紫外分光光度法快速測定綠葉菜中硝酸鹽含量的技術步驟優化

包蔚 徐樺 朱曉蕓 何鍇 余海芬 吳真善 黃明皓 王絡繹

（上海市嘉定區農業技術推廣服務中心，上海 201800）

目前綠葉菜中硝酸鹽含量的測定方法主要有紫外分光光度法、酚二磺酸比色法、鎘柱或鎘粒還原分光光度法、離子色譜法等[1]。其中，酚二磺酸比色法是測定綠葉菜中硝酸鹽含量的經典方法，但該方法操作煩瑣、干擾因素多，不能滿足常規分析的需要；鎘柱還原分光光度法是檢測蔬菜中硝酸鹽含量的國家標準方法[2]，此方法以金屬鎘還原NO3-為NO2-為原理，操作步驟繁多，且在還原時鎘粒量要充足，否則易造成測定結果偏低；離子色譜法對儀器的要求較高，且所用試劑有毒，對環境和操作人員均有不良影響；紫外分光光度法具有操作簡單、結果準確度高的特點，更符合常規檢測安全、快速、大批量的要求。鑒于此，筆者采用紫外分光光度法，通過比較不同提取方法、不同振蕩時間和干擾物質等不同測定條件對綠葉菜中硝酸鹽含量測定的影響，并對不同測定條件下的檢測精密度及準確度進行分析和評價，以期優化測定步驟，從而為綠葉菜中硝酸鹽含量的檢測提供更為簡便快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品為2022年隨機采自上海設施菜地的新鮮蔬菜，包括生菜、青菜、菠菜、空心菜、芹菜、米莧、杭白菜等。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：氨緩沖溶液（pH為9.6～9.7）、飽和硼砂溶液、0.25 mol/L 亞鐵氰化鉀溶液、l mol/L 乙酸鋅溶液、500 mg/L 硝酸鹽標準溶液、活性炭、正辛醇。

主要儀器：紫外分光光度計、分析天平、粉碎機、恒溫振蕩器、勻漿機。

1.3 實驗方法及原理

紫外分光光度法測定綠葉菜中硝酸鹽含量是利用提取液提取出硝酸鹽，然后加入活性炭去除色素，加入蛋白質沉淀劑去除蛋白質及其他干擾物質，再利用硝酸根離子在紫外區219 nm 處具有吸收波長的特性，測定提取液的吸光度，從而計算出硝酸鹽含量。

1.3.1 樣品制備

選取一定數量具有代表性的供試樣品，先用自來水沖洗，再用去離子水清洗干凈，吸干表面水分，切碎后置于粉碎機中勻漿，勻漿后在其中加1 滴正辛醇，以消除泡沫。

1.3.2 硝酸鹽提取

飽和硼砂提取：稱取15～20 g 勻漿試樣，加入飽和硼砂溶液2.5 mL，再加入70～80 ℃的熱水40 mL，然后置于沸水浴中加熱15 min，持續攪拌。待溶液冷卻后，沖洗入250 mL 容量瓶中，加入0.25 mol/L 亞鐵氰化鉀溶液5 mL，搖勻，再加入1 mol/L 乙酸鋅溶液5 mL、活性炭1 g，然后定容到刻度，搖勻、過濾。同時做空白試驗。

氨緩沖液提取：稱取10 g 勻漿試樣，置于100 mL 燒杯中，用100 mL 去離子水分次將樣品轉移到250 mL 容量瓶中，再加入5 mL 氨緩沖溶液、2 g粉末狀活性炭，在可調式往返振蕩機上（200次/min）振蕩30 min，然后加入亞鐵氰化鉀溶液和硫酸鋅溶液各2 mL，充分混合后，加去離子水定容至250 mL，充分搖勻，放置5～10 min后過濾。同時做空白試驗。

1.3.3 硝酸鹽與亞硝酸鹽含量的測定

吸取上述提取液2～10 mL 置于50 mL 容量瓶內，用去離子水定容。用1 cm 石英比色皿，于219 nm處測定吸光度。蔬菜中的亞硝酸鹽含量采用國標GB/T 15401-94 中鹽酸萘乙二胺比色法進行測定。

1.3.4 工作曲線的配制

分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 硝酸鹽標準溶液置于50 mL 容量瓶中，加去離子水定容至刻度并搖勻，此標準系列溶液的硝酸根有效成分質量分數分別為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L。用1 cm 石英比色皿，于219 nm處測定吸光度，以標準溶液的有效成分質量分數為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制工作曲線。

1.3.5 計算公式

樣品中硝酸鹽含量以質量分數(單位：mg/kg)表示，計算公式W=(C×V1×V3)÷(m×V2），式中，C為從工作曲線中查得的測試液中的硝酸鹽質量分數(mg/L)，V1為提取液定容體積（mL），V2為吸取濾液體積（mL），V3為待測液定容體積（mL），m是樣品質量(g）。

2 結果與分析

2.1 飽和硼砂提取法和氨緩沖液提取法比較

選取新鮮生菜和菠菜作為供試材料，分別采用飽和硼砂提取法和氨緩沖液提取法測定其硝酸鹽含量，每處理重復4次。由表1可知，飽和硼砂提取法測得的生菜和菠菜中硝酸鹽含量的平均值分別為2 809.19 mg/kg 和862.45 mg/kg，而氨緩沖液提取法測得的生菜和菠菜中硝酸鹽含量的平均值分別為2 948.16 mg/kg 和873.69 mg/kg，氨緩沖液提取法測得的綠葉菜中硝酸鹽含量略高于飽和硼砂提取法，但兩者差異不顯著。氨緩沖液提取法的變異系數低于飽和硼砂提取方法，且氨緩沖液提取法的操作步驟比飽和硼砂提取法的操作步驟簡單。因此，本研究最終選取氨緩沖液提取法來提取綠葉菜中的硝酸鹽。

表1 不同提取方法對硝酸鹽含量測定的影響

2.2 振蕩時間對硝酸鹽含量測定的影響

對于實驗室大批量快速檢測來說，提取時震蕩時間越長，檢測耗時越長。為確定樣品中硝酸鹽是否已被完全提取，本試驗設振蕩時間分別為0、10、20、30、40 min，共5 個處理，每處理重復4次。由表2可知，各振蕩時間測得的硝酸鹽含量為3 613.31～3 745.86 mg/kg，其中，硝酸鹽含量平均值最大的處理為振蕩20 min，最小的處理為振蕩0 min，但各處理間差異不顯著，且變異系數均小于10%。以上結果說明，振蕩時間對硝酸鹽含量測定結果的影響不大，且沒有呈現出硝酸鹽含量隨振蕩時間增加而遞增的規律。

表2 不同振蕩時間對硝酸鹽含量測定的影響

2.3 亞硝酸鹽的干擾實驗

鑒于亞硝酸鹽在219 nm 處有吸光度，會干擾硝酸鹽含量的測定結果，故選取新鮮的青菜、空心菜、芹菜、米莧、杭白菜進行亞硝酸鹽含量的測定。由表3可知，新鮮蔬菜的亞硝酸鹽含量很少，相較于硝酸鹽含量來說，亞硝酸鹽含量幾乎可以忽略不計。因此，亞硝酸鹽含量對硝酸鹽含量的測定結果基本沒有影響。

表3 蔬菜中硝酸鹽含量與亞硝酸鹽含量比較

2.4 準確度、精密度實驗

取青菜、空心菜、生菜、芹菜4種新鮮蔬菜樣品，分別加入2 000 mg NO3-，與樣品測定步驟一樣測定硝酸鹽含量，計算回收率。由表4可知，4種蔬菜的回收率在92.61%～109.50%，符合實驗要求。

表4 準確度實驗結果

取青菜、米莧、杭白菜各2個品種，每個品種設4 個重復，精密度結果如表5所示。由表5 可知，各蔬菜中硝酸鹽測定結果的變異系數均小于10%，符合實驗要求。

表5 精密度實驗結果

3 結論與討論

通過比較實驗，本研究最終選取氨緩沖液作為提取液，并采用搖勻代替振蕩30 min 的方式，優化了紫外分光光度法測定綠葉菜中硝酸鹽含量的技術步驟；通過測定亞硝酸鹽含量，排除了干擾因素；經過準確度和精密度實驗表明，優化后的測定方法的加標回收率在92.61%～109.5%，符合實驗要求。綜上，經過完善和優化技術步驟后的測定方法，大大節省了檢測時間，適用于實驗室大批量綠葉菜樣品的檢測。需要注意的是，本方法并不適用于所有綠葉菜樣品的測定；同時，在新鮮綠葉菜中亞硝酸鹽的含量較低時，立即檢測不會干擾檢測結果，但是一旦樣品保存時間過長，或存儲溫度過高，亞硝酸鹽含量便會在1～2 d內增加，那么硝酸鹽含量則會減少，最終便會影響檢測結果的準確度[3]。因此，新鮮蔬菜在采樣后要盡快進行測定，若當天不能完成檢測，須將其置于冷凍條件下保存。