角膜基質(zhì)再生與修復(fù)的研究進(jìn)展

鄭天爍,時(shí)雪靜,辛 萌

0 引言

角膜是眼部的一個(gè)透明、無(wú)血管的組織,其中基質(zhì)層是角膜最主要的組成部分,厚度占整個(gè)角膜的90%以上,在維持角膜物理學(xué)特性、形態(tài)的穩(wěn)定和透明性等方面起到關(guān)鍵的作用。因此,任何由于損傷或疾病引起的角膜基質(zhì)損害都會(huì)導(dǎo)致視力不同程度的下降,當(dāng)這種視力損害進(jìn)行性加重且不可逆轉(zhuǎn)時(shí),往往需要通過(guò)角膜移植手術(shù)來(lái)恢復(fù)角膜透明度和視力[1]。角膜移植手術(shù)是目前最常見(jiàn)和最成功的器官移植手術(shù),大致分為穿透性角膜移植、板層角膜移植、角膜內(nèi)皮移植和其他方式移植。盡管角膜移植的總體成功率高達(dá)85%-90%,但接受角膜移植術(shù)的患者中出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)和不可預(yù)測(cè)的散光等術(shù)后并發(fā)癥的概率大約為18%-21%,而對(duì)于有炎癥和合并其他病癥(例如化學(xué)燒傷、自身免疫性疾病)的高危患者,并發(fā)癥和失敗率高達(dá)49%。并且,隨著角膜移植需求的日益增長(zhǎng),全球人類角膜供體組織已經(jīng)無(wú)法滿足這一日益增長(zhǎng)的需求[2-3]。因此,本文就角膜基質(zhì)再生技術(shù)研究進(jìn)展和存在的問(wèn)題做一綜合分析,期望為角膜基質(zhì)再生醫(yī)學(xué)的研究提供新的思路。

1 干細(xì)胞誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)再生

干細(xì)胞是存在于胚胎和成體生物體中的未分化細(xì)胞,具有多向分化的潛能和自我更新的能力。由于干細(xì)胞的增殖潛力和可塑性,已在包括眼睛在內(nèi)的許多組織和器官中探索用于組織再生,如利用胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞治療,替代喪失的視網(wǎng)膜細(xì)胞并改善視力[4]。目前已有多項(xiàng)干細(xì)胞治療角膜疾病的臨床試驗(yàn),包括使用間充質(zhì)干細(xì)胞、角膜基質(zhì)干細(xì)胞等進(jìn)行基質(zhì)再生[5]。

1.1間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)具有分化為多種角膜結(jié)構(gòu)細(xì)胞的能力,通過(guò)免疫調(diào)控、減輕炎癥和抑制新生血管在組織結(jié)構(gòu)修復(fù)中發(fā)揮重要作用[6]。MSC可以從許多人體組織中獲得,包括骨髓、臍帶、脂肪組織、牙髓、毛囊和胎盤等[7]。有研究表明,所有類型的MSC在體內(nèi)可能具有相似的行為,因此能夠?qū)崿F(xiàn)角膜細(xì)胞分化并通過(guò)免疫調(diào)節(jié)特性調(diào)節(jié)角膜基質(zhì)[8]。既往研究已經(jīng)證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為角膜細(xì)胞樣細(xì)胞,并有可能恢復(fù)角膜基質(zhì)的透明度[9]。在另一項(xiàng)研究中,使用人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical mesenchymal stem cells,UMCS)直接注射到角膜基質(zhì)中,結(jié)果顯示它們能夠恢復(fù)異常膠原蛋白的生成,增加角膜厚度并提高角膜透明度。此外,注入的細(xì)胞減少了炎癥細(xì)胞因子,減輕了排斥反應(yīng)[10]。Aghamollaei等[11]研究則進(jìn)一步證實(shí)了使用人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞的再細(xì)胞化人角膜透鏡的安全性。一項(xiàng)基于脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSC)的Ⅰ期臨床試驗(yàn)證明,使用自體ADSC對(duì)人角膜基質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞治療是安全有效的[12]。此外,另一項(xiàng)涉及11例晚期圓錐角膜病患者的臨床研究表明,無(wú)論是否使用脫細(xì)胞供體角膜基質(zhì)植片,ADSC移植后都能產(chǎn)生良好的療效。術(shù)后3 mo內(nèi),所有患者都完全恢復(fù)了角膜透明度[13]。但是要驗(yàn)證這種治療方法的有效性,還需要更多的參與者和更長(zhǎng)時(shí)間的隨訪。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSC)與角膜基質(zhì)細(xì)胞具有相同的神經(jīng)嵴譜系起源,并且與角膜基質(zhì)細(xì)胞具有相似的蛋白多糖分泌特征,將人類DPSC移植到小鼠角膜內(nèi),可導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白和角膜蛋白聚糖的表達(dá),并表現(xiàn)出與角膜基質(zhì)細(xì)胞相似的表型,同時(shí)保持角膜透明度和基質(zhì)體積[14]。盡管上述MSC都在治療角膜基質(zhì)疾病中展示出良好的前景,但是,最近的一些研究表明MSC不僅直接與癌細(xì)胞相互作用,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,還能調(diào)控腫瘤微環(huán)境的形成,因此應(yīng)謹(jǐn)慎在臨床治療中使用MSC[15]。

然而,受損組織中MSC的治療效果并不總是與MSC的直接分化相關(guān),因?yàn)槎喾N機(jī)制可能同時(shí)促成這種治療作用,例如干細(xì)胞在組織微環(huán)境中的旁分泌作用[16]。MSC可以通過(guò)產(chǎn)生包括生長(zhǎng)分化因子、外泌體和微囊泡在內(nèi)的可溶性因子來(lái)發(fā)揮治療作用,這些因子有助于調(diào)節(jié)組織愈合、炎癥反應(yīng)、血管生成和免疫反應(yīng)[17]。Jiang等[18]用MSC條件培養(yǎng)基處理原代培養(yǎng)的兔角膜細(xì)胞來(lái)檢測(cè)MSC的旁分泌因子對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞功能的影響。結(jié)果表明在培養(yǎng)基中檢測(cè)到多種促傷口愈合介質(zhì),包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-6和單核細(xì)胞趨化蛋白-1。這表明MSC通過(guò)旁分泌作用以改善細(xì)胞活力、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)形成,促進(jìn)角膜基質(zhì)再生。最近,Mittal等[19]報(bào)道了MSC可以通過(guò)分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)角膜同種異體免疫并促進(jìn)移植物存活。由此可見(jiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌在受損角膜基質(zhì)的修復(fù)與再生中同樣起著關(guān)鍵作用。

1.2角膜基質(zhì)干細(xì)胞角膜基質(zhì)干細(xì)胞(corneal stromal stem cells,CSSC)是位于角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells,LSC)基底層下特定干細(xì)胞小凹。LSC和CSSC都起源于神經(jīng)嵴來(lái)源的MSC,但二者在角膜中具有不同的特性和功能。LSC在角膜上皮再生中起著重要的作用,而CSSC則用于角膜基質(zhì)的再生[20]。CSSC可以表達(dá)Pax6和MSC標(biāo)記物(CD90、CD73),具有修復(fù)和再生透明基質(zhì)組織以及降低角膜炎癥反應(yīng)和減少瘢痕生成的能力[10]。相較于其他類型的干細(xì)胞,CSSC表現(xiàn)出更強(qiáng)的分化為基質(zhì)細(xì)胞的潛力,并在體外具有更高的抗炎特性[21]。Jhanji等[22]證明基質(zhì)內(nèi)注射外源性CSSC能夠減輕角膜混濁,并且在基質(zhì)內(nèi)注射基質(zhì)細(xì)胞沉積的膠原蛋白和硫酸角質(zhì)素蛋白多糖可以協(xié)助天然細(xì)胞外基質(zhì)重塑。Ghoubay等[23]建立了液氮誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)瘢痕小鼠模型。將小鼠或人類角膜基質(zhì)干細(xì)胞直接注射到損傷的角膜可改善角膜基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu),角膜混濁度降低、炎癥反應(yīng)減弱,進(jìn)一步證實(shí)了CSSC具有促進(jìn)透明基質(zhì)組織再生和逆轉(zhuǎn)瘢痕形成過(guò)程的能力。

2 組織工程誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)再生

組織工程是再生醫(yī)學(xué)中一個(gè)迅速興起的領(lǐng)域,通過(guò)創(chuàng)建替代組織來(lái)恢復(fù)、維持或改善組織功能,為許多疾病提供解決方案具有巨大潛力。目前,組織工程已被應(yīng)用于生成不同復(fù)雜程度的角膜組織等效物,其中的一些表現(xiàn)出與天然人類角膜的高水平仿生性,為治療角膜疾病提供了新的替代方案。

2.13D生物打印技術(shù)3D生物打印是一種制作生物級(jí)角膜的新興方法,它能夠制造出具有與天然角膜相似光學(xué)特性的半透明角膜基質(zhì)組織,同時(shí)保持植入基質(zhì)組織中細(xì)胞的表型[24]。目前,主要應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)的3D打印技術(shù)包括:基于VAT聚合、材料擠出和材料噴射的打印技術(shù)。生物打印能否成功取決于生物墨水的可印刷性和生物活性,目前,無(wú)細(xì)胞水凝膠或載細(xì)胞生物材料的生物墨水已經(jīng)被應(yīng)用在眼科領(lǐng)域[25]。Isaacson等[26]利用氣動(dòng)擠出式生物打印機(jī),以海藻酸鈉和由甲基丙烯酸鹽化的膠原蛋白為生物墨水,通過(guò)掃描患者眼部定制角膜的形狀,成功打印出人類眼角膜。在打印成型之后第1 d角膜基質(zhì)細(xì)胞保持了92%的活性,7 d后仍舊有83%的高細(xì)胞活性。Duarte Campos等[27]以按需滴墨的方式利用膠原水凝膠制造出與天然角膜基質(zhì)組織相似的角膜基質(zhì)等效物,并在體外培養(yǎng)7 d后保持其天然角膜細(xì)胞表型。甲基丙烯酸酯化明膠(methacrylate gelatin,GelMA)具有可調(diào)的理化性質(zhì)及良好的生物相容性,尤其與天然細(xì)胞外基質(zhì)的性質(zhì)高度相似,是3D打印中使用最廣泛的墨水之一。Mahdavi等[28]利用立體光刻3D生物打印,將GelMA和角膜基質(zhì)細(xì)胞混合用作生物墨水,打印出與人角膜基質(zhì)透明度和含水量相似的穹頂狀結(jié)構(gòu)。Ⅰ型膠原蛋白、硫酸角質(zhì)素、人基膜聚醣表達(dá)的上調(diào)表明了支架內(nèi)細(xì)胞的附著、生長(zhǎng)和整合。最近,He等[29]提出了用于角膜再生的仿生上皮/基質(zhì)雙層植入物的3D生物打印技術(shù)。將GelMA和長(zhǎng)鏈聚乙二醇二丙烯酸酯[poly (ethylene glycol) diacrylate,PEGDA]混合制成生物墨水以提高GelMA的機(jī)械性能。利用數(shù)字光處理技術(shù)打印的植入物由帶有兔角膜上皮細(xì)胞的上皮層和裝載兔脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的纖維基質(zhì)層組成。將這種載有雙層細(xì)胞的角膜支架應(yīng)用于兔角膜移植模型,結(jié)果顯示其可以有效地通過(guò)再上皮化和基質(zhì)再生促進(jìn)角膜再生,為角膜的多層再生提供了新的途徑。盡管3D生物打印技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的方面已經(jīng)取得了巨大成就,但在制造眼部組織和保存相關(guān)生物學(xué)功能方面的應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究,未來(lái)的發(fā)展必須要優(yōu)化技術(shù)和組件,以匹配人類角膜基質(zhì)的復(fù)雜性。

2.2原位成型水凝膠水凝膠具有透明度好、含水量高、滲透性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),特別是由膠原及其衍生物制成的水凝膠,具有良好的生物相容性和生物活性。目前,預(yù)成型水凝膠和原位成型水凝膠已被廣泛應(yīng)用于角膜再生。預(yù)成型水凝膠因需要精確的尺寸和機(jī)械強(qiáng)度來(lái)承受手術(shù)縫合,并且術(shù)后并發(fā)癥多(傷口滲漏、微生物殘留、高度散光、角膜新生血管和移植物排斥反應(yīng)等),正逐漸被原位成型水凝膠替代[30]。原位成型水凝膠具有膠前流動(dòng)性和組織黏附性的特點(diǎn),可以滲透到角膜缺損處后再凝膠化,以促進(jìn)角膜再上皮化和基質(zhì)再生。Shen等[31]通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性雙交聯(lián)過(guò)程開發(fā)了一種由豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)和甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸組成的復(fù)合水凝膠。該復(fù)合水凝膠不僅保留了豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的生物活性成分,而且具有與人角膜相似的透明度和力學(xué)性能。在兔角膜基質(zhì)缺損模型中,經(jīng)復(fù)合水凝膠處理的實(shí)驗(yàn)眼保持透明,并與基質(zhì)緊密黏連,加速了角膜上皮化和基質(zhì)再生。Li等[32]基于GelMA、F127DA、AF127和Ⅰ型膠原蛋白制備了一種光固化水凝膠。使用紫外線照射5 min后即可形成透明、高韌性和高生物黏附性能的水凝膠貼片,該貼片可在兔模型中再生深部角膜基質(zhì)缺損,并在4 wk內(nèi)整合到角膜組織中。具有生物活性的多交聯(lián)水凝膠可以在無(wú)需縫合的情況下快速修復(fù)角膜缺損和實(shí)現(xiàn)組織的再生,未來(lái)需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估長(zhǎng)期的傷口愈合特征,包括長(zhǎng)期的生物反應(yīng)和光學(xué)清晰度,以驗(yàn)證其長(zhǎng)期有效性和安全性。

2.3絲素蛋白絲素蛋白因具有良好的生物相容性、生物可吸收性、柔韌性和抗拉伸性等特點(diǎn),被看作是一種優(yōu)良的制作角膜支架的生物聚合物[33]。與不加入絲素蛋白相比,加入絲素蛋白組成的聚ε-己內(nèi)酯-絲素蛋白復(fù)合支架具有更高的透明度、親水性、細(xì)胞相容性和體外降解率[34]。利用絲素蛋白、京尼平交聯(lián)的多孔聚乙烯醇和納米羥基磷灰石制備成的復(fù)合水凝膠表現(xiàn)出良好的物理和生物特性。復(fù)合水凝膠在改善了水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)完整性的同時(shí),還保持了人角膜成纖維細(xì)胞的活性[35]。Sahi等[36]使用絲素蛋白和明膠制備出絲素蛋白-明膠復(fù)合支架。該復(fù)合支架具有良好的透明度、細(xì)胞生物相容性以及與天然角膜相當(dāng)?shù)臋C(jī)械穩(wěn)定性,并且支持小鼠和兔角膜成纖維細(xì)胞的增殖。利用靜電紡絲蛋白可將支架透明度提高到接近天然人類角膜的水平,加入明膠可以進(jìn)一步改善細(xì)胞材料的相互作用。Bhattacharjee等[37]利用不同比例的絲素蛋白和聚丙烯酰胺制備出半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,可在37 ℃下快速凝膠化,高孔隙率促進(jìn)角膜細(xì)胞在愈合過(guò)程中遷移,改善細(xì)胞黏附且沒(méi)有細(xì)胞毒性。絲素蛋白的加入增強(qiáng)了半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠中的細(xì)胞增殖,并增加了角膜細(xì)胞基因的表達(dá)。

3 基因治療誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)再生

基因治療是治療角膜疾病的一種有前途的方法。基因治療需要將載體和基因傳遞到角膜的目標(biāo)組織細(xì)胞中,替代或編輯有缺陷的基因,以預(yù)防或治療角膜疾病。將足量的治療基因引入相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞是基因治療的關(guān)鍵。目前,部分病毒和非病毒載體被應(yīng)用于角膜瘢痕化和新生血管的基因治療。

3.1病毒載體的基因治療目前角膜基因治療中常見(jiàn)的病毒載體包括腺病毒(adenovirus,AV)、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus,RV)、慢病毒(lentivirus,LV)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)。而針對(duì)角膜基因治療載體的研究主要集中在AAV載體上[38]。AAV載體可以感染角膜的三種主要細(xì)胞,不同的血清型具有獨(dú)特的細(xì)胞趨向性和傳導(dǎo)效率。使用酪氨酸突變的AAV載體,如AAV2、AAV8和AAV9,可進(jìn)一步提高其傳導(dǎo)和表達(dá)效率。AAV載體的優(yōu)點(diǎn)包括可以轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的組織細(xì)胞,不受靶細(xì)胞是否為分裂細(xì)胞所限,基因表達(dá)的時(shí)間長(zhǎng),可進(jìn)行指定部位的特異性整合,但其缺點(diǎn)是運(yùn)載的基因尺寸較小,高滴度生產(chǎn)所需要的技術(shù)較困難,人體對(duì)病毒的獲得性和先天免疫反應(yīng)會(huì)影響基因的表達(dá)和治療效果[39]。核心蛋白聚糖(decorin,Dcn)分別通過(guò)拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A發(fā)揮抗纖維化和抗血管生成分子的作用。Mohan等[40]使用局部AAV5-Dcn基因療法顯著緩解了模型兔眼的角膜基質(zhì)纖維化和新生血管形成,并且在為期6 mo的治療中證實(shí)了其安全性。分化抑制因子3(inhibitor of differentiation 3,ID3)基因是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,可在體外有效抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化。Gupta等[41]使用AAV5載體介導(dǎo)ID3基因來(lái)治療模型兔的角膜瘢痕。局部AAV5-ID3基因治療顯著抑制兔角膜基質(zhì)纖維化,降低了促纖維化基因mRNA的表達(dá)水平,包括α-平滑肌激動(dòng)蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ,并且局部AAV5-ID3遞送不會(huì)在兔眼中引起臨床相關(guān)的眼部癥狀或角膜細(xì)胞毒性。

3.2非病毒載體的基因治療納米顆粒(nanoparticle,NP)是指直徑在10-100 nm的微型顆粒,具有顆粒尺寸小、比表面積大、表面能高、表面原子所占比例大等特點(diǎn),可通過(guò)吞噬作用、胞飲作用、網(wǎng)格蛋白或細(xì)胞膜穴樣凹陷依賴或非依賴途徑等將大量的配體輸送到細(xì)胞中[42]。目前已有多種納米顆粒作為載體用于角膜藥物的輸送,如脂質(zhì)體、樹狀大分子、聚合物納米粒、非離子表面活性劑囊泡、納米混懸劑和水凝膠[43]。Gupta等[44]使用聚乙烯亞胺偶聯(lián)黃金納米顆粒,在體外人角膜和體內(nèi)兔角膜中低毒性遞送骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7+肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因能夠治療角膜基質(zhì)纖維化,并在長(zhǎng)達(dá)7 mo的治療期間,沒(méi)有產(chǎn)生眼部毒性。

其他非病毒基因載體治療還包括:基因槍,電穿孔,離子電滲療法,超聲波,顯微注射等。盡管這些物理方法可以遞送更大尺寸的治療基因并具有低免疫原性,但非特異性轉(zhuǎn)基因傳遞的隨機(jī)性和低轉(zhuǎn)染率限制了其更廣泛的應(yīng)用[39]。

4 總結(jié)與展望

目前已經(jīng)開發(fā)了眾多角膜基質(zhì)修復(fù)及再生的新方法。傳統(tǒng)的角膜移植依然被視為治療嚴(yán)重角膜疾病的有效方法,但始終受到角膜組織供體短缺和移植后免疫排斥反應(yīng)的限制。因此,需要新的方法來(lái)突破這些限制。細(xì)胞移植、干細(xì)胞治療、人工角膜、生物工程支架、3D生物打印等技術(shù)正在迅速發(fā)展。各種類型的角膜和非角膜干細(xì)胞可以分化為具有角膜基質(zhì)細(xì)胞特性的細(xì)胞,并分泌促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞再生的因子。雖然許多研究證實(shí)了干細(xì)胞在再生角膜表面方面的有效性,但干細(xì)胞系存在先天變異,且在治療角膜廣泛損傷方面不足,促使研究人員使用支架作為支撐結(jié)構(gòu)。天然或合成的生物材料與各種類型的干細(xì)胞相結(jié)合,可以再生受損的角膜。選擇合適的干細(xì)胞是角膜組織工程中的關(guān)鍵因素。支架的存在可以加強(qiáng)再生過(guò)程。但是,很難模擬角膜高度復(fù)雜的超微結(jié)構(gòu),既不能匹配正常角膜的力學(xué)性能,也不能重建局部的納米結(jié)構(gòu)組織,從而重建正常角膜的透明度和光學(xué)特性。因此,目前還沒(méi)有一個(gè)替代品能夠完全復(fù)制這種復(fù)雜性。部分干細(xì)胞治療的方法工序復(fù)雜、價(jià)格昂貴且涉及倫理問(wèn)題,不能被廣泛應(yīng)用于臨床治療。并且,在將這些細(xì)胞用于角膜修復(fù)之前,應(yīng)對(duì)其長(zhǎng)期安全性進(jìn)行評(píng)估,以確保不會(huì)出現(xiàn)排斥、感染和炎癥等不良反應(yīng)。目前與臨床最相關(guān)的方法是使用脫細(xì)胞的角膜基質(zhì),但仍然受限于供體角膜。基因療法雖然還在早期發(fā)展階段,但已經(jīng)可以成功地預(yù)防、治療和治愈角膜盲,具有很高的人類應(yīng)用潛力。新興的3D生物打印技術(shù),如雙光子聚合技術(shù)、激光輔助生物打印、熔絲制造成型技術(shù)等將推動(dòng)角膜再生技術(shù)的迅速發(fā)展。此外,了解患者傷口愈合和移植物排斥反應(yīng)的免疫細(xì)胞生物學(xué)可能對(duì)設(shè)計(jì)新的治療策略至關(guān)重要。揭示這些方法的機(jī)制將產(chǎn)生新的和有效的角膜再生治療方法,最終應(yīng)用于人類臨床治療角膜疾病。