全基因組測序技術(shù)在結(jié)核病中的應(yīng)用進展

鄭婷婷 向菲

[摘要]?全基因組測序是高通量測序技術(shù)，因偏倚小、成本不斷降低等優(yōu)勢而廣泛應(yīng)用于疾病的臨床診斷和研究中。近年來，結(jié)核病帶給全球公共衛(wèi)生的壓力不容小覷。目前，全基因組測序技術(shù)在結(jié)核病診斷、耐藥性檢測、致病機制研究及其傳播防控等方面面臨諸多挑戰(zhàn)。本文闡明全基因組測序技術(shù)在結(jié)核病中的最新應(yīng)用進展。

[關(guān)鍵詞]?結(jié)核病；全基因組測序；耐藥結(jié)核病；結(jié)核分枝桿菌

[中圖分類號]?R52????[文獻標識碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.03.026

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是一種十分常見的慢性傳染病，其致病病原體是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium?tuberculosis，MTB），可通過氣溶膠傳播。《2022年全球結(jié)核病報告》[1]顯示，截至2021年全球TB的患病人數(shù)仍有1000萬人，同時有>160萬例TB患者因此死亡。受菌株變異及感染人數(shù)增加等影響，臨床逐漸出現(xiàn)耐多藥結(jié)核病（multidrug?resistant?tuberculosis，MDR-TB）等TB患者，進一步加重全球公共衛(wèi)生的壓力。提高MDR-TB的檢出率、阻斷其傳播、研發(fā)新藥和疫苗等變得更為迫切。

1998年，Cole等[2]公布了MTB菌株H37Rv包含的約440萬個堿基對和4000個基因在內(nèi)的完整基因組序列，加深了人們對MTB的認識。2017年，英國成為全球第一個應(yīng)用全基因組測序（whole?genome?sequencing，WGS）技術(shù)在全國范圍內(nèi)開展MTB診斷、耐藥性檢測、菌株鑒定和分型的國家[3]。Walker等[4]發(fā)布了第一個被世界衛(wèi)生組織（World?Health?Organization，WHO）認可的13種抗TB藥物的基因組突變目錄。

1??MTB與基因組測序

在第一種脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic?acid，DNA）測序技術(shù)出現(xiàn)后的20多年中，基因組學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展。下一代測序（next-generation?sequencing，NGS）技術(shù)應(yīng)運而生。2021年，Athanasopoulou等[5]提出第三代測序技術(shù)，其具有長讀取、高速度、短用時等優(yōu)勢，可彌補NGS的部分缺陷，但其應(yīng)用亦受到技術(shù)和成本的限制。

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體（Mycobacterium?tuberculosis?complex，MTBC）的宏基因組測序包括樣本準備（樣本去污提純、培養(yǎng)、提取細菌DNA）、制備文庫、讀取序列及數(shù)據(jù)分析等流程[6]。目前，WGS的工作流程尚未標準化，用于MTBC-WGS分析的自動化管道有MTBseq、UVP等，其可快速調(diào)用單核苷酸多態(tài)性（single?nucleotide?polymorphism，SNP），在短時間內(nèi)分析大量的MTBC基因組數(shù)據(jù)。ILLumina?MiSeq及Nanopore?MinION等測序儀可應(yīng)用于WGS。DNA納米孔測序更為便攜，價格合理，耗時較短，且可讀取長度為150kb序列[7]。

2??WGS在TB中的應(yīng)用

2.1??WGS在TB診斷和耐藥性檢測中的應(yīng)用

在既往研究中，TB診斷多依賴于傳統(tǒng)細菌學(xué)證據(jù)。WHO建議用篩查的方法發(fā)現(xiàn)TB高危人群，人工智能等新型技術(shù)手段已用于改善TB診斷的影像學(xué)方法中[8]。診斷技術(shù)的更迭與進步更多地發(fā)生于分子診斷方面，具有高度特異性和敏感度的核酸擴增試驗徹底改變既往的診斷格局。WHO推薦常用的TB診斷方法包括線性探針檢測、GeneXpert?MTB/RIF檢測技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測及WGS等[9]。

WGS被認為是具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ姆肿釉\斷方法，其較常規(guī)診斷方法的速度更快。Votintseva等[10]研究推測，應(yīng)用WGS技術(shù)有望于24h內(nèi)確診患者是否為TB。一項多中心、前瞻性研究表明，基于WGS技術(shù)的實驗室診斷成本較常規(guī)診斷的費用少7%[11]。但為獲取足夠數(shù)量的細菌，在行WGS前還需對臨床標本進行細菌培養(yǎng)，從而限制了其應(yīng)用。新型靶向基因組測序技術(shù)可直接對臨床樣本進行分析，無需培養(yǎng)檢測，縮短中位周轉(zhuǎn)時間[12]。但該過程并未實現(xiàn)標準化，僅限于已知的抗性標志物。

MTB對多數(shù)抗生素具有天然抗性。除原發(fā)高水平抗生素耐藥性外，還有繼發(fā)新獲得突變導(dǎo)致的抗生素耐藥機制，包括基因突變、藥物外排泵、降解修飾、細胞包膜的非滲透性、靶點的改變和模擬等[13]。一線分子診斷方法GeneXpert?MTB/RIF僅可檢測利福平的耐藥性、識別DNA突變，識別特定耐藥突變的數(shù)量有限[14]。

在MTB基因組數(shù)據(jù)的支持下，WGS可篩選出所有與其表型耐藥性相關(guān)的決定性突變因素。研究表明，WGS檢測抗結(jié)核藥物的敏感度在80%以上，而表型藥物的敏感度則不到80%[15]。Papaventsis等[16]研究顯示，WGS對利福平檢測的敏感度和特異性相似，略高于異煙肼。Wang等[17]研究指出，WGS在預(yù)測一線抗結(jié)核藥物方面較二線藥物具有更高的敏感度和特異性，但WGS可能無法檢測出尚未確定和新出現(xiàn)的突變。楊婷婷等[18]的研究構(gòu)建基于WGS數(shù)據(jù)分析和共享的耐藥和傳播監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)、建立SAM-TB平臺，對17種抗結(jié)核藥物的耐藥性進行預(yù)測并分析遺傳關(guān)系，優(yōu)化人們對于易感及耐藥TB患者的管理。Huang等[19]對357株MDR-TB進行WGS，提供迄今為止最全面的18種抗結(jié)核藥物的藥物敏感度測試結(jié)果。

2.2??WGS在MTB致病機制研究中的應(yīng)用

MTB可持續(xù)存在于機體內(nèi)，雖臨床癥狀多不明顯，但會使機體不斷地產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這稱為潛伏性結(jié)核感染，是活動性TB孵化的溫床。Penn-?Nicholson等[20]目前正在開展可預(yù)測潛伏性結(jié)核感染進展為活動性TB的生物學(xué)標志物的相關(guān)研究。越來越多的研究開始致力于通過全基因組轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法揭示MTBC與人宿主間復(fù)雜的免疫反應(yīng)。

基因組學(xué)的比較分析有助于增強人們對MTB致病機制的理解。目前，MTBC包含7種與人類關(guān)系密切的地理分布不同譜系[21]。通過比較MTBC完整基因組序列與其近親海洋分枝桿菌發(fā)現(xiàn)，MTBC是從祖先的環(huán)境分枝桿菌進化而來的，經(jīng)歷廣泛的橫向基因轉(zhuǎn)移，最終成為人類和某些其他哺乳動物的特殊致病病原體[22]。＞0.5kb的多態(tài)性區(qū)域被定義為差異區(qū)域或“RD”位點，其缺失可能與細菌毒力喪失有關(guān)，這是卡介苗基因組毒力衰減的基礎(chǔ)[23]。

卡介苗是目前唯一獲得許可的TB疫苗，雖其可使兒童播散性TB在一定程度上獲得控制，但其在青少年及成人TB中收效甚微。研究發(fā)現(xiàn)，標記轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)可識別和篩選MTB菌株在感染過程中減毒表型的突變體[24]。轉(zhuǎn)座子測序技術(shù)將轉(zhuǎn)座子誘變和基因組測序結(jié)合起來，嘗試探索MTB生存所必需的基因[25]。突變體將轉(zhuǎn)座子插入染色體中編碼參與特定脂質(zhì)合成和運輸酶的70kb片段中，這些脂質(zhì)成分通過限制和規(guī)避巨噬細胞中的自噬途徑使MTB獲得持續(xù)性生長[26]。應(yīng)用轉(zhuǎn)座子定點雜交技術(shù)可確定MTB感染多個階段生長所需的194個候選基因[27]。

MTB代謝基因組學(xué)研究表明，脂肪酸的分解、賴氨酸和亮氨酸的合成、鐵的合成、碳循環(huán)等均與菌株體內(nèi)感染相關(guān)，脂質(zhì)和氨基酸是MTB的營養(yǎng)來源[28]。另有研究證實，MTB主要通過阻斷吞噬體成熟、酸化及溶酶體融合、降解蛋白酶體等途徑實現(xiàn)宿主體內(nèi)的持續(xù)感染[29]。

2.3??WGS在TB傳播和防控中的應(yīng)用

WGS已成功應(yīng)用于MTBC分離株的研究中。與傳統(tǒng)檢測方法相比，WGS可提供MTB的菌株分型及耐藥性等方面的全面數(shù)據(jù)，從而可利用WGS識別TB在人群中的傳播情況，包括社區(qū)、學(xué)校、國家甚至是國際疫情暴發(fā)環(huán)境中[30]。

在分子流行病學(xué)層面，TB主要應(yīng)用基于聚合酶鏈反應(yīng)的標準化基因分型方法，即將24位點分枝桿菌散在分布重復(fù)單元-可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（Mycobacterial?interspersed?repetitive?unit-variable?number?tandem?repeat，MIRU-VNTR）和間隔寡核苷酸分型相結(jié)合[31]。與標準IS6110限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)相比，MIRU-VNTR的速度更快，所需DNA樣本量更少，但二者的分辨力相差不大。然而有臨床研究表明，MIRU-VNTR對基因組密切相關(guān)（即遺傳距離在0～5個SNP以內(nèi)）的菌株預(yù)測能力較差[32]。

與傳統(tǒng)標準化基因分型方法相比，WGS可更好地預(yù)測TB的傳播事件，特別是在確定TB傳播范圍方面；它能進一步劃分MIRU-VNTR等傳統(tǒng)基因組方法分離出的簇，在一定程度上減少漏診病例的發(fā)生[33]。與此同時，WGS在分化復(fù)發(fā)和再感染病例中也具有較高的效率[34]。Jajou等[35]研究表明，在對分離株進行基因分型時，WGS與傳統(tǒng)方法的一致性為86%，而WGS確定的流行病學(xué)相關(guān)性卻是傳統(tǒng)基因分型方法的2倍。WGS在識別與流行病學(xué)相關(guān)的MTB分離株方面的敏感度較高，在部分研究中可達100%，但特異性與環(huán)境相關(guān)[36]。這一結(jié)論在另一項研究中得到證實[37]。因此，更推薦將WGS應(yīng)用于TB發(fā)病率較低的環(huán)境中。

WGS還可鑒定不同菌株之間的SNP，有助于排除虛假傳播事件，確定患者之間MTB的傳播方向[38]。同時，利用基于SNP的方法可進行譜系和基因分型分析，進一步探索MTBC的多樣性。但因無法利用WGS對基因組的重復(fù)區(qū)域進行準確分析，WGS的數(shù)據(jù)分析仍存在一定的變異性。TB低負擔(dān)環(huán)境相關(guān)研究認為，最近的傳播是由5個或更少的SNP距離引起的。但在高TB發(fā)病率和耐藥TB流行環(huán)境中，由于在正選擇壓力下的基因位點具有更高突變率，導(dǎo)致WGS在獲得耐藥性的患者之間觀察到的SNP數(shù)量大于預(yù)期[39]。同時，Nelson等[40]研究推測，WGS可能無法明確患者是否可歸因于近期傳播。

一項來自中國上海的人群層面的TB相關(guān)研究，應(yīng)用WGS和流行病學(xué)方法評估324例患者MDR-TB分離株的近期傳播情況，描述MDR-TB的傳播模式，構(gòu)建耐多藥菌株的傳播網(wǎng)絡(luò)[41]。Jiang等[42]描述深圳地區(qū)MDR-TB的傳播情況，結(jié)果顯示學(xué)校和工作場所是應(yīng)當(dāng)被重視的TB篩查區(qū)域。

3??前景和挑戰(zhàn)

在基因組測序中，目前建立的TB相關(guān)測序數(shù)據(jù)平臺包括MUBII-TB-DB、TBDReaMDB、ReSeqTB等。這些平臺可匯總?cè)蛳嚓P(guān)的基因組和表型信息，用戶可直接獲取與MTB相關(guān)的元數(shù)據(jù)，促進TB診斷和監(jiān)測，指導(dǎo)TB的國際化管理。Pan等[43]建立基于WGS的信息傳輸分析管道TransFlow，其建立在Snakemake工作流程引擎之上，具有全面高效、用戶友好、簡便易用、可視化等特點。WGS平臺的建立需要大量的人力、物力和財力資源，以滿足基礎(chǔ)設(shè)施等建設(shè)需求。這些都對低收入和中等收入國家提出了前所未有的挑戰(zhàn)。

WGS在臨床中的應(yīng)用主要受限于高昂的測序價格及結(jié)果分析缺乏統(tǒng)一的解釋標準。另外，WGS需從臨床樣本中培養(yǎng)并分離病原體，從周轉(zhuǎn)時間看，尚無法完全替代常規(guī)微生物學(xué)方法。WGS對治療效果的改善及基因型和表型間的一致性缺乏數(shù)據(jù)驗證。因此，實現(xiàn)從實驗室到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化任重道遠，需要開展更多的研究以評估其性能和可用性。未來，應(yīng)在優(yōu)化測序流程、降低測序成本和周轉(zhuǎn)時間、開發(fā)更多端到端的用戶友好型測序分析管道等方面為之努力。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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