MiR-92a-3p靶向KLF4促進肝細胞癌惡性進程

蔡青山, 鄭建興, 申月玲, 吳東洋, 李樹棟, 劉立友, 劉 東

(1.河北省唐山市中心醫院肝膽外科, 河北 唐山 063000 2.河北省遷安市人民醫院耳鼻喉科, 河北 遷安 064499)

肝癌是一種常見的癌癥類型,在現代醫學中受到廣泛關注[1]。據統計,2020年全球有超過80萬人因肝癌死亡,占因癌癥死亡人數的8.3%,僅次于肺癌[2]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝癌,約占肝癌病例的 90%[3]。盡管在肝癌的免疫治療等治療方法的研究和臨床應用取得了一些進展,但HCC患者的預后仍然不盡人意,復發率較高[4]。因此,了解HCC的分子機制對于尋找新的診斷和治療策略來改善HCC患者的整體預后至關重要。MicroRNAs(miRNA)是一類長為19-25個核苷酸的內源性非編碼RNA。根據完全或部分互補配對,miRNA通過靶向mRNA的3’-非翻譯區(UTR)抑制靶向mRNA的表達[5]。大量研究表明,miRNA在不同的生物過程中起著重要作用,在包括癌癥在內的各種疾病中都發現了miRNA的異常表達。miR-92a-3p可通過調節KLF2/BIRC5軸促進乳腺癌的增殖[6]。研究miR-92a-3p在HCC中的作用機制對于尋找HCC治療靶點和預后標志物有重大意義。本研究通過生物信息學方法分析miR-92a-3p的靶基因,并體外培養人HCC細胞系,通過細胞功能學實驗研究miR-92a-3p與其靶基因在HCC中的作用,旨在探究miR-92a-3p對HCC的影響以及分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑:人肝細胞癌細胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B和人正常肝細胞系HL-7702均購自中國北納生物。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自中國Transgen公司;青霉素-鏈霉素、DMEM培養基、Trizol試劑、mirVana miRNA分離試劑盒、結晶紫均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT Master Mix、Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit均購自日本Takara公司;SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒購自德國QIAGEN公司;一抗KLF4(ab215036)、β-actin(ab213262)、二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6721)均購自英國Abcam公司;ECL試劑盒購自中國碧云天公司;MTT溶液購自中國索萊寶公司;二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司;pmirGLO、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養和轉染:人肝細胞癌細胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B和人正常肝細胞系HL-7702均用含有10% FBS、100 IU/mL 青霉素和100 IU/mL 鏈霉素的DMEM培養基,置于含5% CO2的37 ℃孵育箱中進行培養。pcDNA3.1-KFL4(pcDNA3.1作為對照)、miR-92a-3p mimic、miR-92a-3p inhibitor以及相應的陰性對照購自加拿大ABM公司。使用Lipofectamine 2000試劑轉染目標質粒到SMMC-7721和Bel-7402細胞系中,分組為Inhibitor NC組、miR-92a-3p Inhibitor組、mimic NC組、miR-92a-3p mimic組、mimic NC+oe-NC組、mimic NC+oe-KLF4組、miR-92a-3p mimic +oe-NC組、miR-92a-3p mimic +oe-KLF4組。細胞在相應的培養基中,在5% CO2和37 ℃的培養條件下培養備用。

1.2.2實時熒光定量PCR(Reverse transcription-quantitative PCR,qRT-PCR):為了分析HCC細胞系中的基因和miRNA表達水平,使用Trizol試劑和mirVana miRNA分離試劑盒提取了總RNA,并進行了qRT-PCR分析。使用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄mRNA和Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Ki逆轉錄miRNA。在ABI 7900HT實時PCR系統中,使用SYBR Green進行qRT-PCR檢測。miR-92a-3p 以U6為內參,KLF4以β-actin為內參。所有引物序列見表1,引物均有中國Sangon Biotech公司合成。使用2-ΔΔCt計算目標基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3蛋白質免疫印跡(Western Blot,WB):從HCC細胞系中提取蛋白質,并將40μg蛋白質通過14.7%聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉移到聚偏氟乙烯膜上。在4 ℃下分別與一抗KLF4(1∶1000)和β-actin(1∶10000)進行孵育,過夜后用1×TBST溶液在室溫下洗膜5min,沖洗3次。隨后與辣根過氧化物酶標記的二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶2000)在室溫下孵育2h。使用ECL試劑盒在熒光及化學發光成像系統檢測蛋白條帶并拍照。β-actin作為內參。

1.2.4MTT實驗:細胞在96孔板中培養,每孔加入0.2mL的細胞懸液,并重復操作6次。在培養過程中的第24h、48h、72h、96h和120h,用含有20μL MTT溶液(濃度為5mg/mL)的培養基替換原始培養基,并繼續培養4h。隨后,吸取上清,向每個孔中加入150μL DMSO以溶解活細胞產生的甲烷基藍晶體。在450 nm處測量每個孔的吸光度值。

1.2.5劃痕愈合實驗:將轉染細胞以2×106個細胞/孔的密度種植在6孔板中。當細胞完全附著后,使用移液管頭在每個孔中劃一條直線。接下來,用PBS洗滌細胞,并在無血清培養基中繼續培養48h。使用顯微鏡攝像頭拍攝觀察劃痕寬度。

1.2.6Transwell:使用涂有Matrigel基質的Transwell小室進行侵襲實驗。在上室中添加無血清重懸的細胞(2.5×104個/孔),下室中添加含5% FBS的DMEM培養基作為化學引誘劑。使用棉簽去除留在膜上表面的未侵襲細胞,將附著在膜下表面的侵襲細胞在室溫下用10%福爾馬林固定30min,并用0.5%結晶紫染色。在顯微鏡下任意選擇6個視野,計算并拍攝每個視野中侵襲細胞的數量,然后計算每個視野中細胞數量的平均值。

1.2.7雙熒光素酶實驗:為了驗證miR-92a-3p和KLF4之間的靶向結合關系,設計含有野生型KLF4(KLF4-WT)和突變型KLF4(KLF4-MUT)的pmirGLO熒光素酶報告質粒,質粒由中國Sangon Biotech公司合成。使用Lipofectamine 2000試劑將pmirGLO-KLF4-WT/pmirGLO-KLF4-MUT與NC mimic/miR-92a-3p mimic共轉染至SMMC-7721細胞。按照廠家說明書的要求,使用雙熒光素酶報告基因系統檢測了轉染熒光素酶報告質粒和miR-92a-3p mimic/NC mimic的SMMC-7721細胞中的熒光素酶活性。

2 結 果

2.1miR-92a-3p在HCC中高表達,下調其表達可限制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲:qRT-PCR檢測人類正常肝細胞系HL-7702和人類HCC細胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2和Hep3B中miR-92a-3p的表達水平。結果顯示,HCC細胞系中miR-92a-3p的表達水平高于HL-7702細胞(P<0.05,圖1A)。選擇miR-92a-3p表達相對較高的HCC細胞系SMMC-7721和Bel-7402進行敲低miR-92a-3p處理,進行后續的功能實驗。qRT-PCR結果表明,miR-92a-3p Inhibitor組中miR-92a-3p的表達水平顯著低于Inhibitor NC組(P<0.05,圖1B)。MTT結果表明,miR-92a-3p抑制后HCC細胞的增殖能力顯著降低(P<0.05,圖1C)。Transwell實驗結果表明miR-92a-3p Inhibitor組的細胞侵襲能力相比Inhibitor NC組顯著降低(P<0.05,圖1D)。細胞劃痕愈合實驗結果表明miR-92a-3p Inhibitor組的細胞遷移能力相比Inhibitor NC組顯著降低(P<0.05,圖1E)。

圖1 低表達miR-92a-3p抑制HCC細胞的增殖、侵襲和遷移

2.2KLF4可能受miR-92a-3p靶向,在HCC細胞中表達下調:從GEO數據庫獲取HCC表達數據集GSE49515并進行差異分析,發現共有589個顯著差異表達基因(DEGs),其中249個基因在HCC中表達顯著下調。接著,我們利用miRDB等數據庫預測了miR-92a-3p的下游靶基因,取預測結果與GSE49515數據集中的下調DEGs交集得到了5個可能的靶基因(圖2A)。表達分析顯示,這五個基因在HCC中均明顯低表達(圖2B),其中KLF4基因在HCC中的表達變化最大(表2)。因此,我們選擇KLF4作為研究對象進行分析。qRT-PCR檢測正常肝細胞系HL-7702和四個HCC細胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2和Hep3B中的KLF4 mRNA表達,并發現HCC細胞系中的KLF4 mRNA表達顯著低于HL-7702(P<0.05,圖2C)。因此KLF4可能是miR-92a-3p的調控靶點,并且在HCC細胞中低表達。

圖2 KLF4可能是miR-92a-3p的靶點,在HCC中低表達

表2 候選目標基因的差異性表達

2.3MiR-92a-3p靶向KLF4:TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)預測結果顯示,KLF4 mRNA的3'UTR與miR-92a-3p存在結合位點(圖3A)。進行雙熒光素酶報告實驗驗證miR-92a-3p與KLF4的結合情況。結果表明,相比于mimic NC組,miR-92a-3p mimic組WT KLF4 mRNA 3'UTR的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而MUT KLF4 mRNA 3'UTR的熒光素酶活性沒有顯著差異(P>0.05,圖3B)。qRT-PCR和Western blot檢測mimic NC組和miR-92-3p mimic組KLF4 mRNA和蛋白的表達水平。結果表明, miR-92a-3p mimic組顯SMMC-7721細胞中的KLF4表達顯著降低(P<0.05,圖3C-D)。

圖3 MiR-92a-3p 靶向KLF4

2.4MiR-92a-3p靶向KLF4刺激HCC細胞的發展:qRT-PCR檢測不同轉染組的KLF4 mRNA表達水平,發現當miR-92a-3p上調時,KLF4 mRNA水平顯著下降(P<0.05)。同時,過表達KLF4可以減弱miR-92a-3p過表達對KLF4 mRNA表達的抑制作用(P<0.05,圖 4A)。Western blot實驗表明,與mimic NC+oe-NC組相比,mimic NC+oe-KLF4組KLF4的蛋白表達顯著增高,miR-92a-3p mimic +oe-NC組KLF4的蛋白表達顯著降低,而miR-92a-3p mimic +oe-KLF4組KLF4蛋白表達水平顯著高于miR-92a-3p mimic +oe-NC組(圖4B)。MTT實驗結果顯示,與mimic NC+oe-NC組相比,mimic NC+oe-KLF4組細胞增殖能力顯著降低,miR-92a-3p mimic +oe-NC組細胞的增殖能力顯著增高,miR-92a-3p mimic +oe-KLF4組KLF4增殖能力相比于miR-92a-3p mimic +oe-NC組顯著降低(P<0.05,圖4C)。Transwell和劃痕愈合實驗表明,與mimic NC+oe-NC組相比,mimic NC+oe-KLF4組細胞遷移、侵襲能力顯著降低,miR-92a-3p mimic +oe-NC組細胞的遷移、侵襲能力顯著增高,miR-92a-3p mimic +oe-KLF4組KLF4遷移、侵襲能力相比于miR-92a-3p mimic +oe-NC組顯著降低(P<0.05,圖4D-E)。

圖4 MiR-92a-3p通過抑制KLF4的表達促進HCC細胞的生長

3 討 論

越來越多的證據表明,miRNA的異常表達與各種癌癥相關。有研究已經發現骨髓微環境中的miR-126可以控制慢性髓細胞白血病的白血病干細胞的自我更新[7]。miR-92a-3p是一個重要的miRNA,目前有關miR-92a-3p的報道顯示它可以加速細胞增殖、遷移和侵襲。Zhang等[8]報道,受lncRNA MT1JP的影響,miR-92a-3p調控FBXW7,從而影響胃癌的惡性發展。Yu等[6]證明,miR-92a-3p可以通過調節KLF2/BIRC5軸促進乳腺癌增殖。本研究首先通過qRT-PCR測得miR-92a-3p在HCC中顯著高表達。細胞功能實驗也顯示敲低miR-92a-3p對HCC的增殖、遷移、侵襲起到了抑制作用。結果表明抑制miR-92a-3p可以抑制HCC細胞的進展,miR-92a-3p在肝細胞癌中可作為促癌因子,這與前人研究的結果一致。

據報道,miRNA可以通過調節靶基因發揮其生物學功能[9]。在HCC中,通過生物信息學分析發現KLF4可能是miR-92a-3p的靶基因。KLF4是一種包含鋅指的進化保守性轉錄因子,它在多種細胞過程中發揮作用,如細胞生長、增殖和分化。目前,KLF4已被廣泛研究,研究發現它可以調節胃癌的進展[10]。此外,Xu等[11]發現KLF4在非小細胞肺癌中起抑癌作用,且受miR-3120-5p靶向調節。本研究通過TargetScan預測了miR-92a-3p與KLF4存在靶向結合位點,并通過雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證。隨后進行細胞功能實驗研究過表達miR-92a-3p和過表達KLF4對HCC細胞的增殖、遷移和侵襲的影響。實驗結果表明過表達KLF4可抑制HCC細胞的惡性生物學行為,而過表達miR-92a-3p可以減弱過表達KLF4對HCC細胞惡性生物學行為的抑制作用,表明miR-92a-3p對癌細胞的影響在一定程度上會削弱KLF4的作用。這說明miR-92a-3p可以通過抑制KLF4的表達來促進HCC細胞的惡性生物學行為。

綜上所述,研究發現miR-92a-3p在HCC細胞中高表達,并且可能是一個有用的預后生物標志物。miR-92a-3p可以通過抑制KLF4促進HCC細胞的增殖、遷移和侵襲。這些發現表明,miR-92a-3p/KLF4軸可能是HCC的一個潛在新治療靶點,希望該研究能為HCC的治療提供新思路。