蘋(píng)果枝烘烤雞蛋的理化性質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)和蛋白組成的變化研究

周 寧, 韓東晶, 王志花, 汪文君, 楊少華, 劉國(guó)慶

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

雞蛋營(yíng)養(yǎng)成分豐富,不僅包括蛋白質(zhì)和脂類(lèi),還包括硫胺素、核黃素、維生素A、B、D、E等多種維生素和鈣、磷、鉀、鈉、鎂、鐵、鋅等礦物質(zhì)[1]。雞蛋是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和必需營(yíng)養(yǎng)素的主要來(lái)源,它提供許多理想的功能屬性,如發(fā)泡、乳化、凝膠、著色、調(diào)味[2],有助于食品的質(zhì)地特性。我國(guó)是消費(fèi)雞蛋最多的國(guó)家,但目前消費(fèi)形式單一,對(duì)雞蛋制品的深度加工程度較低。蛋制品的種類(lèi)并不豐富,在中國(guó)餐桌上受歡迎是傳統(tǒng)的蛋制品,如皮蛋、咸蛋、酒蛋等。這些蛋制品耗時(shí)長(zhǎng),用強(qiáng)堿腌制會(huì)導(dǎo)致皮蛋中大量賴(lài)氨酸、丙氨酸等的形成,降低蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,對(duì)人體健康造成潛在的危害[3]。為了延長(zhǎng)加工雞蛋的貨架期,同時(shí)提高其利用價(jià)值,亟待探索新的雞蛋加工方法和工藝。

蘋(píng)果枝條富含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,除此之外還含有多酚類(lèi)化合物,其中蘋(píng)果多酚具有抗氧化、保鮮、抗腫瘤等功效。酚類(lèi)化合物易與蛋白質(zhì)結(jié)合并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,從而改變蛋白凝膠的物理性質(zhì)[4],修剪后的蘋(píng)果枝條作為農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物,經(jīng)常被丟棄或焚燒,從而造成寶貴資源的浪費(fèi),甚至污染環(huán)境[5]。為促進(jìn)果園廢棄物的資源綜合化利用,本文利用蘋(píng)果枝烘烤雞蛋(apple branches treated baked eggs,ATBE),同時(shí)對(duì)成品蛋的品質(zhì)特性、微觀結(jié)構(gòu)及組分分析進(jìn)行研究,為蛋制品加工工藝方法的拓展和農(nóng)業(yè)廢棄物的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雞蛋(50～60 g)購(gòu)于合肥市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)大潤(rùn)發(fā)超市;蘋(píng)果枝條購(gòu)于陜西咸陽(yáng);無(wú)水乙醇、甲醇、2.5%的戊二醛、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、光譜級(jí)溴化鉀(KBr)均購(gòu)于阿拉丁試劑(上海)有限公司。

多功能粉碎機(jī)(永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司);GZX-9030MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);H/T16MM臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司);Vertex70型傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)(德國(guó)布魯克公司);TAXTplus物性測(cè)試儀(英國(guó)Stable公司); FD-1-50 Plus真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);Agilent HP7890-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫科技公司);F98熒光分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司);SU8020冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope,FESEM)(日本); UltiMate 3000 RS色譜儀、Q Exactive 高分辨質(zhì)譜儀(high-resolution mass spectrometry,HRMS)(賽默飛世爾科技有限公司;JP-040S超聲波清洗器(深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司);磁力加熱攪拌器(德國(guó)IKA公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 烤雞蛋的準(zhǔn)備

將曬干的蘋(píng)果枝條使用多功能粉碎機(jī)粉碎,過(guò)40目篩子。將新鮮雞蛋清洗干凈,用如下方法得到2種雞蛋:在食品級(jí)燒杯里放入雞蛋和蘋(píng)果枝條粉末于烘箱100 ℃烘烤數(shù)小時(shí),即蘋(píng)果枝烤雞蛋ATBE;將放在食品級(jí)燒杯里的雞蛋置于烘箱100 ℃烘烤數(shù)小時(shí),即烘烤蛋(baked eggs,BE)。2種雞蛋都在烘箱里烘烤12～20 h,每隔2 h取出樣品。

1.2.2 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

使用TAXTplus 物性測(cè)試儀測(cè)定[6],但略有修改。烘烤的雞蛋樣品用手術(shù)刀切成立方體(10 mm×10 mm×10 mm),進(jìn)行質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis,TPA)。用壓縮P/36R圓柱探針圓柱形探頭將制備好的樣品壓縮2次,壓縮比為 60%,觸發(fā)力為5 g,環(huán)境溫度為25 ℃,測(cè)試前、后速度分別為1.0、2.0 mm/s,恢復(fù)時(shí)間為5 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次,取其平均值。

1.2.3 蛋殼的微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定

按照文獻(xiàn)[7]測(cè)定烘烤雞蛋蛋殼的微觀結(jié)構(gòu)。分別取BE、ATBE的半個(gè)蛋殼,把蛋殼膜撕掉,用蒸餾水清洗每片蛋殼的內(nèi)外表面,放在紅外干燥燈下至干燥;用手術(shù)刀沿垂直于蛋殼表面切取長(zhǎng)約50 mm、寬30 mm的塊狀樣品,將其用導(dǎo)電膠粘于樣品臺(tái)上,噴金后放在電鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.2.4 蛋白的微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8],取BE、ATBE中間部分的蛋白,將凝膠樣品中心部位切成小塊,用2.5%的戊二醛溶液浸泡固定,4 ℃條件下放置4 h。固定好的樣品在室溫條件下用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L、pH值為7.0)漂洗3 次,每次10 min,分別將其用體積分?jǐn)?shù)梯度為10%、30%、50%、70%、90%、100%(2次)每次5～10 min的乙醇溶液進(jìn)行逐級(jí)脫水,脫水過(guò)程中輕微搖晃,脫水后的樣品凍干。干燥后的樣品用導(dǎo)電雙面膠固定到樣品臺(tái)上,經(jīng)濺射儀噴金后拍照觀察。

1.2.5 熒光光譜測(cè)定

使用8-苯基-1-萘磺酸熒光探針?lè)椒y(cè)定雞蛋白蛋白質(zhì)樣品的表面疏水性,在文獻(xiàn)[9]研究的基礎(chǔ)上,用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L、pH值為7.0)分別將樣品稀釋到0.5 mg/mL,熒光探針稀釋到8 mmol/L,然后取20 μL的熒光探針加入到4 mL樣品稀釋液中。在黑暗中,25 ℃下孵育15 min,在25 ℃下進(jìn)行熒光掃描。 激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)定為380 nm和400～600 nm。發(fā)射和激發(fā)波長(zhǎng)的狹縫均為5 nm。

1.2.6 FTIR

在紅外干燥燈下將干燥的1 mg雞蛋白粉末與200 mg純KBr在瑪瑙研缽中充分研磨,在壓片機(jī)上壓成透明薄片,以空氣為背景,在分辨率為4 cm-1,掃描32次,在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)測(cè)定其紅外光譜。

1.2.7 蛋白的化學(xué)物質(zhì)測(cè)定

1.2.7.1 樣品處理

稱(chēng)量?jī)龈珊蟮臉颖炯s200 mg,加入 1 mL的甲醇和1 mL的水,渦旋混勻。加入 2～3 顆二氧化鋯研磨珠,研磨提取 3 min;4 ℃條件下離心10 min,上清液用 0.22 μm 濾膜過(guò)濾,取濾液上機(jī)分析。

1.2.7.2 條件

1) 質(zhì)譜條件。電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)的電壓為3.8 kV,毛細(xì)管溫度為300 ℃,采用正負(fù)離子切換掃描,掃描范圍為100.0～1 500.0 m/s,檢測(cè)方式Full Mass/dd-MS2。碰撞氣為高純氬氣(純度≥99.999%);鞘氣為氮?dú)?純度≥99.999%),相對(duì)壓力為40;輔助氣為氮?dú)?純度≥99.999%),350 ℃。數(shù)據(jù)采集時(shí)間為30 min。

2) 色譜條件。色譜柱為RP-C18 150 mm×2.1 mm,1.8 μm),檢測(cè)方式為Full Mass/dd-MS2,流速為0.30 mL/min,水相為0.1%甲酸水溶液,有機(jī)相為0.1%甲酸乙腈,洗針液為甲醇,柱溫箱溫度為35 ℃,自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為10 ℃,進(jìn)樣針高度為2.00 mm,自動(dòng)進(jìn)樣器清洗設(shè)置為Both,自動(dòng)進(jìn)樣器洗針體積為200.00 μL。自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)針清洗時(shí)浸泡時(shí)間為3.00 s,自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣體積為5.00 μL。高分辨液質(zhì)采集的數(shù)據(jù)通過(guò) CD 2.1(Thermo Fisher)完成數(shù)據(jù)初步整理后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)(mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)、 mzVault數(shù)據(jù)庫(kù)、 ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù))。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,并利用SPASS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,采用ANOVA進(jìn)行不同試驗(yàn)組間的鄧肯差異分析(P<0.05),采用Origin 2019軟件繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白的質(zhì)構(gòu)分析

蛋白凝膠從8～20 h的質(zhì)構(gòu)變化如圖1所示。從圖1可以看出,隨著烘烤時(shí)間的延長(zhǎng),BE和ATBE硬度迅速增加(P<0.05),分別從3 272.23、2 530.05 增加到5 346.49、4 659.64,與BE相比,蘋(píng)果枝使蛋白硬度降低(P<0.05)。 彈性反映產(chǎn)品在第1次壓縮變形后的物理回彈情況,BE和ATBE在烘烤過(guò)程中彈性先升高再緩緩降低,在16 h后,BE和ATBE的彈性基本保持一致。說(shuō)明蘋(píng)果枝對(duì)蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生了影響,與BE相比,在16 h前蛋白的彈性增加(P> 0.05),說(shuō)明蛋白之間的相互作用增強(qiáng)。高彈性說(shuō)明蛋白聚集程度高、凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[10]緊密。因此16 h的蛋白具有良好的硬度、彈性和相對(duì)優(yōu)良的食用性能,與文獻(xiàn)[11]的結(jié)論一致。

圖1 蛋白的硬度和彈性變化

2.2 雞蛋微觀結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)FESEM可以觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu),BE、ATBE蛋殼的FESEM圖如圖2所示。從圖2可以看出,兩者氣孔的數(shù)目均很多,但是圖2b相比圖2a,蛋殼的外觀結(jié)構(gòu)更疏松多孔,可能在持續(xù)高溫下,蘋(píng)果枝里的部分多酚酸類(lèi)物質(zhì)與雞蛋殼中的碳酸鈣發(fā)生反應(yīng),腐蝕蛋殼,使蛋殼表面變得稀松多孔。BE、ATBE蛋白的FESEM如圖3所示,從圖3a可以看出,蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)連續(xù)性差,不均勻。從圖3b可以看出,蛋白凝膠結(jié)構(gòu)更致密規(guī)則,間隙小,較光滑,形成細(xì)凝膠束。這可能是由于蘋(píng)果多酚含有的活性羥基與蛋白主鏈或側(cè)鏈上的活性基團(tuán)發(fā)生了交聯(lián)作用,增強(qiáng)了氫鍵進(jìn)而形成更加均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)越均勻致密,其凝膠性越好,這與文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)果一致。FESEM顯示出一些顆粒狀的物質(zhì),這可能是天然物質(zhì)(蘋(píng)果多酚)與蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)果。

圖2 BE、ATBE蛋殼的FESEM圖

圖3 BE、ATBE蛋白的FESEM圖

2.3 表面疏水性變化分析

蛋白的表面疏水性如圖4所示。

圖4 蛋白的熒光光譜圖

蘋(píng)果枝處理后蛋白的表面疏水性降低,表明蛋白質(zhì)發(fā)生聚集,這種聚集保護(hù)了蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域,這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于添加了蘋(píng)果枝雞蛋白的蛋白質(zhì)被展開(kāi),暴露出蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水氨基酸殘基[13]。部分暴露的疏水氨基酸通過(guò)疏水鍵與多酚交聯(lián)或蛋白質(zhì)重新聚合[14]。此外,蛋白質(zhì)的聚合和蛋白質(zhì)與多酚的交聯(lián)可以產(chǎn)生更多的大分子,這些大分子的聚集有助于增強(qiáng)凝膠結(jié)構(gòu),這也是ATBE凝膠強(qiáng)度增加的原因。

2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)FTIR分析蘋(píng)果枝對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖5所示,圖5中不同字母表示顯著性差異。

圖5 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

在3 200～3 400 cm-1的特征吸收波段分別是—OH和—CH基團(tuán)的伸縮振動(dòng)[15]。蛋白在3 200～3 400 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,ATBE比BE的吸收峰更高、更寬,說(shuō)明分子間和分子內(nèi)存在較強(qiáng)的氫鍵。使用PeakFit 4.12軟件對(duì)蛋白在酰胺Ⅰ波段(1 700～1 600 cm-1)的FTIR光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正、高斯反褶積和二階導(dǎo)數(shù)擬合。FTIR通常根據(jù)蛋白質(zhì)在酰胺Ⅰ區(qū)(1 700～1 600 cm-1)的吸收情況對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類(lèi)。峰分布如下[16]:1 600～1 640 cm-1為β-折疊;1 640～1 650 cm-1為無(wú)規(guī)卷曲;1 650～1 660 cm-1為α-螺旋;1 660～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角。ATBE的β-折疊所占百分比最高,其次是β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲,而B(niǎo)E的β-轉(zhuǎn)角所占百分比最高。ATBE和BE的無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋基本上不變。ATBE相比BE,β-折疊顯著增加(P<0.05),β-轉(zhuǎn)角(P<0.05)顯著降低。β-折疊結(jié)構(gòu)表明強(qiáng)大的氫鍵相互作用,這是維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要力量,其含量增加表明分子間氫鍵作用增強(qiáng)[17],導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間聚集程度增加。在簡(jiǎn)單持續(xù)的高溫和蘋(píng)果枝共同作用下,β-折疊有助于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)和彈性,使凝膠結(jié)構(gòu)更加致密。綜上所述,蘋(píng)果枝能使蛋白的凝膠結(jié)構(gòu)更緊湊和富有彈性。這一變化充分說(shuō)明蘋(píng)果枝對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的影響。

2.5 蛋白化學(xué)成分測(cè)定

每組樣本的數(shù)據(jù)由正電離模式中超高效液相色潽-四極桿-靜電場(chǎng)軌道井高分辨質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap high-resolution mass spectrometry,UPLC-Q-Orbitrap HRMS)系統(tǒng)獲得。ATBE和BE分別檢測(cè)到146、85個(gè)物質(zhì)。其中有59種雞蛋所共有的物質(zhì),87個(gè)與對(duì)照組顯著不同,根據(jù)峰的精確質(zhì)量和碎片模式,結(jié)合文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定,篩選出蛋白化學(xué)成分的多酚化合物,見(jiàn)表1所列。

表1 蛋白多酚類(lèi)物質(zhì)的UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

蘋(píng)果多酚主要由黃酮類(lèi)化合物、黃酮酚、異黃酮、二羥基葡聚糖和其他酚醛酸組成[18]。根皮素是蘋(píng)果多酚普遍存在的一種天然二氫查爾酮類(lèi)黃酮,主要分布于蘋(píng)果、梨等多汁果皮或根皮中。根皮素具有多種藥理特性,如抗糖尿病、抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性[19]。

通過(guò)分析FESEM、表面疏水性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,推測(cè)蛋白中的多酚是多酚進(jìn)入蛋白并與蛋白結(jié)合,從而對(duì)蛋白產(chǎn)生了影響。

3 結(jié) 論

在蘋(píng)果枝的存在下,烘烤雞蛋的理化性質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)和蛋白組成發(fā)生了顯著變化。與蘋(píng)果枝共同烘焙,可以有效改善雞蛋的質(zhì)地,使雞蛋的彈性增加,硬度下降,蛋白凝膠變得光滑致密。在烘焙過(guò)程中,ATBE的蛋殼氣孔數(shù)量增加,多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入蛋白中,表面疏水性降低以及氫鍵作用增強(qiáng),該現(xiàn)象表明蘋(píng)果枝中的多酚酸等活性物質(zhì)通過(guò)蛋殼孔和蛋殼膜進(jìn)入雞蛋中,通過(guò)氫鍵和疏水作用與雞蛋中的蛋白質(zhì)結(jié)合,促進(jìn)了蛋白的聚集。本文的研究為蘋(píng)果多酚在食品中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),提高了蘋(píng)果多酚的功能性和適用性。