LPS誘導巨噬細胞M1型極化對腫瘤生長的影響

魏曉環 單前前 朱軍

[摘要]?目的?研究脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導巨噬細胞M1型極化對腫瘤生長的影響。方法?將Balb/c雌性小鼠隨機分為對照組和實驗組。Renca細胞皮下建模，待腫瘤體積生長至50mm3時瘤旁注射生理鹽水（100μl/只，????1次/2d）或LPS（100μg/只，1次/2d），采用流式細胞術檢測腫瘤相關巨噬細胞M1型極化水平。將小鼠腫瘤細胞系（ML-1、MC38、Renca）分成三組：空白組（完全培養基加入50%DMEM基礎培養基）、對照組（完全培養基加入50%巨噬細胞培養基上清液）和實驗組（完全培養基加入50%LPS預處理的巨噬細胞培養基上清液）。采用細胞計數試劑-8（cell?counting?kit-8，CCK-8）實驗檢測腫瘤細胞增殖情況；采用流式細胞術檢測腫瘤細胞周期及凋亡情況。?????結果?經LPS處理后腫瘤相關巨噬細胞M1型比例增多（P<0.001），從而增強其抗腫瘤功能；LPS誘導巨噬細胞M1型極化可顯著抑制腫瘤細胞的增殖（Renca：P=0.023；ML-1：P=0.045）；LPS誘導巨噬細胞M1型極化可引起腫瘤細胞周期G0/G1（MC38：P=0.011；ML-1：P=0.022）或S期（Renca：P=0.022）阻滯，進而抑制細胞分裂；LPS誘導巨噬細胞M1型極化可引起腫瘤細胞凋亡（Renca：P=0.04；ML-1：P=0.007）。結論?LPS可通過誘導巨噬細胞M1型極化發揮抗腫瘤功能。

[關鍵詞]?巨噬細胞；M1型極化；脂多糖；抗腫瘤

[中圖分類號]?R735????[文獻標識碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.03.012

Effect?of?LPS-induced?M1?polarization?of?macrophages?on?tumor?growth

WEI?Xiaohuan1，?SHAN?Qianqian2，?ZHU?Jun3

1.Department?of?Science?and?Education，?Xuzhou?Central?Hospital，?Xuzhou?221004，?Jiangsu，?China;?2.Department?of?Pain，?General?Hospital?of?Xuzhou?Mining?Group，?Xuzhou?221006，?Jiangsu，?China;?3.Department?of?Emergency，?Xuzhou?Central?Hospital，?Xuzhou?221004，?Jiangsu，?China

[Abstract]?Objective?To?study?the?effect?of?lipopolysaccharide?（LPS）-induced?M1?polarization?of?macrophages?on?tumor?growth.?Methods?Female?Balb/c?mice?were?randomly?divided?into?control?group?and?experimental?group.?Renca?cells?were?used?to?establish?subcutaneous?tumor?model.?NaCl?（100μl/mice，?once?every?two?days）?or?LPS?（100μg/mice，?once?every?two?days）?was?injected?to?the?tumor?side?when?the?tumor?grew?to?50mm3.?The?M1?polarization?level?of?tumor-associated?macrophages?was?detected?by?flow?cytometry.?Mouse?tumor?cell?lines?（ML-1，?MC38，?Renca）?were?divided?into?three?groups：?blank?group?（complete?medium?with?50%?DMEM?basal?medium），?control?group?（complete?medium?with?50%?medium?supernatant?of?cultured?macrophages）?and?experimental?group?（complete?medium?with?50%?medium?supernatant?of?LPS?pretreated?cultured?macrophages）.?The?proliferation?of?tumor?cells?was?detected?by?cell?counting?kit-8?（CCK-8）.?The?cell?cycle?and?apoptosis?of?tumor?cells?were?detected?by?flow?cytometry.?Results?The?proportion?of?tumor-associated?macrophages?M1?increased?after?LPS?treatment?（P<0.001），?thus?enhancing?its?anti-tumor?function.?LPS-induced?M1?polarization?of?macrophages?can?significantly?inhibit?the?proliferation?of?tumor?cells?（Renca：?P=0.023，?ML-1：?P=0.045）.?LPS-induced?M1?polarization?of?macrophages?blocked?G0/G1?phase?（MC38：?P=0.011，?ML-1：?P=0.022）?or?S?phase?（Renca：?P=0.022）?of?tumor?cell?cycle，?and?then?cell?division?was?inhibited.?LPS-induced?M1?polarization?of?macrophages?significantly?induced?apoptosis?of?tumor?cells?（Renca：?P=0.04，?ML-1：?P=0.007）.?Conclusion?LPS?can?play?an?anti-tumor?role?by?inducing?M1?polarization?of?macrophages.

[Key?words]?Macrophage;?M1?polarization;?Lipopolysaccharide;?Anti-tumor

巨噬細胞（macrophages，M）是一種位于組織內的白細胞，由血液中的單核細胞穿出血管進入組織后分化形成，具有體積增大、溶酶體增多及吞噬功能增強的特點[1]。M在免疫系統中可被分為經典活化的M1型和選擇性活化的M2型，分別執行促炎和抗炎功能，M的極性對惡性腫瘤的進展非常重要[2]。M2是引起腫瘤進展、轉移和治療抗性的關鍵驅動因素，而M1具有抑制和殺傷腫瘤的作用[3-4]。因此誘導M向M1型極化在抗腫瘤過程中具有重要意義。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌外膜的主要成分，由脂類A、核心多糖和O-特異性多糖三部分組成[5]。研究表明LPS可直接誘導M向M1型極化；此外，LPS持續刺激可下調M半乳糖凝集素-9（galectin-9，GAL-9）的表達和分泌，減弱T細胞免疫球蛋白黏蛋白結構域分子3（T?cell?immunoglobulin?and?mucin?domain，TIM-3）與GAL-9之間的作用，間接誘導M向M1型極化[6-9]。本研究旨在探討LPS誘導M向M1型極化后對腫瘤抑制作用的影響。

1??材料與方法

1.1??材料與試劑

DMEM基礎培養基購自美國Gibco公司。生理鹽水購自Sigma?Aldrich公司。細胞計數試劑-8（cell?counting?kit-8，CCK-8）購自徐州微科曼生物工程有限公司。PI周期試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。流式抗體購自美國Biolegend公司。小鼠巨噬細胞RAW264.7、小鼠肝癌細胞ML-1、小鼠腎癌細胞Renca、小鼠結腸癌細胞MC38購自上海中科院細胞庫。6～8周齡的Balb/c雌性小鼠（SPF級別）購于北京維通利華生物科技有限公司，飼養于SPF級實驗動物中心。本研究經徐州礦務集團總醫院生物醫學研究倫理委員會審批通過（倫理審批號：[2022]072804）。

1.2??細胞培養

小鼠RAW264.7、MC38、Renca、ML-1細胞均使用DMEM培養基，常規培養箱培養。

1.3??CCK-8檢測細胞增殖

收集腫瘤細胞離心后計數，按細胞密度為3×?103個/孔接種至96孔板中，并設空白組（使用完全培養基加入50%DMEM基礎培養基）、對照組（完全培養基加入50%DMEM基礎培養基培養M?24h后收集的培養基上清液）、實驗組（完全培養基加入50%DMEM基礎培養基培養24h經LPS預處理后的M培養基上清液），總體積為100μl/孔。培養腫瘤細胞3d后每孔加入10μl體系的CCK-8試劑，輕拍使其分散均勻，放入培養箱中繼續孵育，2h后酶標儀測定450nm波長處吸光度值（A值）。

1.4??流式細胞術檢測細胞周期

接種1×106個/孔腫瘤細胞于6孔板中，分組同上述CCK-8實驗。48h后收集細胞，離心棄上清液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate?buffered?saline，PBS）清洗兩遍，調整細胞濃度為2×106個/ml。取1ml單細胞懸液，離心棄上清液，在細胞中加入70%的冷乙醇1ml，4℃固定過夜。用PBS洗去固定液，加入提前配制好的400μl體系PI/RNaseA染色工作液，室溫避光30～60min內流式檢測。

1.5??流式細胞術檢測細胞凋亡

接種3×105個/孔腫瘤細胞于6孔板中，分組同上述CCK-8實驗。48h后收集細胞，離心棄上清液，PBS清洗兩遍，調整細胞濃度為2×105個/ml。取1ml單細胞懸液，2000轉/min離心3min，棄上清液；加入500μl體系Binding?Buffer重懸細胞，并加入5μl體系Annexin?V-FITC和5μl體系PI染色液充分混勻后，室溫避光孵育15min后流式檢測。

1.6??動物實驗

將小鼠隨機分為對照組和實驗組，使用小鼠腎癌Renca細胞系建立皮下移植瘤模型，待腫瘤體積生長至50mm3時瘤旁注射生理鹽水（100μl/只，???1次/2d）或LPS（100μg/只，1次/2d）。3周后處死小鼠，剝離腫瘤，測量腫瘤重量和體積，將腫瘤組織研磨制備成單細胞懸液，使用PE?anti-mouse-iNOS等抗體染色，采用流式細胞術檢測巨噬細胞M1型極化情況。

1.7??統計學方法

采用SPSS?16.0統計學軟件對數據進行處理分析。計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way?ANOVA）。P<0.05為差異有統計學意義。統計圖使用GraphPad?Prism?5軟件繪制。

2??結果

2.1??檢測LPS對腫瘤生長的影響

與對照組相比，實驗組小鼠腫瘤體積明顯縮小、體質量減輕（瘤旁注射LPS使腫瘤體積由對照組的1.691cm3下降至0.076cm3，P<0.001；腫瘤質量由對照組的0.671g降低至0.103g，P<0.001）。這說明瘤旁注射LPS可抑制腫瘤生長，見圖1。

2.2??檢測LPS對腫瘤相關巨噬細胞極化的影響

為探究LPS抑制腫瘤生長的原因，本研究對腫瘤相關M1型極化進行檢測。剝離小鼠腫瘤組織并經研磨制備成單細胞懸液，流式分析在F4/80（+）、CD11b（+）M中誘導型一氧化氮合酶（inducible?nitric?oxide?synthase，iNOS）的表達情況。實驗結果顯示，與對照組比較，實驗組小鼠的腫瘤相關M中iNOS表達比例增多（16.2%∶52.55%，P<0.001）。這說明LPS可通過誘導腫瘤相關M1型極化而增強其抗腫瘤功能，見圖2。

2.3??檢測LPS誘導M1型極化后對腫瘤細胞增殖的影響

為檢測LPS誘導M1型極化對腫瘤細胞增殖的影響，本研究收集M培養基上清液與Renca、ML-1細胞進行共培養實驗，研究M經LPS預處理后培養基上清液對腫瘤細胞增殖功能的影響。實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組的M培養基上清液顯著抑制腫瘤細胞生長（Renca細胞空白組A值為2.390；對照組A值為2.300；實驗組A值為1.235；P=0.023。ML-1細胞空白組A值為1.865；對照組A值為1.865；實驗組A值為1.280；P=0.045）。結果證明，LPS誘導M1型極化后可顯著抑制腫瘤細胞的增殖，見圖3。

2.4??檢測LPS誘導M1型極化對腫瘤細胞周期的影響

為檢測LPS誘導M1型極化抑制腫瘤細胞增殖的原因，本研究利用流式檢測腫瘤細胞的細胞周期。實驗結果顯示，與對照組比較，實驗組的M培養基上清液顯著誘導小鼠腫瘤細胞發生S或G0/G1期阻A.三組Renca腫瘤細胞增殖指標比較：CCK-8檢測Renca細胞增殖（空白組：含50%DMEM的基礎培養基；對照組：培養基中添加50%未經處理M的培養基上清液；實驗組：培養基中添加50%經LPS預處理M的培養基上清液）；B.三組ML-1腫瘤細胞增殖指標比較：CCK-8檢測ML-1細胞增殖（空白組：含50%DMEM的基礎培養基；對照組：培養基中添加50%未經處理M的培養基上清液；實驗組：培養基中添加50%經LPS預處理M的培養基上清液）滯，其中Renca細胞接受實驗組的M培養基上清液處理，S期比例與空白組（13.36%）或對照組（12.32%）相比增加至25.6%（P=0.022）；MC38細胞接受實驗組的巨噬細胞培養基上清液處理，G0/G1期比例與空白組（49.96%）或對照組（49.68%）相比增加至66.35%（P=0.011）；ML-1細胞接受實驗組的M培養基上清液處理，G0/G1期比例與空白組（54.69%）或對照組（55.33%）相比增加至64.8%（P=0.022）。表明LPS誘導M1型極化后可通過阻止腫瘤細胞周期進展而抑制細胞分裂，見圖4。

2.5??檢測LPS誘導M1型極化對腫瘤細胞凋亡的影響

為檢測LPS誘導M1型極化對腫瘤細胞凋亡的影響，本研究利用流式檢測腫瘤細胞的凋亡情況。實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組的M培養基上清液可顯著誘導腫瘤細胞凋亡，其中Renca細胞接受實驗組的M培養基上清液處理，凋亡細胞比例與空白組（6.57%）和對照組（6.80%）相比增加至13.87%（P=0.040）；ML-1細胞接受實驗組的M培養基上清液處理，凋亡細胞比例與空白組（2.80%）和對照組（4.12%）相比增加至17.42%（P=0.007）。結果表明，LPS誘導M1型極化后可顯著誘導腫瘤細胞凋亡，見圖5。

3&nbsp;?討論

LPS結構復雜性暗示該分子在細菌細胞中執行多種功能，作為細菌內毒素，其脂質A成分是免疫細胞識別的病原相關分子，可有效激活機體的先天免疫反應[10]。因此，LPS是一種重要的免疫激活劑，當LPS進入機體后首先激活M，誘導M1型極化，引起炎癥反應；而M1型具有直接抗腫瘤功能[11-13]。盡管對于LPS功能的研究已有很多，但LPS對腫瘤微環境中免疫細胞功能的影響仍有較多的爭論。

鑒于適應性免疫應答是機體殺傷腫瘤的直接途徑，研究調控適應性免疫應答的手段已成為當前腫瘤免疫治療研究的熱點[14]；但適應性免疫系統的激活依賴于先天性免疫應答[15]。在腫瘤發生的初始階段，腫瘤細胞首先逃避機體先天性免疫應答，因此先天性免疫應答對腫瘤進展具有重要作用。M作為先天性免疫細胞中最重要的細胞群之一，其功能具有重要的可塑性，而這種可塑性基于M的兩種亞型，即經典活化的M1型和選擇性活化的M2型。眾多研究者也利用該特性對M進行極化調控，因此在已發表的文章中并不缺乏利用各種途徑調控M免疫功能的研究，如通過使用一些益生菌菌株（如大腸桿菌、糞腸球菌共生菌群-1）或微生物感染和相關的副產物（如LPS和干擾素-γ）可激活M至M1表型以清除病原體，而另一些益生菌（如金黃色葡萄球菌、土拉弗朗西斯菌）可誘導M2發揮抗炎作用[16-21]。由于M是機體抵抗腫瘤的第一道防線，聯合其功能的可塑性，該領域研究有望給腫瘤的臨床治療帶來更多的希望。本研究發現，瘤旁注射誘導M1型極化的經典刺激物LPS可顯著抑制腫瘤的生長，流式分析發現LPS刺激誘導腫瘤相關M1型極化，說明LPS可通過誘導腫瘤相關M1型極化發揮抗腫瘤效果。

研究表明，LPS可通過誘導M分泌多種細胞因子，如惡病質素或腫瘤壞死因子從而達到殺傷腫瘤的作用[22-23]。因此本研究探究M經LPS預處理后的培養基上清液對多種腫瘤細胞增殖、周期及凋亡的影響，結果顯示LPS預處理的M培養基上清液可直接抑制腫瘤細胞增殖，引起細胞周期阻滯，并且誘導腫瘤細胞凋亡。該結果證實LPS可誘導M分泌抑制腫瘤增殖和存活的細胞因子。

綜上所述，本研究證明在抗腫瘤的復雜過程中，LPS誘導M1型極化后，使腫瘤細胞周期發生G0/G1或S期阻滯，抑制腫瘤細胞生長，且誘導腫瘤細胞凋亡，從而達到有效的抗腫瘤功能。該研究為LPS通過干預M1型極化發揮抗腫瘤功能提供部分細胞和動物水平的直接證據；LPS對于M調控其他免疫細胞抗腫瘤功能的影響及其機制有待進一步探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] GENTEK?R，?MOLAWI?K，?SIEWEKE?M?H.?Tissue?macrophage?identity?and?self-renewal[J].?Immunol?Rev，?2014，?262：?56–73.

[2] KADOMOTO?S，?IZUMI?K，?MIZOKAMI?A.?Macrophage?polarity?and?disease?control[J].?Int?J?Mol?Sci，?2021，?23（1）：?144.

[3] WU?K，?LIN?K，?LI?X，?et?al.?Redefining?tumor-associated?macrophage?subpopulations?and?functions?in?the?tumor?microenvironment[J].?Front?Immunol，?2020，?11：?1731.

[4] LI?P，?HAO?Z，?WU?J，?et?al.?Comparative?proteomic?analysis?of?polarized?human?THP-1?and?mouse?RAW264.7?macrophages[J].?Front?Immunol，?2021，?12：?700009.

[5] KNIREL?Y?A，?ANISIMOV?A?P，?KISLICHKINA?A?A，?et?al.?Yersinia?pseudotuberculosis?lipopolysaccharide?of?the?complex[J].?Biomolecules，?2021，?11（10）：?1410.

[6] PARK?B?S，?LEE?J?O.?Recognition?of?lipopolysaccharide?pattern?by?TLR4?complexes[J].?Exp?Mol?Med，?2013，?45（12）：?e66.

[7] PERVIN?M，?KARIM?M?R，?KURAMOCHI?M，?et?al.?Macrophage?populations?and?expression?of?regulatory?inflammatory?factors?in?hepatic?macrophage-depleted?rat?livers?under?lipopolysaccharide?（LPS）?treatment[J].?Toxicol?Pathol，?2018，?46（5）：?540–552.

[8] SHAPOURI-MOGHADDAM?A，?MOHAMMADIAN?S，?VAZINI?H，?et?al.?Macrophage?plasticity，?polarization，?and?function?in?health?and?disease[J].?J?Cell?Physiol，?2018，?233（9）：?6425–6440.

[9] ZHANG?W，?ZHANG?Y，?HE?Y，?et?al.?Lipopolysaccharide?mediates?time-dependent?macrophage?M1/M2?polarization?through?the?Tim-3/Galectin-9?signalling?pathway[J].?Exp?Cell?Res，?2019，?376（2）：?124–132.

[10] WANG?X?Y，?QUINN?P?J.?Lipopolysaccharide：?Biosynthetic?pathway?and?structure?modification[J].?Prog?Lipid?Res，?2010，?49（2）：?97–107.

[11] JEWORREK?C，?EVERS?F，?HOWE?J，?et?al.?Teasing?half-bilayers：?LPS?versus?phospholipid?monolayers，?mechanics，?asymmetry?and?implications?for?drug?permeation[J].?Biophys?J，?2011，?100（9）：?2169–2177.

[12] COLEMAN?D?L，?CULVER?K?E，?RYAN?J?L.?Effect?of?lipopolysaccharide?on?the?stimulation?of?macrophage?Fc-dependent?phagocytosis?by?splenic?B?lymphocytes[J].?Cell?Immunol，?1985，?91（2）：?520–527.

[13] ZANONI?I，?GRANUCCI?F.?Differences?in?lipopolysaccharide-induced?signaling?between?conventional?dendritic?cells?and?macrophages[J].?Immunobiology，?2010，?215（9-10）：?709–712.

[14] SUN?L，?WANG?X，?SAREDY?J，?et?al.?Innate-adaptive?immunity?interplay?and?redox?regulation?in?immune?response[J].?Redox?Biol，?2020，?37：?101759.

[15] VESELY?M?D，?KERSHAW?M?H，?SCHREIBER?R?D，?et?al.?Natural?innate?and?adaptive?immunity?to?cancer[J].?Annu?Rev?Immunol，?2011，?29：?235–271.

[16] GORDON?S.?The?macrophage[J].?Bio?Essays，?1995，?17（11）：?977–986.

[17] YU?Y，?YUE?Z，?XU?M，?et?al.?Macrophages?play?a?key?role?in?tissue?repair?and?regeneration[J].?Peer?J，?2022，?10：?e14053.

[18] ESSANDOH?K，?LI?Y，?HUO?J，?et?al.?MiRNA-mediated?macrophage?polarization?and?its?potential?role?in?the?regulation?of?inflammatory?response[J].?Shock，?2016，?46（2）：?122–131.

[19] WANG?Y，?LIU?H，?ZHAO?J.?Macrophage?polarization?induced?by?probiotic?bacteria：?A?concise?review[J].?Probiotics?Antimicro，?2020，?12（3）：?798–808.

[20] VERDEGUER?F，?AOUADI?M.?Macrophage?heterogeneity?and?energy?metabolism[J].?Exp?Cell?Res，?2017，?360（1）：?35–40.

[21] SCHUMANN?J.?It?is?all?about?fluidity：?Fatty?acids?and?macrophage?phagocytosis[J].?Eur?J?Pharmacol，?2016，?785：?18–23.

[22] WHITE?J?R，?CHAIT?A，?KLEBANOFF?S?J，?et?al.?Bacterial?lipopolysaccharide?reduces?macrophage?lipoprotein?lipase?levels：?An?effect?that?is?independent?of?tumor?necrosis?factor[J].?J?Lipid?Res，?1988，?29（10）：?1379–1385.

[23] OKRUHLICOVA?L，?CICAKOVA?Z，?FRIMMEL?K，?et?al.?Lipopolysaccharide-induced?redistribution?of?myocardial?connexin43?is?associated?with?increased?macrophage?infiltration?in?both?normotensive?and?spontaneously?hypertensive?rats[J].?J?Physiol?Pharmacol，?2018，?69（5）：?709–717.

（收稿日期：2023–02–16）

（修回日期：2023–12–12）

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