鳶尾素調節Hippo/YAP信號通路對絕經后骨質疏松大鼠骨代謝的調節作用

侯秀秀, 劉 博, 邢寶瑞, 馮元超, 張亞弟, 石國君, 韓廣普

(河北省滄州市中西醫結合醫院骨科, 河北 滄州 161001)

骨質疏松是骨科常見病慢性疾病之一,目前我國骨質疏松人數占全球50%左右,女性骨質疏松癥的患病率是男性的數倍,其中老年女性絕經后骨質疏松(PMOP)占總發病人群的70%,嚴重影響患者身心健康[1]。目前主要采取服用雌激素、生長激素、降鈣素等藥物從預防骨質疏松基礎礦化、抗骨吸收、促骨形成幾方面進行治療,但極易產生不良反應甚至產生耐藥性,因此需要尋找更加安全高效的治療藥物是目前PMOP的研究重點[2]。目前已知鳶尾素是可以通過運動、饑餓、高溫、藥物等介導的肌肉產生與分泌的肌源性因子,具有調節能量代謝、糖脂穩態、骨骼健康狀況等作用,常用于治療肥胖、II型糖尿病、脂代謝和心血管疾病、骨代謝疾病等。研究顯示,鳶尾素可以通過促進骨形成、抑制骨吸收增加骨量和骨密度,減輕骨質疏松癥狀,保護骨骼健康[3]。Hippo-YAP信號通路參與調節成骨代謝,激活Hippo-YAP信號通路可以促進成骨分化,加快骨形成及骨缺損重塑[4]。鳶尾素能否通過調控Hippo-YAP信號通路影響PMOP尚不清楚,本文主要探索鳶尾素對PMOP骨代謝及Hippo-YAP信號通路的影響,以期為PMOP的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要材料:200～220g SPF級雌性SD大鼠購于武漢云克隆動物有限公司(生產許可SCXK(鄂)2023-0021);鳶尾素(CM35)購于美國Novoprotein公司;維替泊芬(HY-Bol46)購于美國Med-ChemExpress公司;HE染色試劑盒(G11120)購于北京索萊寶公司;BALP(ARB12444)ELISA試劑盒購于北京百奧萊博公司;CBF-α1(GT04504B)ELISA試劑盒購于上海晶風生物公司;P1NP(NLR023)ELISA試劑盒購于武漢紐斯特生物公司;OC(JH-R30432)ELISA試劑盒購于上海繼和生物公司;TAZ(ab307148)、YAP(ab76252)、p-YAP(ab76252)抗體購于上海Abcam公司。

1.2方 法

1.2.1構建絕經后骨質疏松大鼠模型:腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,自腰椎沿背部正中線向下做縱行切口,分別從左、右側臥位切除兩側卵巢,逐層縫合[5]。對照組只開腹腔暴露雙側卵巢,不摘除。術后8周檢測造模大鼠與對照組大鼠骨密度,若造模大鼠骨密度比對照組顯著下降,則證明PMOP大鼠造模成功。

1.2.2分組及處理:造模成功后,將所有實驗大鼠分為對照組(Control組)、PMOP組、鳶尾素低、中、高劑量組(Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組)[6]、鳶尾素高劑量+YAP抑制劑維替泊芬組(Irisin-H+VTPF組)[7],每組18只,共108只大鼠。Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組:造模成功后,分別腹腔注射25、50、100 μg·kg-1·w·-1鳶尾素;Irisin-H+VTPF組:造模成功后,腹腔注射100 μg·kg-1·w·-1鳶尾素及10 mg·kg-1·d·-1VTPF;Control組與PMOP組腹腔注射與Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組等量的生理鹽水;連續給藥4周。

1.2.3骨密度測定:給藥結束后,各組隨機選擇6只大鼠剝離右側股骨,并使用骨密度儀進行掃描,記錄各組大鼠的BMD值。

1.2.4Micro-CT分析:將1.2.3各組大鼠的右側股骨遠端,用4%多聚甲醛固定后,4℃冰箱放置3d,生理鹽水浸泡1d,Micro-CT掃描測量Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N、Tb.Sp。

1.2.5股骨組織形態學觀察:從各組剩余大鼠中隨機選擇6只,剝離大鼠右側股骨,4%多聚甲醛固定,常規石蠟包埋,沿冠狀面切片,隨后進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化,蘇木精、伊紅染色,顯微鏡下觀察股骨組織形態學變化。

1.2.6BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平檢測:剩余6只大鼠,戊巴比妥鈉麻醉大鼠,尾靜脈收集血樣,室溫靜置30min,3000rpm離心15min,取上清,ELISA試劑盒檢測BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平。

1.2.7TAZ、YAP、p-YAP蛋白檢測:采血后斷頸處死各組剩余的6只大鼠,迅速取出大鼠右側股骨,沖洗干凈,加入RIPA裂解液充分裂解,再將裂解液離心后取上清液,測定各組蛋白濃度。蛋白變性,根據蛋白量大小進行凝膠電泳、轉膜、封閉,然后將膜與抗體TAZ、YAP、p-YAP、GAPDH 4℃孵育過夜,洗膜后加入二抗室溫孵育,ECL暗室曝光,凝膠成像儀采集圖像并分析蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1鳶尾素對各組大鼠骨密度的影響:與Control組比較,PMOP組大鼠BMD顯著降低(P<0.05);與PMOP組比較,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組大鼠BMD依次顯著升高(P<0.05);與Irisin-H組比較,Irisin-H+VTPF組大鼠BMD顯著降低(P<0.05);見表1。

表1 各組大鼠BMD比較

2.2鳶尾素對各組大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N、Tb.Sp的影響:與Control組比較,PMOP組大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N顯著降低,Tb.Sp顯著升高(P<0.05);與PMOP組比較,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N依次顯著升高,Tb.Sp依次顯著降低(P<0.05);與Irisin-H組比較,Irisin-H+VTPF組大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N顯著降低,Tb.Sp顯著升高(P<0.05);見圖1、表2。

圖1 各組大鼠Micro-CT圖

表2 各組大鼠Tb.Th Tb.Ar Tb.N Tb.Sp比較

2.3鳶尾素對各組大鼠股骨組織形態學變化的影響:Control組大鼠股骨組織的骨小梁結構完整且排列有序;與Control組比較,PMOP組大鼠股骨組織的骨小梁結構紊亂,骨小梁厚度變薄,空骨陷窩明顯,甚至發生輕微骨折;與PMOP組比較,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組大鼠股骨組織骨小梁結構逐漸排列有序,空骨陷窩減少,股骨組織損傷逐漸減輕;與Irisin-H組比較,Irisin-H+VTPF組大鼠股骨組織的骨小梁結構紊亂,空骨陷窩明顯增加,股骨組織損傷加重;見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠股骨組織形態學變化(×400)

2.4鳶尾素對各組大鼠骨代謝的影響:與Control組比較,PMOP組大鼠血清BALP、P1NP、OC、CBF-α1顯著降低(P<0.05);與PMOP組比較,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組大鼠BALP、P1NP、OC、CBF-α1依次顯著升高(P<0.05);與Irisin-H組比較,Irisin-H+VTPF組大鼠BALP、P1NP、OC、CBF-α1顯著降低(P<0.05);見表3。

表3 各組大鼠血清BALP PⅠNP OC CBF-α1水平比較

2.5鳶尾素對Hippo-YAP信號通路的影響:與Control組比較,PMOP組大鼠TAZ、YAP、p-YAP蛋白表達顯著降低(P<0.05);與PMOP組比較,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組大鼠TAZ、YAP、p-YAP蛋白表達依次顯著升高(P<0.05);與Irisin-H組比較,Irisin-H+VTPF組大鼠TAZ、YAP、p-YAP蛋白表達顯著降低(P<0.05);見圖3、表4。

圖3 Western blot檢測TAZ、YAP、p-YAP蛋白表達

表4 各組大鼠TAZ YAP p-YAP蛋白表達比較

3 討 論

PMOP是一種卵巢激素缺乏引起的骨質疏松癥,也是最常見的與年齡相關的骨質流失原因,常發生于女性絕經后的5～10年,其發病主要是由于女性進入圍絕經期,卵巢功能下降,雌激素分泌急劇下降,致使破骨細胞介導的骨吸收速度加快,骨吸收與骨形成平衡被打破,加快骨轉換,導致骨量減少、骨組織細微結構遭到破壞,進而促使骨脆性和骨折危險性大幅度提升,嚴重影響患者的生活質量和身體健康[8]。又由于之前服用的激素類藥物副作用大且極易產生耐藥性,所以尋求新的治療藥物至關重要。

鳶尾素作為骨骼肌分泌的肌因子,廣泛分布于人體各組織,參與調控骨骼相關基因的表達,可以促進骨細胞的增殖,進而增大骨密度、韌性及強度。研究顯示,鳶尾素可以直接靶向成骨細胞,促進成骨細胞增殖,還可以作用于破骨細胞祖細胞,增加骨分化,促進骨吸收,進而刺激骨重塑[9]。鳶尾素可以上調BMD、Tb.Th,抑制破骨細胞生成,促進成骨細胞增加,參與調控骨代謝以防治骨質疏松[10]。本文研究顯示,鳶尾素可以改善PMOP大鼠股骨組織損傷,上調BMD、Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N,下調Tb.Sp,說明鳶尾素可以通過促進骨形成,防治絕經后骨質疏松。

骨是人體重要的生物力學和生理學組織,由成骨細胞主導的骨形成和破骨細胞主導的骨吸收共同作用的骨代謝是骨骼系統發展的重要環節。BALP是一種下丘腦分泌活性因子,介導破骨細胞,影響骨吸收,還誘導成骨細胞的形成,增加骨密度,提高骨強度。P1NP是骨形成初期的敏感指標之一。OC是由成骨細胞分泌,其表達高低可以反映成骨細胞的活性和功能變化。CBF-α1促進成骨細胞分化及成骨細胞的活性。研究顯示,升高BALP、PⅠNP、OC、CBF-α1水平,有利于骨代謝過程中的骨形成,改善去卵巢骨質疏松大鼠骨髓微環境[11]。本文研究顯示,PMOP大鼠體內的BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平下調,而鳶尾素可以上調BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平,說明鳶尾素可以通過調控骨代謝參與骨形成與骨吸收過程。

Hippo-YAP信號通路參與器官生成、組織穩態、修復和再生、細胞代謝、腫瘤發生等多種過程,還可參與骨代謝,進而影響骨細胞增殖、分化、凋亡和存活[12]。TAZ和YAP是Hippo信號通路的關鍵效應物,當Hippo信號通路被激活,導致TAZ和YAP磷酸化,而磷酸化的TAZ和YAP隨后可被隔離在細胞質中降解[13]。研究顯示,激活Hippo-YAP信號通路可以促進成骨細胞的增殖和分化,有助于防治骨質疏松[14]。本文研究顯示,鳶尾素可以上調TAZ、YAP、p-YAP蛋白表達,而YAP抑制劑VTPF可以部分逆轉鳶尾素對成骨細胞的增殖和分化的促進作用,說明鳶尾素可以通過激活Hippo-YAP信號通路,改善絕經后骨質疏松癥狀。

綜上所述,鳶尾素可以通過激活Hippo-YAP信號通路,參與調控絕經后骨質疏松的骨代謝。本研究仍存在局限性,鳶尾素可能通過調控其他信號通路影響骨代謝,且鳶尾素對Hippo-YAP信號通路的作用機制尚不明確,需要進行進一步實驗驗證。