血清和玻璃體中miR-126和miR-325與增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變嚴(yán)重程度的關(guān)系

唐 辛,劉志明,徐寧達(dá),李佳睿,黃旅珍

0 引言

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是指患者孔源性視網(wǎng)膜脫離(rhegmatogenous retinal detachment,RRD)后出現(xiàn)的炎癥性眼病,也是致盲的主要原因[1]。其臨床特征主要為玻璃體混濁、出現(xiàn)棕色顆粒、視網(wǎng)膜組織僵硬且有褶皺等[2]。臨床只能通過(guò)手術(shù)干預(yù)治療,尚無(wú)特效治療PVR手段[3]。因此,尋求新的生物標(biāo)志物為PVR的診治研究提供新的研究方向十分必要。微小RNA(miRNA)在各種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,如細(xì)胞免疫、增殖、分化、血管生成等[4]。除血清、眼淚、母乳等常規(guī)體液外,最近在玻璃體中也發(fā)現(xiàn)了miRNA[5]。據(jù)報(bào)道,一些miRNA與玻璃體視網(wǎng)膜疾病的進(jìn)展關(guān)系較為緊密[6]。miR-126、miR-325在緩解炎癥和促進(jìn)血管的形成中發(fā)揮重要作用,但其在PVR發(fā)生發(fā)展中的作用研究較少[7-9]。本研究通過(guò)檢測(cè)PVR患者血清和玻璃體中miR-126、miR-325的表達(dá)情況,旨在探討miR-126、miR-325與PVR嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象回顧性研究。選取2019-10/2022-10在本院治療的PVR患者100例100眼。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)確診為PVR患者[10];(2)均接受標(biāo)準(zhǔn)的平坦部玻璃體切除術(shù);(3)自愿參與本研究;(4)無(wú)認(rèn)知障礙,能自主交流并主動(dòng)配合醫(yī)生的檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)雙眼病變患者;(2)孕婦、哺乳期的婦女;(3)合并青光眼、白內(nèi)障、先天性弱視者;(4)患有高血壓、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、惡性腫瘤等疾病。按照視網(wǎng)膜病變程度分級(jí)[9],分為A(玻璃體內(nèi)有云霧狀或色素性顆粒中混濁)、B(視網(wǎng)膜內(nèi)面出現(xiàn)皺褶和視網(wǎng)膜裂孔有卷邊,視網(wǎng)膜血管明顯迂曲)、C(視網(wǎng)膜脫離處,出現(xiàn)全層固定皺褶)、D(整個(gè)眼底有視網(wǎng)膜全層固定皺褶,皺褶以視乳頭為中心形成漏斗狀,漏斗的尖端朝向視乳頭)。A/B為輕度組42眼,C/D為重度組58眼。選取同期因眼外傷在本院進(jìn)行玻璃體切除術(shù)無(wú)視網(wǎng)膜病變的患者30例30眼為對(duì)照組。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有參與者均知情同意。

1.2方法所有患者術(shù)前抽取靜脈血,4 ℃自然凝固后離心分離血清,玻璃體液在手術(shù)室完成采集。使用TRIzol總RNA抽提試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度,使OD260/OD280為1.8-2.0,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用qRT-PCR試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)配制25 μL反應(yīng)體系:SYBR Green I qPCR Master Mix 12.5 μL,正反向引物各0.5 μL,cDNA模板2.5 μL,ddH2O 9 μL?；靹蚝笤跓晒舛縋CR儀(美國(guó)ABI公司)中進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)設(shè)置為95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因。根據(jù)NCBI相應(yīng)的序列設(shè)計(jì)引物,引物序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-126、miR-325的相對(duì)表達(dá)量。使用特定的酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)試劑盒(Abcam,San Francisco,USA)檢測(cè)血清、玻璃體中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF),血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平。使用酶標(biāo)儀(EpochTMMicroplate Spectrophotometer,USA)測(cè)量450 nm處的吸光度。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1兩組患者一般資料比較PVR組與對(duì)照組患者一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 兩組患者一般資料比較

2.2兩組患者血清和玻璃體中miR-126和miR-325水平比較PVR患者血清和玻璃體中miR-126水平較對(duì)照組降低,miR-325水平較對(duì)照組升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表3。

表3 兩組患者血清和玻璃體中miR-126和miR-325水平比較

2.3不同病變程度PVR患者血清和玻璃體中miR-126和miR-325水平比較重度組患者血清和玻璃體中miR-126水平較輕度組下降,miR-325水平較輕度組上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表4。

表4 不同病變程度PVR患者血清和玻璃體中miR-126和miR-325水平

2.4不同病變程度PVR患者血清和玻璃體中細(xì)胞因子水平比較重度組患者血清和玻璃體中TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平較輕度組上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表5。

表5 不同病變程度PVR患者血清和玻璃體中細(xì)胞因子水平比較

2.5PVR組患者血清miR-126和miR-325水平與細(xì)胞因子水平的相關(guān)性PVR組患者血清miR-126水平與miR-325、TGF-β、VEGF、TNF-α水平負(fù)相關(guān)(r=-0.677、-0.486、-0.498,-0.513,均P<0.05),與PDGF水平弱相關(guān)(r=-0.289,P<0.05)。miR-325與TGF-β、VEGF、TNF-α水平正相關(guān)(r=0.509、0.544、0.492,均P<0.05),與PDGF水平弱相關(guān)(r=0.253,P<0.05)。

2.6PVR組患者玻璃體中miR-126和miR-325水平與細(xì)胞因子水平的相關(guān)性PVR組患者玻璃體中miR-126水平與miR-325、TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平負(fù)相關(guān)(r=-0.458、-0.375、-0.608、-0.478、-0.714,均P<0.05)。miR-325水平與PDGF、TNF-α水平正相關(guān)(r=0.527、0.562,均P<0.05),與TGF-β、VEGF水平弱相關(guān)(r=0.242、0.261,均P<0.05)。

2.7影響PVR病變嚴(yán)重程度的Logistic分析以是否發(fā)生重度PVR為變量(是=1,否=0)為因變量,以表4、5中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性的miR-126、miR-325、TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平(均為實(shí)測(cè)值)為自變量,采用逐步回歸法進(jìn)行Logistic回歸分析,提示血清和玻璃體中miR-126、miR-325、TGF-β、PDGF、TNF-α均是發(fā)生重度PVR的影響因素(均P<0.05),見表6。

表6 影響PVR病變嚴(yán)重程度的Logistic分析

3 討論

PVR是一種致盲性疾病,與視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞中的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有關(guān),病理發(fā)展過(guò)程為破壞血-視網(wǎng)膜屏障、使細(xì)胞增殖遷移、形成與收縮增殖膜、沉積細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)以及視網(wǎng)膜皺褶形成[11-12]。在因孔源性視網(wǎng)膜脫離而接受視網(wǎng)膜手術(shù)患者中,約5%-10%患者會(huì)發(fā)生PVR,占術(shù)后失敗75%[11]。視網(wǎng)膜反復(fù)脫離和PVR的產(chǎn)生導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷,手術(shù)結(jié)果較差[13]。目前PVR發(fā)病機(jī)制尚不明確,但多項(xiàng)研究表明,miRNA與PVR發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14],因此分析血清和玻璃體中miRNA水平可能是識(shí)別疾病生物標(biāo)志物一個(gè)有希望的熱門領(lǐng)域。

研究發(fā)現(xiàn),miR-126在視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮作用,如miR-126-5p在糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)變性中表達(dá)下調(diào),可作為評(píng)估視網(wǎng)膜神經(jīng)變性的生物標(biāo)志物[15]。Zheng等[16]發(fā)現(xiàn)與非糖尿病大鼠相比,糖尿病大鼠血清和視網(wǎng)膜miR-126水平下調(diào),向玻璃體內(nèi)輸送miR-126可緩解視網(wǎng)膜病變情況。然而miR-126、miR-325在PVR中的研究較少。本研究結(jié)果顯示,在PVR患者血清和玻璃體中,miR-126表達(dá)量均下調(diào),隨著疾病加重進(jìn)一步下調(diào),且血清和玻璃體中高水平miR-126是發(fā)生重度PVR的影響因素,提示miR-126在PCR發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。PVR發(fā)生時(shí),ECM和各種類型細(xì)胞會(huì)形成視網(wǎng)膜前膜(epiretinal membranes,ERM),導(dǎo)致視網(wǎng)膜皺褶的出現(xiàn)對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行牽拉最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment,RD)[12]。有報(bào)道稱miR-325-3p過(guò)表達(dá)可促進(jìn)EMT進(jìn)程[17]。本試驗(yàn)中PVR患者血清和玻璃體的miR-325表達(dá)量上調(diào),且重度組高于輕度組,血清和玻璃體中高水平miR-325是發(fā)生重度PVR的影響因素,提示miR-325可能在PVR中發(fā)揮致病作用。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),PVR患者血清和玻璃體miR-126與miR-325水平呈負(fù)相關(guān),提示miR-126、miR-325表達(dá)可能相互調(diào)節(jié)共同參與PVR的發(fā)生發(fā)展,并且與PVR的嚴(yán)重程度有關(guān)。

幾乎PVR所有危險(xiǎn)因素都與RPE在玻璃體中的擴(kuò)散或血眼屏障的破壞有關(guān)[18]。在PVR患者的視網(wǎng)膜撕裂過(guò)程中,分離RPE細(xì)胞會(huì)接觸到玻璃體,導(dǎo)致玻璃體刺激視網(wǎng)膜表面RPE細(xì)胞的遷移;同時(shí),炎癥介質(zhì)等促進(jìn)RPE細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白,進(jìn)一步導(dǎo)致ERM形成和收縮[19]。由此可見,RPE細(xì)胞是ERM形成的主要參與者,在PVR中起著至關(guān)重要作用。生長(zhǎng)因子和炎癥因子都是PVR中EMT過(guò)程的介質(zhì),主要包括TGF-β、TNF-α、PDGF以及黏附因子ICAM-1等[20]。研究發(fā)現(xiàn),PVR中ERM發(fā)生與TGF-β和TNF-α信號(hào)通路激活有關(guān),且TNF-α信號(hào)通路是該過(guò)程中的關(guān)鍵,這些因素協(xié)同激活成人RPE細(xì)胞中的EMT程序[21]。也有研究表明TGF-β、TNF-α和PDGF上調(diào)與PVR的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[22]。Hsiao等[23]表明TGF-β2的釋放可能促進(jìn)人類RPE細(xì)胞中VEGF產(chǎn)生。本研究結(jié)果與Mudhar[22]研究類似,在PVR重度組患者的血清和玻璃體中,TGF-β、TNF-α、PDGF、VEGF水平均顯著高于輕度組。進(jìn)一步分析顯示,上述指標(biāo)與miR-126水平均呈負(fù)相關(guān),而與miR-325水平均呈正相關(guān)。在增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變中,miR-126已被證實(shí),可通過(guò)靶向VEGF調(diào)節(jié)血管發(fā)育,進(jìn)而影響視網(wǎng)膜病變過(guò)程[24]。因此推測(cè),miR-126在PVR進(jìn)展中的作用可能與靶向調(diào)節(jié)TGF-β、TNF-α、PDGF、VEGF有關(guān)。另外,miR-325-3p的表達(dá)已被證實(shí)可被TGF-β誘導(dǎo),并對(duì)EMT有積極影響[25]。本研究推測(cè)miR-325在PVR中可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β、TNF-α、PDGF、VEGF等炎癥因子和血管生成因子表達(dá),影響視網(wǎng)膜中的炎癥反應(yīng)和EMT過(guò)程,進(jìn)而促進(jìn)視網(wǎng)膜前膜的沉積和剝離,導(dǎo)致PVR發(fā)生或進(jìn)展。

綜上所述,隨PVR疾病的加重,血清和玻璃體中miR-126表達(dá)降低,miR-325表達(dá)升高,且與TGF-β、TNF-α、VEGF、PDGF具有相關(guān)性。二者可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和EMT過(guò)程參與PVR的發(fā)生和進(jìn)展,然而具體的作用和機(jī)制需要設(shè)計(jì)進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)確定。