.5??風險評分與細胞周期密切相關

為探討與風險評分相關的生物學功能，采用Pearson相關分析篩選出與風險評分最相關的基因（Cor>0.5，P<0.05），將上述基因進行功能富集分析。GO分析結果顯示，在訓練組和驗證組中，與風險評分最為相關的生物過程（biological?process，BP）為細胞分裂，見圖4A、4E，細胞成分（cell?component，CC）是細胞核，見圖4B、4F，分子功能（molecular?function，MF）為微管結合，見圖4C、4G。KEGG結果顯示，在兩組數據庫中，風險評分均與細胞周期最相關，見圖4D、4H。

2.6??個性化預測模型具有較好的預測精度

列線圖在臨床實踐中可用于計算特定腫瘤患者的生存率，具有重要的應用價值。因此，本研究在訓練組中基于風險評分、年齡、FIGO分期等獨立預測因素，構建個體化預測模型。通過該模型估計EC患者（1、2、3、5、10年）的總生存率，見圖6A。校準曲線結果顯示，在訓練組與驗證組中A和B.按風險評分的升序，熱圖顯示訓練組與驗證組中每例患者的臨床因素和6個風險基因的表達；C和D.訓練組與驗證組中高風險患者與低風險患者總生存率曲線分析圖A.訓練組中風險評分與臨床因素的關系；B.驗證組中風險評分與臨床因素的關系

A～D.訓練組中與風險評分相關的生物學功能和通路；E～H.驗證組中與風險評分相關的生物學功能和通路

患者在1、2、3、5、10年的預測生存率接近實際生存率，說明列線圖顯示出良好的預測能力，見圖6B。該列線圖模型的C指數為0.77，優于其他任何獨立的預測模型，也顯示出較好的預測精度，見圖6C。

3??討論

早期EC患者由于手術等綜合治療，預后良好；然而，當EC進展為晚期或轉移后，其預后很差。惡性腫瘤具有異質性，同一期患者的生存預后有所不同。雖然目前對特異性分子標志物的廣泛研究取得進展，但由于個體差異，在臨床實踐中還沒有建立準確的方法來判斷患者的預后[8]。因此，迫切需要尋找更有價值的生物標志物來準確預測EC患者的預后，并提高患者的總生存期。

本研究中，筆者在TCGA和GEO數據庫中篩選出共有的EC組織與正常對照樣本的差異基因，并采用LASSO回歸分析篩選出6個與EC患者總生存期相關的預后基因。由于GEO數據庫缺乏關于EC患者的臨床信息，因此本研究將整個具有完整基因表達和臨床信息的TCGA患者隊列隨機分為訓練組和驗證組。然后，在訓練組中構建一個基于預后特A.?EC患者列線圖預測模型；B.校準曲線顯示在訓練組與驗證組中，患者在1年、2年、3年、5年和10年的預測生存率與實際生存率之間的比較；C.?C指數評價列線圖對患者生存率的預測效果

征的生存曲線，結果表明高風險組患者的總生存率顯著低于低風險組，并在驗證組中得到證實，保證了其準確性。因此，生存曲線結果說明預后特征對EC患者的預后具有獨立的預測能力。

在本模型的6個預后基因中（ORMDL2、BNC2、TTK、MAMLD1、KCTD7及DCLK2），目前還無關于KCTD7在腫瘤中的功能或機制的報道，其他5個基因在各種腫瘤中的重要作用都已有報道。ORMDL2是鞘脂代謝的重要調控因子，與細胞的生長、增殖、遷移和侵襲有關。有研究表明，ORMDL2的高表達與膠質瘤的不良預后相關[9]。BNC2在各種類型的細胞中廣泛存在，該基因與角質細胞增殖能力有關，在細胞終極分化中起重要作用，有研究表明BNC2不僅可抑制卵巢癌的發展，還與膠質母細胞瘤患者的生存相關[10-12]。?TTK是紡錘體組裝檢查點的核心組成部分，其功能是確保染色體正確分配給子細胞，許多研究表明TTK在幾種人類惡性腫瘤中過度表達，包括胃癌、卵巢癌和乳腺癌，其表達與患者不良預后有關[13-15]。

MAMLA1是一個轉錄共激活因子，目前的研究表明MAMLA1與促性腺激素垂體腺瘤和幕上室管膜瘤的發生、發展有關[16-17]。DCLK2是一種參與神經發育和成熟的微管相關蛋白激酶，有研究表明DCLK2促進乳腺癌細胞侵襲轉移，其在乳腺癌中的高表達與患者不良預后相關[18]。另有學者發現，DCLK2的高表達與慢性淋巴細胞白血病患者的生存率降低有關[19]。因此，本研究中確定的預后基因可能是靶向治療EC的有效途徑。為進一步挖掘和探索這些預后基因在EC中的功能和機制，本研究對此進行功能注釋和通路富集分析。GO分析和KEGG結果顯示，與風險評分最相關的基因主要富集于細胞分裂、有絲分裂、染色體分裂等生物學過程中及與細胞周期相關的信號通路中。此前有研究表明，高度有序的細胞周期活動是細胞維持正常代謝與增殖的保障，細胞周期調控異常是促進腫瘤惡性進展的潛在誘變因素[20]。早期有學者指出G2細胞周期調節因子的改變可導致子宮內膜的癌變[21]。因此，細胞周期異常在EC的發生、發展中起重要作用。

最后，為能更直觀地顯示EC患者的預后情況，本研究基于預后特征和其他兩個獨立的臨床特征構建列線圖，以幫助臨床醫生個體化預測EC患者1、2、3、5、10年的總生存率；校準曲線在訓練組和驗證組中均顯示EC患者的預測生存率與實際生存率一致，C指數結果也表明該列線圖具有良好的預測性能。因此，以上結果表明該模型可對EC患者的生存和預后進行個性化、準確的評估，有利于患者的生存和預后。本研究存在局限性，首先有限的樣本量可能影響模型的精度；其次，該模型的參數和預測因素可能需要進行更新，以達到更高的預測精度；最后，該模型還需在其他數據庫或大規模的臨床數據中進行驗證。

綜上所述，本研究不僅構建了一個具有高預測準確性的列線圖，而且提供了潛在的預后生物標志物和治療靶點，為臨床決策提供可靠的理論支持。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] Siegel?R?L，?Miller?K?D，?Fuchs?H?E，?et?al.?Cancer?statistics，?2021[J].?CA?Cancer?J&nbsp;Clin，?2021，?71（1）：?7–33.

[2] Lortet-Tieulent?J，?Ferlay?J，?Bray?F，?et?al.?International?patterns?and?trends?in?endometrial?cancer?incidence，?1978—2013[J].?J?Natl?Cancer?Inst，?2018，?110（4）：?354–361.

[3] Chen?W，?Zheng?R，?Baade?P?D，?et?al.?Cancer?statistics?in?China，?2015[J].?CA?Cancer?J?Clin，?2016，?66（2）：?115–132.

[4] Sorosky?J?I.?Endometrial?cancer[J].?Obstet?Gynecol，?2012，?120（2?Pt?1）：?383–397.

[5] Morice?P，?Leary?A，?Creutzberg?C，?et?al.?Endometrial?cancer[J].?Lancet，?2016，?387（10023）：?1094–1108.

[6] Siegel?R?L，?Miller?K?D，?Jemal?A.?Cancer?statistics，?2017[J].?CA?Cancer?J?Clin，?2017，?67（1）：?7–30.

[7] 張遠麗，?張師前.?基于預后和分子分型的子宮內膜癌分期修訂建議：?國際聲音與中國現狀[J].?中國實用婦科與產科雜志，?2020，?36（3）：?283–286.

[8] Bushweller?J?H.?Targeting?transcription?factors?in?cancer-from?undruggable?to?reality[J].?Nat?Rev?Cancer，?2019，?19（11）：?611–624.

[9] 嚴東明，?梁健堂，?劉曉遷，?等.?膠質瘤免疫生物標志物ORMDL2在膠質瘤診斷和預后中的作用[J].?海南醫學院學報，?2023，?29（6）：?428–437.

[10] Liu?T，?Yuan?L，?Zou?X.?Circular?RNA?circ-BNC2?（hsa_circ_0008732）?inhibits?the?progression?of?ovarian?cancer?through?microRNA-223-3p/FBXW7?axis[J].?J?Ovarian?Res，?2022，?15（1）：?95–105.

[11] Lu?M，?Gong?B，?Wang?Y，?et?al.?CircBNC2?affects?epithelial?ovarian?cancer?progression?through?the?miR-223-3p/LARP4?axis[J].?Anticancer?Drugs，?2023，?34（3）：?384–394.

[12] WANG?Z，?TANG?W，?YUAN?J，?et?al.?Integrated?analysis?of?RNA-binding?proteins?in?glioma[J].?Cancers?（Basel），?2020，?12（4）：?892–911.

[13] Huang?H，?Yang?Y，?Zhang?W，?et?al.?TTK?regulates?proliferation?and?apoptosis?of?gastric?cancer?cells?through?the?Akt-mTOR?pathway[J].?FEBS?Open?Bio，?2020，?10（8）：?1542–1549.

[14] Liu?Y，?Zhu?K，?Guan?X，?et?al.?TTK?is?a?potential?therapeutic?target?for?cisplatin-resistant?ovarian?cancer[J].?J?Ovarian?Res，?2021，?14（1）：?128–138.

[15] Gao?Y?H，?Qu?S?S，?Cao?L?Q，?et?al.?TTK?predicts?triple?positive?breast?cancer?prognosis?and?regulates?tumor?proliferation?and?invasion[J].?Neoplasma，?2022，?69（2）：?274–282.

[16] Andreiuolo?F，?Varlet?P，?Tauziède-Espariat?A，?et?al.?Childhood?supratentorial?ependymomas?with?YAP1-MAMLD1?fusion：?An?entity?with?characteristic?clinical，?radiological，?cytogenetic?and?histopathological?features[J].?Brain?Pathol，?2019，?29（2）：?205–216.

[17] Qi?J，?Ni?W.?Attenuation?of?MAMLD1?expression?suppresses?the?growth?and?migratory?properties?of?gonadotroph?pituitary?adenomas[J].?Pathol?Oncol?Res，?2020，?26（2）：?937–946.

[18] He?Y，?Dai?X，?Li?S，?et?al.?Doublecortin-like?kinase?2?promotes?breast?cancer?cell?invasion?and?metastasis[J].?Clin?Transl?Oncol，?2023，?25（4）：?1102–1113.

[19] Barrow?T?M，?Wong?Doo?N，?Milne?R?L，?et?al.?Analysis?of?retrotransposon?subfamily?DNA?methylation?reveals?novel?early?epigenetic?changes?in?chronic?lymphocytic?leukemia[J].?Haematologica，?2021，?106（1）：?98–110.

[20] Suski?J?M，?Braun?M，?Strmiska?V，?et?al.?Targeting?cell-cycle?machinery?in?cancer[J].?Cancer?Cell，?2021，?39（6）：?759–778.

[21] Tsuda?H，?Hashiguchi?Y，?Inoue?T，?et?al.?Alteration?of?G2?cell?cycle?regulators?occurs?during?carcinogenesis?of?the?endometrium[J].?Oncology，?2003，?65（2）：?159–166.

（收稿日期：2023–08–15）

（修回日期：2023–12–28）